JP2717227B2 - 固定化ウレアーゼとそれを用いた酒類の製造方法 - Google Patents
固定化ウレアーゼとそれを用いた酒類の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、酒類中に含有される尿素を除去し、改質さ
れた酒類を製造するために有用な固定化ウレアーゼおよ
びそれを用いる酒類の製造方法に関する。
れた酒類を製造するために有用な固定化ウレアーゼおよ
びそれを用いる酒類の製造方法に関する。
「従来の技術」 清酒、ビール、老酒、ブドウ酒などの酒類中には尿素
が含まれていることが知られている。酒類中の尿素は、
酒類の醗酵に関与する酵母あるいはカビの尿素サイクル
により生成され、例えば清酒中には通常、２〜80ppmの
尿素が含まれ、かす歩合を減らし、酒類の収得歩合を高
めるためのもろみを長期間醗酵せしめた場合には100ppm
以上に増加することもある。
が含まれていることが知られている。酒類中の尿素は、
酒類の醗酵に関与する酵母あるいはカビの尿素サイクル
により生成され、例えば清酒中には通常、２〜80ppmの
尿素が含まれ、かす歩合を減らし、酒類の収得歩合を高
めるためのもろみを長期間醗酵せしめた場合には100ppm
以上に増加することもある。
尿素含量が多い酒類は苦味を与え、加熱時や長期貯蔵
により着色し易く、香味の劣化を引き起こす（特公昭56
−20830号公報）ばかりでなく、尿素は酒類中のエチル
アルコールとの化学反応により発癌性や変異原性を示す
とされるカルバミン酸エチルを生成することが知られて
いる（日本醸造協会誌、83（１）,57−63,69−73,198
8）。そこで、近年尿素を含有しないかまたは尿素を低
減せしめた酒類の製造方法が求められている。
により着色し易く、香味の劣化を引き起こす（特公昭56
−20830号公報）ばかりでなく、尿素は酒類中のエチル
アルコールとの化学反応により発癌性や変異原性を示す
とされるカルバミン酸エチルを生成することが知られて
いる（日本醸造協会誌、83（１）,57−63,69−73,198
8）。そこで、近年尿素を含有しないかまたは尿素を低
減せしめた酒類の製造方法が求められている。
尿素の含量を低減する方法としては、使用する原料に
おいて尿素の含量の少ないもの、尿素生産能の低い酵
母、カビまたはその処理法等を改良する方法なども考え
られているが、未だ充分な方法ではない。現在採られて
いる方法の一つにウレアーゼを用い生成した尿素を分解
除去するものがある。即ち、尿素を含む酒類にウレアー
ゼを直接添加して、充分反応せしめた後、オリ下げを
し、残存したウレアーゼを採り除くことがバッチプロセ
スで行われている。上記の方法は有効な方法ではあるが
ウレアーゼが残存してしまうこと、オリ下げ等の操
作が必ず必要であり煩雑であること、ウレアーゼの回
収が困難であるため実際上ウレアーゼは使い捨てとなり
不経済であること、尿素の分解処理時間が長い（通
常、７〜14日）等々の酒類の品質への悪影響、経費の上
昇、処理時間の長期化等の欠点が存在した。
おいて尿素の含量の少ないもの、尿素生産能の低い酵
母、カビまたはその処理法等を改良する方法なども考え
られているが、未だ充分な方法ではない。現在採られて
いる方法の一つにウレアーゼを用い生成した尿素を分解
除去するものがある。即ち、尿素を含む酒類にウレアー
ゼを直接添加して、充分反応せしめた後、オリ下げを
し、残存したウレアーゼを採り除くことがバッチプロセ
スで行われている。上記の方法は有効な方法ではあるが
ウレアーゼが残存してしまうこと、オリ下げ等の操
作が必ず必要であり煩雑であること、ウレアーゼの回
収が困難であるため実際上ウレアーゼは使い捨てとなり
不経済であること、尿素の分解処理時間が長い（通
常、７〜14日）等々の酒類の品質への悪影響、経費の上
昇、処理時間の長期化等の欠点が存在した。
「発明が解決しようとする課題」 上記問題点を解決するために、ウレアーゼを担体に固
定化して用いることが考えられる。例えばキチンを担体
として用いグルタルアルデヒド処理後ウレアーゼを添加
し、反応せしめて得た固定化ウレアーゼを作成した例が
知られている（Biotechnology and Bioengineering,XX
I,Pp.133−1343）1979））が、この固定化ウレアーゼを
酒類の処理に用いると、ウレアーゼがリークしてしまっ
たり、処理後の尿素含量が充分減少せず未だ不充分で実
用に耐えるものではなかった。そこで他の固定化担体が
求められている。
定化して用いることが考えられる。例えばキチンを担体
として用いグルタルアルデヒド処理後ウレアーゼを添加
し、反応せしめて得た固定化ウレアーゼを作成した例が
知られている（Biotechnology and Bioengineering,XX
I,Pp.133−1343）1979））が、この固定化ウレアーゼを
酒類の処理に用いると、ウレアーゼがリークしてしまっ
たり、処理後の尿素含量が充分減少せず未だ不充分で実
用に耐えるものではなかった。そこで他の固定化担体が
求められている。
「課題を解決するための手段」 本発明者らは、上記課題について鋭意研究した結果、
固定化担体として、キトサンのアミノ基の一部若しくは
全部が、 および／またはNH2−（CH2）ｎ−NH−CO−NH−基（式
中、ｎは２〜10を示す）と置換せしめたキトサン誘導体
を用い、共有結合法あるいは吸着架橋法により得られた
固定化ウレアーゼが極めて良好に酒類中の尿素を処理す
る能力を有していることを見出した。
固定化担体として、キトサンのアミノ基の一部若しくは
全部が、 および／またはNH2−（CH2）ｎ−NH−CO−NH−基（式
中、ｎは２〜10を示す）と置換せしめたキトサン誘導体
を用い、共有結合法あるいは吸着架橋法により得られた
固定化ウレアーゼが極めて良好に酒類中の尿素を処理す
る能力を有していることを見出した。
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、共
有結合法あるいは吸着架橋法による固定化ウレアーゼに
おいて、固定化担体がキトサンのアミノ基の一部若しく
は全部が、 および／またはNH2−（CH2）ｎ−NH−CO−NH−基（式
中、ｎは２〜10を示す）と置換せしめたキトサン誘導体
であることを特徴とする固定化ウレアーゼ、および酒類
の製造過程において、上記の固定化ウレアーゼを使用す
ることを特徴とする改質された酒類の製造方法について
である。
有結合法あるいは吸着架橋法による固定化ウレアーゼに
おいて、固定化担体がキトサンのアミノ基の一部若しく
は全部が、 および／またはNH2−（CH2）ｎ−NH−CO−NH−基（式
中、ｎは２〜10を示す）と置換せしめたキトサン誘導体
であることを特徴とする固定化ウレアーゼ、および酒類
の製造過程において、上記の固定化ウレアーゼを使用す
ることを特徴とする改質された酒類の製造方法について
である。
先ず、本発明に用いられるキトサン誘導体は、例えば
キチンをアルカリ処理して得られたキトサンに、 および／または、CO＝Ｎ−（CH2）ｎ−Ｎ＝CO（式中、
ｎは２〜10を示す）などのジイソシアナートを反応せし
めた後水性溶媒中で未反応のイソシアナート基をアミノ
基となすことにより得られる。また、ジイソシアナート
としては例えば入手の容易なｎ＝６に当たるヘキサメチ
レンジイソシアナート（和光純薬社製）などの市販品が
利用しうる。また、上述の代わりに、キトサン誘導体と
して、例えばキトパールBC−3000またはBCW−3000シリ
ーズ（富士紡績社製；商品名； を含むもの）およびBC−3500またはBCW−3500シリーズ
（富士紡績社製；商品名;NH2−（CH2）ｎ−NH−CO−NH
−基を含むもの）などの市販品を用いることが簡便であ
る。
キチンをアルカリ処理して得られたキトサンに、 および／または、CO＝Ｎ−（CH2）ｎ−Ｎ＝CO（式中、
ｎは２〜10を示す）などのジイソシアナートを反応せし
めた後水性溶媒中で未反応のイソシアナート基をアミノ
基となすことにより得られる。また、ジイソシアナート
としては例えば入手の容易なｎ＝６に当たるヘキサメチ
レンジイソシアナート（和光純薬社製）などの市販品が
利用しうる。また、上述の代わりに、キトサン誘導体と
して、例えばキトパールBC−3000またはBCW−3000シリ
ーズ（富士紡績社製；商品名； を含むもの）およびBC−3500またはBCW−3500シリーズ
（富士紡績社製；商品名;NH2−（CH2）ｎ−NH−CO−NH
−基を含むもの）などの市販品を用いることが簡便であ
る。
本発明に用いるウレアーゼは、特に限定されるもので
はないが、入手が容易なことより、微生物由来のウレア
ーゼが好ましい。
はないが、入手が容易なことより、微生物由来のウレア
ーゼが好ましい。
また、処理対象の酒類をより効率的に処理するに当た
り、処理する酒類のpHにウレアーゼの至適pHや安定pHを
適合せしめることが好ましく、例えば清酒のような酸性
液の処理においては、酸性ウレアーゼが好ましい。酸性
ウレアーゼとしては、ナガプシン（長瀬産業社製；商品
名）、タケメイト−AU（武田薬品社製；商品名）あるい
は東洋醸造社製ウレアーゼ（東洋醸造社酵素パンフレッ
トＴ−46:Lactobacillus fermentum B−1112株由来）な
どが例示される。
り、処理する酒類のpHにウレアーゼの至適pHや安定pHを
適合せしめることが好ましく、例えば清酒のような酸性
液の処理においては、酸性ウレアーゼが好ましい。酸性
ウレアーゼとしては、ナガプシン（長瀬産業社製；商品
名）、タケメイト−AU（武田薬品社製；商品名）あるい
は東洋醸造社製ウレアーゼ（東洋醸造社酵素パンフレッ
トＴ−46:Lactobacillus fermentum B−1112株由来）な
どが例示される。
さらに耐アルコール性を有するものや、安全性面から
酒類中に対し使用しうる許可がされているものがより好
ましい。
酒類中に対し使用しうる許可がされているものがより好
ましい。
ウレアーゼを固定化するに当たっては、前述のキトサ
ン誘導体とウレアーゼとを共有結合法あるいは吸着架橋
法の２種の方法により結合せしめる。これらの２種の方
法は、ウレアーゼのリークを生ぜしめないものであり、
キトサン誘導体とウレアーゼとを単に混合せしめて得る
吸着法とは区別されるものである。
ン誘導体とウレアーゼとを共有結合法あるいは吸着架橋
法の２種の方法により結合せしめる。これらの２種の方
法は、ウレアーゼのリークを生ぜしめないものであり、
キトサン誘導体とウレアーゼとを単に混合せしめて得る
吸着法とは区別されるものである。
共有結合法とは、予めキトサン誘導体をジアルデヒド
等の架橋剤により処理した後ウレアーゼを添加し反応せ
しめ製造する方法である。また、吸着架橋法とは、キト
サン誘導体とウレアーゼとを混在せしめてジアルデヒド
等の架橋剤により処理するものである。本固定化は公知
の方法により行われるが、架橋剤の処理は不活性水性溶
媒中で室温あるいはそれ以下の温度で行うとよい。使用
しうる架橋剤としては、入手が容易なグルタルアルデヒ
ドが好ましく、その他に、ヘキサメチレンジイソシアナ
ート、ヘキサメチレンジイソチオシアナート、トルエン
ジイソシアナート、キシレンジイソシアナート、ジアル
デヒドスターチ、ジメチルアジピミデート、ジメチルス
ルベルイミデート、ジメチル−3,3′−ジチオビスプロ
ピオンイミデート等が挙げられる。
等の架橋剤により処理した後ウレアーゼを添加し反応せ
しめ製造する方法である。また、吸着架橋法とは、キト
サン誘導体とウレアーゼとを混在せしめてジアルデヒド
等の架橋剤により処理するものである。本固定化は公知
の方法により行われるが、架橋剤の処理は不活性水性溶
媒中で室温あるいはそれ以下の温度で行うとよい。使用
しうる架橋剤としては、入手が容易なグルタルアルデヒ
ドが好ましく、その他に、ヘキサメチレンジイソシアナ
ート、ヘキサメチレンジイソチオシアナート、トルエン
ジイソシアナート、キシレンジイソシアナート、ジアル
デヒドスターチ、ジメチルアジピミデート、ジメチルス
ルベルイミデート、ジメチル−3,3′−ジチオビスプロ
ピオンイミデート等が挙げられる。
固定化するウレアーゼの量はキトサン誘導体の結合容
量が充分満たされるまで使用してもよく、その際には固
定化後の不活性水性溶媒中のウレアーゼの残存量を測定
して判断すればよい。一般的に、共有結合法においては
キトサン誘導体1g（湿重量）に対し500U〜30000Uを、吸
着架橋法においては5000U〜30000Uを、使用すればよ
い。また、使用する架橋剤は結合せしめる遊離基に対し
１〜100倍モル程度でよい。
量が充分満たされるまで使用してもよく、その際には固
定化後の不活性水性溶媒中のウレアーゼの残存量を測定
して判断すればよい。一般的に、共有結合法においては
キトサン誘導体1g（湿重量）に対し500U〜30000Uを、吸
着架橋法においては5000U〜30000Uを、使用すればよ
い。また、使用する架橋剤は結合せしめる遊離基に対し
１〜100倍モル程度でよい。
かくして得られた固定化ウレアーゼは、その比活性が
数U/g〜5000U/gになるが、通常は数U/g〜数百U/g程度で
ある。
数U/g〜5000U/gになるが、通常は数U/g〜数百U/g程度で
ある。
以上に述べた種々の固定化ウレアーゼを用い改質され
た酒類を製造するに当たっては、通常の醸造法により製
造した酒類を、濾過工程以後に処理すればよいが、例え
ば清酒においては火入れ前あるいはカーボン処理後の生
酒を処理する方法が有利に行われる。
た酒類を製造するに当たっては、通常の醸造法により製
造した酒類を、濾過工程以後に処理すればよいが、例え
ば清酒においては火入れ前あるいはカーボン処理後の生
酒を処理する方法が有利に行われる。
以上の如くの固定化ウレアーゼによる酒類の処理は、
カラムで酒類の処理を行うカラム方式と、固定化ウレア
ーゼを酒類液中に投入して処理を行うバッチ方式のいず
れでもよい。
カラムで酒類の処理を行うカラム方式と、固定化ウレア
ーゼを酒類液中に投入して処理を行うバッチ方式のいず
れでもよい。
固定化ウレアーゼの形状、即ちキトサン誘導体の形状
は、特に限定されないが、固定化ウレアーゼを製造する
過程や酒類の処理過程において取り扱いが容易であり、
しかもカラム方式による処理時において大きな流速の得
られる粒状多孔質のものがより好ましい。
は、特に限定されないが、固定化ウレアーゼを製造する
過程や酒類の処理過程において取り扱いが容易であり、
しかもカラム方式による処理時において大きな流速の得
られる粒状多孔質のものがより好ましい。
一般的に粒径が小さいものほど処理効率は良く、逆に
大きな流速を得ることは難しいので適当なものを選択す
ることが好ましいが、酒類の処理においては、消費者の
要望および製造コストの問題により尿素含量を1ppm以下
に減ずるとともに、投入速度をSV＝５以上、好ましくは
SV＝10〜30以上とすることが望ましいが、粒状多孔質の
粒径が、0.1乃至0.5mmである固定化ウレアーゼを用いた
場合に極めて良好であり、より好ましかった。
大きな流速を得ることは難しいので適当なものを選択す
ることが好ましいが、酒類の処理においては、消費者の
要望および製造コストの問題により尿素含量を1ppm以下
に減ずるとともに、投入速度をSV＝５以上、好ましくは
SV＝10〜30以上とすることが望ましいが、粒状多孔質の
粒径が、0.1乃至0.5mmである固定化ウレアーゼを用いた
場合に極めて良好であり、より好ましかった。
対象たる酒類の尿素含量はロットにより大きく異なる
こともあり、例えばカラム方式で処理する場合には、適
当にその投入速度を調節することにより簡単に尿素含量
が調整できる。カラムの大きさは酒類の処理量により変
更しうるが、一般的には横と高さの比率が1:11:10程度
がよく、1:2〜1:5が有利に使用しうる。例えば清酒1kl
を一昼夜で処理するには、本発明の固定化ウレアーゼを
約８を用い、前述の如く投入速度をSV＝５以上程度と
すればよい。
こともあり、例えばカラム方式で処理する場合には、適
当にその投入速度を調節することにより簡単に尿素含量
が調整できる。カラムの大きさは酒類の処理量により変
更しうるが、一般的には横と高さの比率が1:11:10程度
がよく、1:2〜1:5が有利に使用しうる。例えば清酒1kl
を一昼夜で処理するには、本発明の固定化ウレアーゼを
約８を用い、前述の如く投入速度をSV＝５以上程度と
すればよい。
「実施例」 以下に実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。
れらに限定されるものではない。
尚、本発明における尿素含量の測定はウレアーゼ・グ
ルタミンシンセターゼ法（尿素測定試薬説明書；東洋醸
造社製）を用いた。
ルタミンシンセターゼ法（尿素測定試薬説明書；東洋醸
造社製）を用いた。
また、ウレアーゼの活性量の測定は、以下の条件にお
いて１分間に１μmolの尿素を分解する酵素活性を1Uと
する。
いて１分間に１μmolの尿素を分解する酵素活性を1Uと
する。
１）試薬 ・発色試薬Ｉ液：フェノール5g、ニトロプルシッドナト
リウム25mgを蒸留水に溶解し500mlとする。
リウム25mgを蒸留水に溶解し500mlとする。
・発色試薬II液：水酸化ナトリウム2.5g、リン酸二ナト
リウム・12H2O 26.8g、アンチホルミン（10％有効塩
素）5mlを蒸留水に溶解し500mlとする。
リウム・12H2O 26.8g、アンチホルミン（10％有効塩
素）5mlを蒸留水に溶解し500mlとする。
・基質溶液:5M尿素水溶液と0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）を
体積比で1:12にて混和し、調整する。
体積比で1:12にて混和し、調整する。
２）酵素溶液の活性測定手順 試験管に基質溶液0.65mlを採り、37℃で約５分間予備
加温した後、酵素溶液検体0.1mlを加え37℃で正確に10
分間反応せしめ、1N硫酸0.2mlを添加することにより反
応を停止する（以下この反応停止溶液を反応原液とい
う）。この反応原液0.05mlを別の試験管中に採り蒸留水
を添加し0.50mlとし、発色試薬Ｉ液2.5mlおよび発色試
薬II液2.5mlを良く混和した後65℃で正確に20分間反応
せしめる。反応液を流水中で室温まで冷却し、分光光度
計により630nmの吸光度を求める（ΔＡ）。なお、吸光
度の測定に当たっては蒸留水を対照とした。
加温した後、酵素溶液検体0.1mlを加え37℃で正確に10
分間反応せしめ、1N硫酸0.2mlを添加することにより反
応を停止する（以下この反応停止溶液を反応原液とい
う）。この反応原液0.05mlを別の試験管中に採り蒸留水
を添加し0.50mlとし、発色試薬Ｉ液2.5mlおよび発色試
薬II液2.5mlを良く混和した後65℃で正確に20分間反応
せしめる。反応液を流水中で室温まで冷却し、分光光度
計により630nmの吸光度を求める（ΔＡ）。なお、吸光
度の測定に当たっては蒸留水を対照とした。
ブランク試験として酵素溶液検体0.1mlを37℃で正確
に10分間加温し、1N硫酸0.2mlを添加した後基質溶液0.6
5mlを添加して得た溶液を用意し、前記反応原液0.05ml
の代わりに用い以下前記と同様に操作し吸光度を求める
（ΔＢ）。また、標準試験として0.5μmol/ml硫安水溶
液0.05mlを前記反応原液0.05mlの代わりに用い以下前記
と同様に操作し吸光度を求める（ΔＳ）。
に10分間加温し、1N硫酸0.2mlを添加した後基質溶液0.6
5mlを添加して得た溶液を用意し、前記反応原液0.05ml
の代わりに用い以下前記と同様に操作し吸光度を求める
（ΔＢ）。また、標準試験として0.5μmol/ml硫安水溶
液0.05mlを前記反応原液0.05mlの代わりに用い以下前記
と同様に操作し吸光度を求める（ΔＳ）。
下記の計算式にてウレアーゼ活性は求める。
ΔA:酵素検体の吸光度 ΔB:ブランク試験の吸光度 ΔS:標準試験の吸光度 V:酵素溶液の液量（ml） W:酵素溶液の希釈倍率 ３）固定化されたウレアーゼの活性測定手順 Ｌ型試験管に固定化ウレアーゼを3.0mgを正確に秤量
し、0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）1mlを採り、37℃で約５分
間予備加温する。次に、37℃に予備加温された基質溶液
6.5mlを加え37℃で正確に10分間振とうし、反応せし
め、1N硫酸0.2mlを添加することにより反応を停止す
る。以下、酵素溶液の活性測定手段に従い同様に行い以
下の計算式で比活性を求める。
し、0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）1mlを採り、37℃で約５分
間予備加温する。次に、37℃に予備加温された基質溶液
6.5mlを加え37℃で正確に10分間振とうし、反応せし
め、1N硫酸0.2mlを添加することにより反応を停止す
る。以下、酵素溶液の活性測定手段に従い同様に行い以
下の計算式で比活性を求める。
ΔA:固定化ウレアーゼ検体の吸光度 ΔB:ブランク試験の吸光度 ΔS:標準試験の吸光度 ω:1000/固定化酵素量（mg） 実施例１〜８ 吸着架橋法による固定化ウレアーゼ 粒状多孔質キトサン誘導体キトパールBCW−3001（富
士紡績社製；商品名、粒径0.1mm）2.5g（湿重量）に、
ウレアーゼ（長瀬産業社製；商品名ナガプシン）997mg
（9.4U/mg）を溶解した0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）30ml
を加え、４℃で90分間撹拌し吸着せしめ、さらに0.05M
酢酸緩衝液500mlで充分洗浄した。次いでこれに、25％
グルタルアルデヒド（東京化成社製、電子顕微鏡用）10
mlを0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）80mlに溶解せしめた溶液
を添加して４℃で90分間架橋反応せしめた。反応後、0.
05M酢酸緩衝液（pH2.0）500ml、次いで0.05M酢酸緩衝液
（pH5.5）500mlで洗浄し、比活性160U/gの固定化ウレア
ーゼを得た（実施例１）。
士紡績社製；商品名、粒径0.1mm）2.5g（湿重量）に、
ウレアーゼ（長瀬産業社製；商品名ナガプシン）997mg
（9.4U/mg）を溶解した0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）30ml
を加え、４℃で90分間撹拌し吸着せしめ、さらに0.05M
酢酸緩衝液500mlで充分洗浄した。次いでこれに、25％
グルタルアルデヒド（東京化成社製、電子顕微鏡用）10
mlを0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）80mlに溶解せしめた溶液
を添加して４℃で90分間架橋反応せしめた。反応後、0.
05M酢酸緩衝液（pH2.0）500ml、次いで0.05M酢酸緩衝液
（pH5.5）500mlで洗浄し、比活性160U/gの固定化ウレア
ーゼを得た（実施例１）。
さらに上記の粒状多孔質キトサン誘導体キトパールBC
W−3001の代わりに下記の表に記載された粒状多孔質キ
トサン誘導体を用い、同様の操作を行って、実施例２〜
８の固定化ウレアーゼを得た。
W−3001の代わりに下記の表に記載された粒状多孔質キ
トサン誘導体を用い、同様の操作を行って、実施例２〜
８の固定化ウレアーゼを得た。
以上をまとめて表で示す。
実施例９〜12 共有結合法による固定化ウレアーゼ 粒状多孔質キトサン誘導体キトパールBCW−3005（富
士紡績社製；商品名、粒径0.5mm）2.2g（湿重量）に、
３％グルタルアルデヒド（東京化成社製、電子顕微鏡
用）を溶解した0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）80mlを加えて
25℃で１時間撹拌した。蒸留水500mlで洗浄し、ウレア
ーゼ（長瀬産業社製；商品名ナガプシン）80mg（9.4U/m
g）を0.05m酢酸緩衝液（pH5.0）で溶解せしめた溶液30m
lを加え25℃で１時間撹拌反応せしめた。反応後、蒸留
水500mlで洗浄し、比活性60U/gの固定化ウレアーゼを得
た（実施例９）。
士紡績社製；商品名、粒径0.5mm）2.2g（湿重量）に、
３％グルタルアルデヒド（東京化成社製、電子顕微鏡
用）を溶解した0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）80mlを加えて
25℃で１時間撹拌した。蒸留水500mlで洗浄し、ウレア
ーゼ（長瀬産業社製；商品名ナガプシン）80mg（9.4U/m
g）を0.05m酢酸緩衝液（pH5.0）で溶解せしめた溶液30m
lを加え25℃で１時間撹拌反応せしめた。反応後、蒸留
水500mlで洗浄し、比活性60U/gの固定化ウレアーゼを得
た（実施例９）。
実施例９で使用した担体キトパールBCW−3005の代わ
りに下記の表に記載された粒状多孔質キトサン誘導体を
用い、同様の操作を行って実施例10〜12の固定化ウレア
ーゼを得た。
りに下記の表に記載された粒状多孔質キトサン誘導体を
用い、同様の操作を行って実施例10〜12の固定化ウレア
ーゼを得た。
比較例１、２ キトサンへのウレアーゼの固定化 粒状多孔質キトサンゲルCL（焼津水産社製；商品名、
粒径0.5mm:アミノ基が置換されていないキトサンよりな
る）3.4g（湿重量）に、ウレアーゼ（長瀬産業社製；商
品名ナガプシン）550mg（9.4U/mg）を溶解した0.05M酢
酸緩衝液（pH5.0）30mlを加え、４℃で90分間撹拌し吸
着せしめ、さらに0.05M酢酸緩衝液500mlで充分洗浄し
た。次いでこれに、25％グルタルアルデヒド（東京化成
社製、電子顕微鏡）10mlを0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）80
mlに溶解せしめた溶液を添加して４℃で90分間架橋反応
せしめた。反応後、0.05M酢酸緩衝液（pH2.0）500ml、
次いで0.05M酢酸緩衝液（pH5.5）500mlで洗浄し、比活
性77U/gの固定化ウレアーゼを得た（比較例１）。
粒径0.5mm:アミノ基が置換されていないキトサンよりな
る）3.4g（湿重量）に、ウレアーゼ（長瀬産業社製；商
品名ナガプシン）550mg（9.4U/mg）を溶解した0.05M酢
酸緩衝液（pH5.0）30mlを加え、４℃で90分間撹拌し吸
着せしめ、さらに0.05M酢酸緩衝液500mlで充分洗浄し
た。次いでこれに、25％グルタルアルデヒド（東京化成
社製、電子顕微鏡）10mlを0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）80
mlに溶解せしめた溶液を添加して４℃で90分間架橋反応
せしめた。反応後、0.05M酢酸緩衝液（pH2.0）500ml、
次いで0.05M酢酸緩衝液（pH5.5）500mlで洗浄し、比活
性77U/gの固定化ウレアーゼを得た（比較例１）。
比較例１と同一のキトサンゲルCL3.4g（湿重量）に、
３％グルタルアルデヒド（東京化成社製、電子顕微鏡
用）を溶解した0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）80mlを加えて
25℃で１時間撹拌した。蒸留水500mlで洗浄し、ウレア
ーゼ（長瀬産業社製；商品名ナガプシン）80mg（9.4U/m
g）を0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）で溶解せしめた溶液30m
lを加え25℃で１時間撹拌反応せしめた。反応後、蒸留
水500mlで洗浄し、比活性49U/gの固定化ウレアーゼを得
た（比較例２）。
３％グルタルアルデヒド（東京化成社製、電子顕微鏡
用）を溶解した0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）80mlを加えて
25℃で１時間撹拌した。蒸留水500mlで洗浄し、ウレア
ーゼ（長瀬産業社製；商品名ナガプシン）80mg（9.4U/m
g）を0.05M酢酸緩衝液（pH5.0）で溶解せしめた溶液30m
lを加え25℃で１時間撹拌反応せしめた。反応後、蒸留
水500mlで洗浄し、比活性49U/gの固定化ウレアーゼを得
た（比較例２）。
実施例13 吸着架橋法による固定化ウレアーゼ 実施例８で使用したウレアーゼ−酢酸緩衝液溶液30ml
の代わりにウレアーゼ（東洋醸造社製、パンフレットＴ
−46:Lactobacillus fermentum B−1112株由来）−酢酸
緩衝液（pH5.0）溶液30ml（85U/ml）を用い、その他は
実施例８と同様の製造法により比活性85U/gの固定化ウ
レアーゼを得た。
の代わりにウレアーゼ（東洋醸造社製、パンフレットＴ
−46:Lactobacillus fermentum B−1112株由来）−酢酸
緩衝液（pH5.0）溶液30ml（85U/ml）を用い、その他は
実施例８と同様の製造法により比活性85U/gの固定化ウ
レアーゼを得た。
実施例14 共有結合法による固定化ウレアーゼ 実施例10で使用したウレアーゼ−酢酸緩衝液溶液30ml
の代わりにウレアーゼ（東洋醸造社製、パンフレットＴ
−46:Lactobacillus fermentum B−1112株由来）−酢酸
緩衝液（pH5.0）溶液30ml（85U/ml）を用い、その他は
実施例10と同様の製造法により比活性134U/gの固定化ウ
レアーゼを得た。
の代わりにウレアーゼ（東洋醸造社製、パンフレットＴ
−46:Lactobacillus fermentum B−1112株由来）−酢酸
緩衝液（pH5.0）溶液30ml（85U/ml）を用い、その他は
実施例10と同様の製造法により比活性134U/gの固定化ウ
レアーゼを得た。
実施例15〜26、比較例３、４ 約375kgの米および米麹等の政令で定められた原料を
用い常法により発酵させた後、搾り、酒粕を除く工程、
オリ引き濾過の工程、カーボン脱色工程のそれぞれの工
程を経て火入れ前の生酒（アルコール分19.0％、pH4.
3、尿素含量26ppm）約1000を得た。
用い常法により発酵させた後、搾り、酒粕を除く工程、
オリ引き濾過の工程、カーボン脱色工程のそれぞれの工
程を経て火入れ前の生酒（アルコール分19.0％、pH4.
3、尿素含量26ppm）約1000を得た。
実施例１〜12で得られた固定化ウレアーゼおよび比較
例１〜２で得られた固定化ウレアーゼ2mlを15℃の温水
を循環した外筒管付カラム（１×4.5cm、vol＝3.5ml）
のそれぞれに充填し、前述の生酒（尿素含量26ppm）をS
V＝20で30日間通液したが、得られた清酒の尿素含量は
下記の表の通りであった。
例１〜２で得られた固定化ウレアーゼ2mlを15℃の温水
を循環した外筒管付カラム（１×4.5cm、vol＝3.5ml）
のそれぞれに充填し、前述の生酒（尿素含量26ppm）をS
V＝20で30日間通液したが、得られた清酒の尿素含量は
下記の表の通りであった。
本固定化ウレアーゼは比較例に比べ長期間の使用に耐
え清酒中の尿素を効率良く分解除去でき、ウレアーゼの
混入もなかった。
え清酒中の尿素を効率良く分解除去でき、ウレアーゼの
混入もなかった。
「発明の効果」 本発明によれば、ウレアーゼの混入なく酒類中の尿素
を有効に分解除去できる固定化ウレアーゼが供給し得る
ものであり、およびこの固定化ウレアーゼを用いること
により尿素を含有しないかまたは低減せしめた改質され
た酒類を製造し得るものである。
を有効に分解除去できる固定化ウレアーゼが供給し得る
ものであり、およびこの固定化ウレアーゼを用いること
により尿素を含有しないかまたは低減せしめた改質され
た酒類を製造し得るものである。
フロントページの続き (72)発明者 蓼沼 誠 東京都北区滝野川２―６―30 国税庁醸 造試験所内 (72)発明者 下飯 仁 東京都北区滝野川２―６―30 国税庁醸 造試験所内 (72)発明者 泉 禄郎 静岡県田方郡大仁町田京1015―１ (72)発明者 平田 勤 静岡県田方郡大仁町三福685―１ (72)発明者 松本 邦男 静岡県三島市光ケ丘17―16
Claims (5)
- 【請求項１】共有結合法あるいは吸着架橋法による固定
化ウレアーゼにおいて、固定化担体がキトサンのアミノ
基の一部若しくは全部が、 および／またはNH2−（CH2）ｎ−NH−CO−NH−基（式
中、ｎは２〜10を示す）と置換せしめたキトサン誘導体
であることを特徴とする固定化ウレアーゼ。 - 【請求項２】固定化ウレアーゼが、多孔質粒子状であ
り、かつ、その粒径が、約0.1mm乃至約0.5mmである特許
請求の範囲第１項に記載の固定化ウレアーゼ。 - 【請求項３】固定化ウレアーゼに用いられるウレアーゼ
が微生物ウレアーゼである特許請求の範囲第１項に記載
の固定化ウレアーゼ。 - 【請求項４】固定化ウレアーゼに用いられるウレアーゼ
が酸性ウレアーゼである特許請求の範囲第１項に記載の
固定化ウレアーゼ。 - 【請求項５】酒類の製造過程において、特許請求の範囲
第１項に記載の固定化ウレアーゼを使用することを特徴
とする改質された酒類の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63190147A JP2717227B2 (ja) | 1988-07-29 | 1988-07-29 | 固定化ウレアーゼとそれを用いた酒類の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63190147A JP2717227B2 (ja) | 1988-07-29 | 1988-07-29 | 固定化ウレアーゼとそれを用いた酒類の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0239886A JPH0239886A (ja) | 1990-02-08 |
| JP2717227B2 true JP2717227B2 (ja) | 1998-02-18 |
Family
ID=16253192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63190147A Expired - Lifetime JP2717227B2 (ja) | 1988-07-29 | 1988-07-29 | 固定化ウレアーゼとそれを用いた酒類の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2717227B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100338797C (zh) * | 2004-12-25 | 2007-09-19 | 苗维新 | 铅酸蓄电池铜板栅生产方法及专用模具 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108795910A (zh) * | 2018-06-26 | 2018-11-13 | 黄月兔 | 食品级脲酶、制备方法及其在黄酒中的应用 |
-
1988
- 1988-07-29 JP JP63190147A patent/JP2717227B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100338797C (zh) * | 2004-12-25 | 2007-09-19 | 苗维新 | 铅酸蓄电池铜板栅生产方法及专用模具 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0239886A (ja) | 1990-02-08 |
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