JP2931623B2 - Ｌ‐フェニルアラニンの製造方法 - Google Patents
Ｌ‐フェニルアラニンの製造方法Info
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- JP2931623B2 JP2931623B2 JP2103003A JP10300390A JP2931623B2 JP 2931623 B2 JP2931623 B2 JP 2931623B2 JP 2103003 A JP2103003 A JP 2103003A JP 10300390 A JP10300390 A JP 10300390A JP 2931623 B2 JP2931623 B2 JP 2931623B2
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- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−フェニルアラニンアンモニア・リアーゼ
を用いて、桂皮酸とアンモニア供与体からＬ−フェニル
アラニンを製造する方法に関する。
を用いて、桂皮酸とアンモニア供与体からＬ−フェニル
アラニンを製造する方法に関する。
Ｌ−フェニルアラニンは人間の必須アミノ酸の一種で
あり、医薬品あるいは飼料に添加されるなどその用途は
非常に広い。また、Ｌ−フェニルアラニンはジペプチド
甘味料であるアスパルテームの製造原料として近年、そ
の需要は高まりつつあり産業上有用なものである。
あり、医薬品あるいは飼料に添加されるなどその用途は
非常に広い。また、Ｌ−フェニルアラニンはジペプチド
甘味料であるアスパルテームの製造原料として近年、そ
の需要は高まりつつあり産業上有用なものである。
従来、Ｌ−フェニルアラニンの該当技術分野での公知
の製造方法は、英国特許第1489468号公報、特公昭61−4
4474号公報、特開昭59−91890号公報、特開昭60−13389
3号公報、特開昭61−247395号公報、特開昭61−12297号
公報等に開示されている。
の製造方法は、英国特許第1489468号公報、特公昭61−4
4474号公報、特開昭59−91890号公報、特開昭60−13389
3号公報、特開昭61−247395号公報、特開昭61−12297号
公報等に開示されている。
これらの方法は、Ｌ−フェニルアラニンアンモニア・
リアーゼ（以下PALと略す）が触媒するＬ−フェニルア
ラニンと桂皮酸、アンモニアとの平衡反応における逆反
応を利用したものである。
リアーゼ（以下PALと略す）が触媒するＬ−フェニルア
ラニンと桂皮酸、アンモニアとの平衡反応における逆反
応を利用したものである。
桂皮酸からＬ−フェニルアラニンへの転換率を高める
ため、英国特許第1489468号公報においては過剰のアン
モニアの存在下で酵素反応を行うことにより、従来知ら
れていなかったPALによる桂皮酸からＬ−フェニルアラ
ニンへの生成を可能にした。
ため、英国特許第1489468号公報においては過剰のアン
モニアの存在下で酵素反応を行うことにより、従来知ら
れていなかったPALによる桂皮酸からＬ−フェニルアラ
ニンへの生成を可能にした。
さらに、特公昭61−44474号公報においては反応条件
として、アンモニア濃度が約３モル／以上、桂皮酸濃
度が約0.05〜0.2モル／である、より有利な反応方法
を教示している。
として、アンモニア濃度が約３モル／以上、桂皮酸濃
度が約0.05〜0.2モル／である、より有利な反応方法
を教示している。
しかし、該特許等には酵素の安定性についての記載は
ない。酵素の安定性に関しては、ホジンス（HODGINS）
らがアーカイブス・オブ・バイオケミストリ・アンド・
バイオフィジクス（ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIO
PHYSICS）（Vol.149 91−96 1972）において、ハロゲン
類がPALの酵素活性部位に結合することにより酵素活性
を阻害することを報告している。
ない。酵素の安定性に関しては、ホジンス（HODGINS）
らがアーカイブス・オブ・バイオケミストリ・アンド・
バイオフィジクス（ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIO
PHYSICS）（Vol.149 91−96 1972）において、ハロゲン
類がPALの酵素活性部位に結合することにより酵素活性
を阻害することを報告している。
これと同様のことが特開昭59−91890号公報に開示さ
れており、アンモニア供与体に非ハロゲンアンモニア供
与体を使用し実施することを開示している。該特許にお
いては非ハロゲンアンモニア供与体として好ましいもの
は硫酸アンモニウムであり、アンモニア濃度が１〜５モ
ル／で実施されるのが好ましいとしている。
れており、アンモニア供与体に非ハロゲンアンモニア供
与体を使用し実施することを開示している。該特許にお
いては非ハロゲンアンモニア供与体として好ましいもの
は硫酸アンモニウムであり、アンモニア濃度が１〜５モ
ル／で実施されるのが好ましいとしている。
同様に、特開昭60−133893号公報は炭酸アンモニウム
をアンモニア供与体として用いることで精製を容易に行
えることを開示している。
をアンモニア供与体として用いることで精製を容易に行
えることを開示している。
特開昭61−247395号公報では、反応の終期に反応温度
を下げることにより桂皮酸のＬ−フェニルアラニンへの
転換率を上げることができること、そして、その際の最
も好ましいアンモニウム塩として炭酸アンモニウムを用
い、反応条件は桂皮酸濃度が約0.01〜1.0モル／、好
ましくは0.1〜0.5モル／であり、アンモニア濃度は約
0.1〜10.0モル／、好ましくは1.0から8.0モル／で
あると教示している。
を下げることにより桂皮酸のＬ−フェニルアラニンへの
転換率を上げることができること、そして、その際の最
も好ましいアンモニウム塩として炭酸アンモニウムを用
い、反応条件は桂皮酸濃度が約0.01〜1.0モル／、好
ましくは0.1〜0.5モル／であり、アンモニア濃度は約
0.1〜10.0モル／、好ましくは1.0から8.0モル／で
あると教示している。
特開昭61−12297号公報では10モル／以上のアンモ
ニアと、該アンモニア量に対し0.05〜0.5当量の炭酸イ
オンからなる反応液を用い、0.05モル／以下の桂皮酸
濃度で反応する方法を示し、その中で炭酸アンモニウム
を用いることの利点として、PALの活性は炭酸アンモニ
ウムからなる反応液中では高アンモニア濃度の条件下で
も安定に持続されることを開示している。
ニアと、該アンモニア量に対し0.05〜0.5当量の炭酸イ
オンからなる反応液を用い、0.05モル／以下の桂皮酸
濃度で反応する方法を示し、その中で炭酸アンモニウム
を用いることの利点として、PALの活性は炭酸アンモニ
ウムからなる反応液中では高アンモニア濃度の条件下で
も安定に持続されることを開示している。
本発明者らは、アンモニア供与体として炭酸アンモニ
ウムを使用した反応についてさらに検討を重ねた結果、 該酵素を用いＬ−フェニルアラニンを生成する際に平
衡をＬ−フェニルアラニン側に大きく傾けるために高ア
ンモニア濃度が必要であり、炭酸アンモニウムを用いた
反応では、pH10.0、アンモニア濃度10モル／以上の条
件で行うことが好ましい。しかし、この反応液中ではPA
Lが塩析を起こし、酵素反応に寄与出来なくなる。（同
様に、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、蟻酸アン
モニウムをアンモニア供与体とした反応条件でもPALが
塩析を起こしてしまい酵素反応は進まない。） PALが塩析を起こさない５モル／以下のアンモニア
濃度での反応速度は、炭酸アンモニウムをアンモニア供
与体として用いると、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニ
ウム、蟻酸アンモニウム等をアンモニア供与体として用
いた場合に比べ極端に小さい。
ウムを使用した反応についてさらに検討を重ねた結果、 該酵素を用いＬ−フェニルアラニンを生成する際に平
衡をＬ−フェニルアラニン側に大きく傾けるために高ア
ンモニア濃度が必要であり、炭酸アンモニウムを用いた
反応では、pH10.0、アンモニア濃度10モル／以上の条
件で行うことが好ましい。しかし、この反応液中ではPA
Lが塩析を起こし、酵素反応に寄与出来なくなる。（同
様に、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、蟻酸アン
モニウムをアンモニア供与体とした反応条件でもPALが
塩析を起こしてしまい酵素反応は進まない。） PALが塩析を起こさない５モル／以下のアンモニア
濃度での反応速度は、炭酸アンモニウムをアンモニア供
与体として用いると、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニ
ウム、蟻酸アンモニウム等をアンモニア供与体として用
いた場合に比べ極端に小さい。
という反応上の問題点を見いだした。
この炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムから成る
反応液中での反応において、反応速度が遅く、PALの塩
析が起こることは反応上の重要な欠点である。
反応液中での反応において、反応速度が遅く、PALの塩
析が起こることは反応上の重要な欠点である。
前述したこれらの問題点について改良すべく鋭意検討
した結果、蟻酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の低
級カルボン酸のアンモニウム塩と炭酸アンモニウム及び
水酸化アンモニウムからなる反応液中で反応を行うこと
により、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからな
る反応液中での反応に比べ反応速度を有意に上昇しうる
こと、またこれらを使用することによりpH10.0〜10.6、
アンモニア濃度10モル／以上であってもPALの塩析が
起こらないことを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。
した結果、蟻酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の低
級カルボン酸のアンモニウム塩と炭酸アンモニウム及び
水酸化アンモニウムからなる反応液中で反応を行うこと
により、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからな
る反応液中での反応に比べ反応速度を有意に上昇しうる
こと、またこれらを使用することによりpH10.0〜10.6、
アンモニア濃度10モル／以上であってもPALの塩析が
起こらないことを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。
即ち、本発明は、Ｌ−フェニルアラニンアンモニア・
リアーゼ存在下に、桂皮酸とアンモニア供与体からＬ−
フェニルアラニンを酵素的に生成させるに際して、アン
モニア供与体が低級カルボン酸のアンモニウム塩、炭酸
アンモニウム塩及び水酸化アンモニウムから成るＬ−フ
ェニルアラニンの製造方法である。
リアーゼ存在下に、桂皮酸とアンモニア供与体からＬ−
フェニルアラニンを酵素的に生成させるに際して、アン
モニア供与体が低級カルボン酸のアンモニウム塩、炭酸
アンモニウム塩及び水酸化アンモニウムから成るＬ−フ
ェニルアラニンの製造方法である。
本発明の方法によれば高アンモニア濃度に於いてもPA
Lの塩析が起こらない状態で反応を行うことができる。
このことは、反応に非常に有利な条件を与え、いままで
知られている炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムと
からなる反応液中での反応よりも更に良好な反応が実施
できる。
Lの塩析が起こらない状態で反応を行うことができる。
このことは、反応に非常に有利な条件を与え、いままで
知られている炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムと
からなる反応液中での反応よりも更に良好な反応が実施
できる。
これらは文献未載の効果であり、また従来の知見から
は容易に推測しえない。
は容易に推測しえない。
本発明において使用するPALは、桂皮酸とアンモニア
供与体からＬ−フェニルアラニンを生成せしめる酵素で
あり、ロドスポリジウム属などの酵母、カビ等の微生物
のほかに、ジャガイモ、パセリ等の植物にも分布してい
ることが知られており、これらの生物を直接利用する
か、もしくは、これらの生物からPALの構造遺伝子を取
り出し遺伝子操作により大腸菌などの微生物を該酵素生
産能を有する形質転換体とし利用することができる。更
に、PAL生産能を有する微生物の培養液・該培養液から
遠心分離等により得られる菌体、または該菌体の処理物
（例えば、洗浄菌体、固定化菌体、菌体破砕物、菌体の
自己消化物、菌体の超音波処理物、凍結融解物）等を用
いることができる。本発明に係る反応方法は、例えば上
記微生物の培養液、該反応液から遠心分離等により得ら
れる菌体、あるいは該菌体処理物を用いて行う。
供与体からＬ−フェニルアラニンを生成せしめる酵素で
あり、ロドスポリジウム属などの酵母、カビ等の微生物
のほかに、ジャガイモ、パセリ等の植物にも分布してい
ることが知られており、これらの生物を直接利用する
か、もしくは、これらの生物からPALの構造遺伝子を取
り出し遺伝子操作により大腸菌などの微生物を該酵素生
産能を有する形質転換体とし利用することができる。更
に、PAL生産能を有する微生物の培養液・該培養液から
遠心分離等により得られる菌体、または該菌体の処理物
（例えば、洗浄菌体、固定化菌体、菌体破砕物、菌体の
自己消化物、菌体の超音波処理物、凍結融解物）等を用
いることができる。本発明に係る反応方法は、例えば上
記微生物の培養液、該反応液から遠心分離等により得ら
れる菌体、あるいは該菌体処理物を用いて行う。
反応液を調製するために用いる低級カルボン酸のアン
モニウム塩としては、例えば、蟻酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、プロピオン酸アンモニウム、酪酸アンモ
ニウム等が挙げられる。
モニウム塩としては、例えば、蟻酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、プロピオン酸アンモニウム、酪酸アンモ
ニウム等が挙げられる。
本発明に係る反応に用いる反応液の最も容易な調製法
は、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる液
と、低級カルボン酸のアンモニウム塩と水酸化アンモニ
ウムからなる液を、それぞれ同じpH、アンモニア濃度に
調製し混合する方法である。詳しくは、炭酸アンモニウ
ムを水あるいはアンモニア水に溶解し、さらにアンモニ
ア水を加えるか、あるいは必要に応じてアンモニアガス
を吹き込みpHを調整する。その液のアンモニア濃度を測
定し所望の濃度に水で希釈することにより炭酸アンモニ
ウムと水酸化アンモニウムからなる液を調整する。ま
た、低級カルボン酸のアンモニウム塩を水あるいはアン
モニア水に溶解し、さらにアンモニア水を加えるか、あ
るいは必要に応じてアンモニアガスを吹き込みpHを調整
する。そして、その液のアンモニア濃度を測定し、所望
の濃度に水で希釈することにより、低級カルボン酸のア
ンモニウム塩と水酸化アンモニウムからなる液を調整す
る。このようにして得られた両液を好ましい混合比で混
合することにより反応液を得る。混合により得られた反
応液のpH、アンモニア濃度は混合前と全く変わらない。
は、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる液
と、低級カルボン酸のアンモニウム塩と水酸化アンモニ
ウムからなる液を、それぞれ同じpH、アンモニア濃度に
調製し混合する方法である。詳しくは、炭酸アンモニウ
ムを水あるいはアンモニア水に溶解し、さらにアンモニ
ア水を加えるか、あるいは必要に応じてアンモニアガス
を吹き込みpHを調整する。その液のアンモニア濃度を測
定し所望の濃度に水で希釈することにより炭酸アンモニ
ウムと水酸化アンモニウムからなる液を調整する。ま
た、低級カルボン酸のアンモニウム塩を水あるいはアン
モニア水に溶解し、さらにアンモニア水を加えるか、あ
るいは必要に応じてアンモニアガスを吹き込みpHを調整
する。そして、その液のアンモニア濃度を測定し、所望
の濃度に水で希釈することにより、低級カルボン酸のア
ンモニウム塩と水酸化アンモニウムからなる液を調整す
る。このようにして得られた両液を好ましい混合比で混
合することにより反応液を得る。混合により得られた反
応液のpH、アンモニア濃度は混合前と全く変わらない。
他の調整法、例えば炭酸アンモニウムと水酸化アンモ
ニウムからなる液に低級カルボン酸のアンモニウム塩を
添加しながらpHの調整をする方法、低級カルボン酸の塩
と水酸化アンモニウムからなる液に炭酸アンモニウムを
添加しながらpHを調整する方法等では、炭酸アンモニウ
ム、低級カルボン酸のアンモニウム塩及び水酸化アンモ
ニウムからなる任意のpH、アンモニア濃度の反応液を調
整することは煩雑、困難であり、実施上好ましくない。
前述した方法により反応液を調整する場合においては、
全反応液量に対しての低級カルボン酸のアンモニウム塩
と水酸化アンモニウムからなる液の割合（v/v）が５〜9
0％、好ましくは50〜80％で反応速度が上昇する。５％
以下では炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからな
る反応液中と同じ反応速度しか得られず、また90％以上
では反応速度は著しく低下する。
ニウムからなる液に低級カルボン酸のアンモニウム塩を
添加しながらpHの調整をする方法、低級カルボン酸の塩
と水酸化アンモニウムからなる液に炭酸アンモニウムを
添加しながらpHを調整する方法等では、炭酸アンモニウ
ム、低級カルボン酸のアンモニウム塩及び水酸化アンモ
ニウムからなる任意のpH、アンモニア濃度の反応液を調
整することは煩雑、困難であり、実施上好ましくない。
前述した方法により反応液を調整する場合においては、
全反応液量に対しての低級カルボン酸のアンモニウム塩
と水酸化アンモニウムからなる液の割合（v/v）が５〜9
0％、好ましくは50〜80％で反応速度が上昇する。５％
以下では炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからな
る反応液中と同じ反応速度しか得られず、また90％以上
では反応速度は著しく低下する。
反応液のアンモニア濃度は５〜12モル／、好ましく
は10〜12モル／で行う。高アンモニア濃度は平衡をＬ
−フェニルアラニン側に傾けるために有利である。
は10〜12モル／で行う。高アンモニア濃度は平衡をＬ
−フェニルアラニン側に傾けるために有利である。
反応温度は10〜40℃、好ましくは25〜35℃で行う。10
℃以下では反応速度が遅く、40℃以上ではPALの酵素活
性が低下する。
℃以下では反応速度が遅く、40℃以上ではPALの酵素活
性が低下する。
pHは9.6〜11.0、好ましくは10.0〜10.6で行う。
反応に用いる桂皮酸は一般に工業的に製造されるもの
を用いることができる。
を用いることができる。
反応液からのＬ−フェニルアラニンの精製法は、 反応液を遠心分離することにより菌体を除去し、 その反応液を加熱して過剰に存在するアンモニアを除
去し、 さらに、酸を加えpHを酸性にし、その液を遠心、ある
いは濾過することにより残存する桂皮酸を除去し、 その液をイオン交換樹脂に通液し、Ｌ−フェニルアラ
ニンを吸着・溶離させ、 溶離液を濃縮し、Ｌ−フェニルアラニンの等電点（5.
5）にpHを調製し、析出したＬ−フェニルアラニンを濾
過等により回収する。
去し、 さらに、酸を加えpHを酸性にし、その液を遠心、ある
いは濾過することにより残存する桂皮酸を除去し、 その液をイオン交換樹脂に通液し、Ｌ−フェニルアラ
ニンを吸着・溶離させ、 溶離液を濃縮し、Ｌ−フェニルアラニンの等電点（5.
5）にpHを調製し、析出したＬ−フェニルアラニンを濾
過等により回収する。
などの方法を組み合わせて容易に行うことができる。
本発明により、PALが塩析しない有利な反応条件下で
の、短時間での反応が可能となり工業的に非常に有利な
条件を寄与するものである。
の、短時間での反応が可能となり工業的に非常に有利な
条件を寄与するものである。
以下、実施例、比較例を挙げて本発明方法についてさ
らに具体的に説明する。しかし、具体的な例として示す
ものであり発明の範囲を限定するものではない。
らに具体的に説明する。しかし、具体的な例として示す
ものであり発明の範囲を限定するものではない。
実施例においての桂皮酸またはＬ−フェニルアラニン
の定量は、紫外吸収分光光度計を検出器に設置した液体
クロマトグラフィー法により行った。検出波長は223nm
で行い、カラムは日本分光（株）のFINEPAK SILC18を用
いて行った。反応液中の総アンモニア濃度の測定は水蒸
気蒸留−逆滴定法により行った。
の定量は、紫外吸収分光光度計を検出器に設置した液体
クロマトグラフィー法により行った。検出波長は223nm
で行い、カラムは日本分光（株）のFINEPAK SILC18を用
いて行った。反応液中の総アンモニア濃度の測定は水蒸
気蒸留−逆滴定法により行った。
実施例１（混合反応液における反応初速度） 炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる反応
液と、蟻酸アンモニウムあるいは酢酸アンモニウムと水
酸化アンモニウムからなる反応液から混合比（v/v）を
変えて、第１表に示すような構成比とした混合反応液を
作成した。
液と、蟻酸アンモニウムあるいは酢酸アンモニウムと水
酸化アンモニウムからなる反応液から混合比（v/v）を
変えて、第１表に示すような構成比とした混合反応液を
作成した。
混合反応液50gにPAL産生菌体懸濁液（100g乾燥菌体／
）5mlを加え、30℃で１時間振盪撹拌し、さらにその
液に桂皮酸0.37gを加え反応を開始した。その90分後の
生成したＬ−フェニルアラニン濃度を測定した。生成し
たＬ−フェニルアラニンの生成量から反応速度を求め、
炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムから成る反応液
における速度を100％とした比を第１表に示した。
）5mlを加え、30℃で１時間振盪撹拌し、さらにその
液に桂皮酸0.37gを加え反応を開始した。その90分後の
生成したＬ−フェニルアラニン濃度を測定した。生成し
たＬ−フェニルアラニンの生成量から反応速度を求め、
炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムから成る反応液
における速度を100％とした比を第１表に示した。
炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる反応
液中の反応速度に比べ、混合反応中では有意に反応速度
が高いことを示している。
液中の反応速度に比べ、混合反応中では有意に反応速度
が高いことを示している。
実施例２（混合反応液における塩析） PAL産生菌体を50g/にまで水で希釈、懸濁させ、そ
の懸濁液をフレンチプレス（SLM Instruments,Inc製）
（破砕条件:800bar）に給液して菌体を破砕し、破砕液
を10000gで30分遠心分離した。その上清液に硫酸アンモ
ニウムを28％飽和まで加え、再度遠心分離を行った。そ
の上清液に更に37％飽和にまで硫酸アンモニウムを加
え、その際に塩析した沈澱を遠心分離により回収し、そ
の分画成分を粗酵素液として用いた。以上の操作はすべ
て10℃以下で実施した。粗酵素液20mlを分画分子量1000
0の透析チューブにつめ、第２表に示す組成の反応液（2
00ml）にひたし、20℃で60分振盪撹拌する。所定時間処
理後、チューブ中の酵素液を取り出し、その酵素液を遠
心分離し上清中の活性を測定した。活性の測定方法はト
リス塩酸緩衝液（100ミリモル／、pH8.8）0.5mlに、
水0.99ml、Ｌ−フェニルアラニン水溶液（100ミリモル
／）0.5mlを加え、さらに30℃で５分間プレインキュ
ベイションする。そして酵素液10μを加えて反応を開
始し、30℃で10分間振盪撹拌する。その反応液中の桂皮
酸の濃度を液体クロマトグラフィーで測定する。生成し
た桂皮酸の量から活性を求め、塩析前の酵素液を用いた
場合の活性を100％としたときの比を第２表に示した。
の懸濁液をフレンチプレス（SLM Instruments,Inc製）
（破砕条件:800bar）に給液して菌体を破砕し、破砕液
を10000gで30分遠心分離した。その上清液に硫酸アンモ
ニウムを28％飽和まで加え、再度遠心分離を行った。そ
の上清液に更に37％飽和にまで硫酸アンモニウムを加
え、その際に塩析した沈澱を遠心分離により回収し、そ
の分画成分を粗酵素液として用いた。以上の操作はすべ
て10℃以下で実施した。粗酵素液20mlを分画分子量1000
0の透析チューブにつめ、第２表に示す組成の反応液（2
00ml）にひたし、20℃で60分振盪撹拌する。所定時間処
理後、チューブ中の酵素液を取り出し、その酵素液を遠
心分離し上清中の活性を測定した。活性の測定方法はト
リス塩酸緩衝液（100ミリモル／、pH8.8）0.5mlに、
水0.99ml、Ｌ−フェニルアラニン水溶液（100ミリモル
／）0.5mlを加え、さらに30℃で５分間プレインキュ
ベイションする。そして酵素液10μを加えて反応を開
始し、30℃で10分間振盪撹拌する。その反応液中の桂皮
酸の濃度を液体クロマトグラフィーで測定する。生成し
た桂皮酸の量から活性を求め、塩析前の酵素液を用いた
場合の活性を100％としたときの比を第２表に示した。
比較例１（遠心上清中のPALの塩析） 用いる反応液を第２表に示すものに変更した以外は実
施例２と同様の操作を行った。結果を第２表に示す。さ
らに、遠心した沈澱物中のPAL活性の有無は、沈澱を水
に懸濁させ、その懸濁液を酵素液として実施例１で述べ
た活性測定の方法により測定した。
施例２と同様の操作を行った。結果を第２表に示す。さ
らに、遠心した沈澱物中のPAL活性の有無は、沈澱を水
に懸濁させ、その懸濁液を酵素液として実施例１で述べ
た活性測定の方法により測定した。
第２表は炭酸アンモニウム−蟻酸アンモニウム−水酸
化アンモニアからなる反応液あるいは、炭酸アンモニウ
ム−酢酸アンモニウム−水酸化アンモニウムからなる反
応液中では上清液中の活性の低下は見られず、このよう
な反応液中では塩析が起こっていないことを示してい
る。
化アンモニアからなる反応液あるいは、炭酸アンモニウ
ム−酢酸アンモニウム−水酸化アンモニウムからなる反
応液中では上清液中の活性の低下は見られず、このよう
な反応液中では塩析が起こっていないことを示してい
る。
硫酸アンモニウム−アンモニア反応液、酢酸アンモニ
ウム−アンモニア反応液、蟻酸アンモニウム−アンモニ
ア反応液ではアンモニア濃度が高くなるにつれ酵素液を
遠心した上清液中の活性は減少した。このことは高アン
モニア濃度の反応液中ではPALの塩析が起こっているこ
とを示している。また、５モル／のアンモニウム濃度
中の酵素液の遠心上清液中の活性は元の酵素液中の活性
と変わらないことから、これらの反応液の５モル／以
下のアンモニウム濃度においてはPALの塩析が起こって
いない。また、塩析した沈澱を活性測定に用いるトリス
塩酸緩衝液に再透析すると有意な活性が認められた。こ
のことは、PALが塩析していることをさらに明確にし
た。
ウム−アンモニア反応液、蟻酸アンモニウム−アンモニ
ア反応液ではアンモニア濃度が高くなるにつれ酵素液を
遠心した上清液中の活性は減少した。このことは高アン
モニア濃度の反応液中ではPALの塩析が起こっているこ
とを示している。また、５モル／のアンモニウム濃度
中の酵素液の遠心上清液中の活性は元の酵素液中の活性
と変わらないことから、これらの反応液の５モル／以
下のアンモニウム濃度においてはPALの塩析が起こって
いない。また、塩析した沈澱を活性測定に用いるトリス
塩酸緩衝液に再透析すると有意な活性が認められた。こ
のことは、PALが塩析していることをさらに明確にし
た。
また、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからな
る反応液中においても上清液中の活性の減少が見られ、
また沈澱物を活性測定に用いるトリス塩酸緩衝液に再透
析するとその液中にも有意な活性を認めた。このこと
は、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる反
応液中においても同様にPALの塩析がおこり反応に不利
な状態にあることを示している。
る反応液中においても上清液中の活性の減少が見られ、
また沈澱物を活性測定に用いるトリス塩酸緩衝液に再透
析するとその液中にも有意な活性を認めた。このこと
は、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる反
応液中においても同様にPALの塩析がおこり反応に不利
な状態にあることを示している。
比較例２（各反応液における反応速度） PAL産生菌体を含む懸濁液（100g乾燥菌体／）5ml
に、第３、第４表に示す各アンモニア濃度に調整したア
ンモニア反応液50gを加え、30℃で１時間振盪撹拌を行
い菌体を均一に懸濁させた後、桂皮酸0.37gを加えるこ
とにより反応を開始した。60分後の反応液中のＬ−フェ
ニルアラニン生成濃度を液体クロマトグラフィーで分析
した。
に、第３、第４表に示す各アンモニア濃度に調整したア
ンモニア反応液50gを加え、30℃で１時間振盪撹拌を行
い菌体を均一に懸濁させた後、桂皮酸0.37gを加えるこ
とにより反応を開始した。60分後の反応液中のＬ−フェ
ニルアラニン生成濃度を液体クロマトグラフィーで分析
した。
結果を第３表、第４表に示す。
第３表はアンモニア濃度10モル／の蟻酸アンモニウ
ム−アンモニア反応液、酢酸アンモニウム−アンモニア
反応液、硫酸アンモニウム−アンモニア反応液中では反
応が進まないことを示している。
ム−アンモニア反応液、酢酸アンモニウム−アンモニア
反応液、硫酸アンモニウム−アンモニア反応液中では反
応が進まないことを示している。
第４表はアンモニア濃度５モル／の炭酸アンモニウ
ム−アンモニア反応液中では、アンモニア濃度５モル／
の酢酸アンモニウム−アンモニア反応液、硫酸アンモ
ニウム−アンモニア反応液中に比べて反応速度が著しく
少ないことを示している。
ム−アンモニア反応液中では、アンモニア濃度５モル／
の酢酸アンモニウム−アンモニア反応液、硫酸アンモ
ニウム−アンモニア反応液中に比べて反応速度が著しく
少ないことを示している。
Claims (1)
- 【請求項１】Ｌ−フェニルアラニンアンモニア・リアー
ゼ存在下に、桂皮酸とアンモニア供与体からＬ−フェニ
ルアラニンを酵素的に生成させるに際して、アンモニア
供与体が低級カルボン酸のアンモニウム塩、炭酸アンモ
ニウム塩及び水酸化アンモニウムから成ることを特徴と
するＬ−フェニルアラニンの製造方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2103003A JP2931623B2 (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | Ｌ‐フェニルアラニンの製造方法 |
| EP19910106275 EP0452948B1 (en) | 1990-04-20 | 1991-04-19 | Production process for L-phenylalanine |
| DE1991621003 DE69121003T2 (de) | 1990-04-20 | 1991-04-19 | Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2103003A JP2931623B2 (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | Ｌ‐フェニルアラニンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH044889A JPH044889A (ja) | 1992-01-09 |
| JP2931623B2 true JP2931623B2 (ja) | 1999-08-09 |
Family
ID=14342491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2103003A Expired - Fee Related JP2931623B2 (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | Ｌ‐フェニルアラニンの製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0452948B1 (ja) |
| JP (1) | JP2931623B2 (ja) |
| DE (1) | DE69121003T2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1206435A (en) * | 1982-10-01 | 1986-06-24 | Wayne E. Swann | Method for the production of l-phenylalanine through the reuse of phenylalanine ammonia lyase |
| US4584269A (en) * | 1983-10-31 | 1986-04-22 | Genex Corporation | Method for stabilizing the enzymatic activity of phenylalanine ammonia lyase during L-phenylalanine production |
-
1990
- 1990-04-20 JP JP2103003A patent/JP2931623B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-04-19 EP EP19910106275 patent/EP0452948B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-19 DE DE1991621003 patent/DE69121003T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69121003T2 (de) | 1997-01-30 |
| EP0452948A3 (en) | 1991-11-27 |
| JPH044889A (ja) | 1992-01-09 |
| EP0452948A2 (en) | 1991-10-23 |
| DE69121003D1 (de) | 1996-08-29 |
| EP0452948B1 (en) | 1996-07-24 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |