JP2599789B2 - 水―不溶性グルコースイソメラーゼ結晶およびその製造法 - Google Patents

水―不溶性グルコースイソメラーゼ結晶およびその製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は結晶酵素の架橋結合により形成する新規水−
不溶性グルコースイソメラーゼに関する。本発明は不溶
性、架橋結合グルコースイソメラーゼの製造方法にも関
する。
〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕
連続操作反応器で固定化酵素、すなわち固体キヤリア
に結合した酵素の使用はますます好ましい技術である。
何故なら酵素のコストおよび最終生成物の精製で節約で
きるからである。固定化グルコースイソメラーゼによる
グルコースのフラクトースへの転換は通常このような手
順を利用する方法である。
一般に、酵素は水溶性であり、従つて連続方法におい
て固定化技術を使用することが必要になる。酵素が水性
相に溶解することを防止し、一方その活性を維持できる
方法により固体相に結合させなければならない。酵素を
吸収させ、共有結合させ、架橋結合させ又はミクロカプ
セル化する各種技術が酵素を固体キヤリアと提携させる
ために提案された。別法では、酵素を産生する微生物全
体を固体相に結合できる。これらの技術のすぐれた要約
は例えば、Moo−Young,M.（ed.）Comprehensive Biotec
hnology,２,Pergamon Press,London,1985,p.191〜211に
提示される。
先行方法では、酵素は別に製造したキヤリア材料に結
合する。これはそのままで化学的動力学に対し、又は基
質の流動技術に対し有利である。しかし、キヤリア材料
は糖産業で使用されるような、特に大規模大量生産方法
では、大部分の場合触媒として作用する酵素より一層コ
ストがかかる。別法では、酵素はゼラチンのような不活
性成分と架橋結合により固定化することができる。いず
れにしても、先行技術において触媒として作用する酵素
は、各特別の方法で使用する材料の重量および容積の一
般には５％より少ない、通例は１〜２％の画分を形成す
るに過ぎない。
技術的に、ダルタルアルデヒドとの架橋結合は例え
ば、グルコースイソメラーゼの固定化では非常に重要な
ものであつた。既知のように、グルタルアルデヒドは食
料品の加工において酵素の固定化に使用することはFDA
により承認されている。
適用された他の技術はイオン交換体への結合および固
体キヤリアへの吸収を含む。このような適用の例は米国
特許第4,699,882号明細書（K.Visuri:Stabilized gluco
se isomerase）に見出すことができる。しかし、この先
行技術に使用したキヤリアは比較的高価であり、この技
術は大きな反応器を必要とする。
工業的使用に対する酵素の固定化は必ずしも使用酵素
と連合しないコストを伴なう。これらは加工装置の建造
および工業敷地により生ずるコスト、キヤリア材料の取
得（再取得）コスト、失活酵素材料の処分コスト、反応
器を空にし、満たすことにより（又はキヤリアの再生に
より）生ずる労務コスト、反応体の緩慢さにより生ずる
第二次コストを含む。永い保有時間の結果として、非−
酵素性の不利な副反応が、特にフラクトースの製造でし
ばしば起こりうる。
科学文献はグルタルアルデヒドによる結晶酵素の架橋
結合の数例を含む。これらの研究で、酵素結晶は基本的
研究目的に対し架橋結合された。酵素結晶の構造はしば
しば非常に弱いので、結晶はＸ−線回析研究で使用する
線ビームに耐えられない。しかし、グルタルアルデヒド
によりこれらはしばしばこれらの目的に対し安定化でき
る。さらに、結晶は安定性および触媒動力学を研究する
目的により架橋結合された。結晶の架橋結合が成功した
場合、グルタルアルデヒドのみを使用し、媒体は各特別
の酵素を結晶形で維持する溶液から成つた。不溶性結晶
は、グルタルアルデヒドおよび酵素たん白間の反応によ
り直接形成するらしい。QuiochoおよびRichards（Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA）52（1964）p.833およびBiochemi
stry ５（1966）p.4062）がカルボキシペプチダーゼの
架橋結合にグルタルアルデヒドを使用したことが最初の
ことであつた。
BishopおよびRichards（J.Mol.Biol.33（1968）p.415
〜421）は室温で結晶ベータラクトグロブリンと１％グ
ルタルアルデヒド水溶液を架橋結合した。結晶は酵素の
電気的性質を研究するために使用した。Haas（Biophysi
c.Journ.８（1968）p.549〜555）は12％のグルタルアル
デヒド濃度を使用して、４％硝酸塩溶液（pH8）の存在
で、リゾチーム結晶を架橋結合した。
Dyer,PhillipsおよびTownsend（Thermochimica Acta
８（1974）p.456〜464）はグルタルアルデヒドにより架
橋結合した結晶カルボキシペプチダーゼの熱安定性を研
究した。彼らは架橋結合は安定性の増加に導くことを発
見した。TuechsenおよびOttesen（Charlsberg Res.Comm
un.42（1977）p.407〜420）は硫酸ナトリウム溶液中で
グルタルアルデヒドにより架橋結合した結晶サブチリシ
ンの動力学性を研究した。低分子基質では、結晶の活性
は高いが、たん白分子又はポリペプチド（結晶中に拡散
することができない）のような高分子基質では些細なも
のであつた。
Wongら（Biochem.and Biophysic.Research Communica
tions 80（1978）p.886〜890）は硫酸アンモニウム溶液
中で微生物起源の酸性プロテアーゼとグルタルアルデヒ
ドを架橋結合した。架橋結合では、硫酸アンモニウムの
存在は技術的に不利と見做されていた。
MorozovおよびMorozova（Biopolymers 20（1981）p.4
51〜467）は２〜６％グルタルアルデヒド溶液および室
温で２〜10日の反応時間を使用して結晶リゾチーム、ヘ
モグロビンおよびミオグロビンを架橋結合した。Leeら
（Bioorganic Chemistry 14（1986）p.202〜210）は２
−メチル−2,4−ペンタンジオール（25％）の存在でア
ルコールデヒドロゲナーゼの結晶とグルタルアルデヒド
を架橋結合した。
グルタルアルデヒドにより不溶性酵素を製造すること
は、特にたん白が比較してほとんどリジンを含まない場
合、しばしば困難であることは知られている。この問題
は酵素中に、架橋結合して不溶形を生成できるアルブメ
ンのようなたん白を混合することによりしばしば回避で
きる（G.B.Broun,Methods in Enzymology,44（1976）p.
263）。しかし、このような不活性異種たん白の添加
は、架橋結合すべき酵素が結晶である場合不可能であ
る。現在まで、グルタルアルデヒドのみにより不溶形に
結晶を架橋結合できない場合、架橋結合する手段はな
い。
〔課題を解決するための手段〕
上記のように、グルコースイソメラーゼをグルタルア
ルデヒドにより固定化することは既知である。こうして
イソメラーゼは支持体に架橋結合される。このような方
法は工業的に完全に利用される。グルコースイソメラー
ゼ結晶を不溶形に架橋結合する試みは文献に記載されて
いない。
初めの結晶状態を維持し、一方酵素の酵素活性は非常
に高く残こすような方法でグルコースイソメラーゼ結晶
を架橋結合できることがわかつた。最善の処理は初めの
酵素と同じ活性を有する酵素を与えることである。本発
明による生成物は酵素を工業的に使用する場合、存在で
きる任意の溶媒に溶解しない。架橋結合結晶酵素は工業
的異性化方法でそのままの状態で異性化カラムに満たし
使用することができる。新規架橋結合結晶酵素により、
以前のものよりはるかに小さく、一層効率的なカラムで
連続的異性化方法を行なうことができる。本発明により
しばしばカラムの大部分の空間を占有し、コストの大部
分の原因となる不活性材料に結合した酵素よりむしろ、
純粋酵素を満たしたカラムを使用できることは当業者は
認めるであろう。
本発明方法では、グルコースイソメラーゼ結晶はグル
タルアルデヒドのようなジアルデヒド、アンモニウム化
合物、アミン又はアミノ酸、好ましくはアンモニウム塩
又はリジンのような少なくとも１個のアミノ基を含有す
る化合物により架橋結合する。いくつかのアミンおよび
アミノ酸は使用に適する。グルタルアルデヒドの他に多
数の他のアルデヒドおよび架橋結合剤として既知の、ア
ミノ基と反応する物質は本方法で使用できることは同様
に明らかである。
本発明方法により製造した固体結晶酵素の活性は非常
に高いか又は遊離酵素のものと実際に同一である。固体
結晶酵素は連続方法でカラム充填剤としてそのまま使用
できる。非常に安定で、機械的応力に十分に耐える。
所望する場合、架橋結合結晶は科学物理的方法で、例
えば球形、シート状形、帯状形などの一層大きいボデイ
を形成するためにさらに結合できる。こうして得た酵素
標品は各種機械的処理に耐えることができる。
当業者はここに開示した架橋結合方法は、一般にその
アミノ酸組成のために、従来架橋結合に貢献することが
分らなかつた任意の結晶酵素の不溶性標品の製造に実際
に使用できることを認めるであろう。
以下に、本発明方法を一層詳細に記載する。
原料として使用する結晶グルコースイソメラーゼの製造 硫酸アンモニウム（約10重量％）をグルコースイソメ
ラーゼ溶液（乾燥たん白として測定して１〜10重量％の
イソメラーゼ）に溶解する。溶液はたえず攪拌しながら
約１〜２℃にゆつくり冷却する。こうして本質的に完全
なイソメラーゼの結晶化が起こる（95％より多く）。硫
酸アンモニウムの代りに、例えば硫酸マグネシウム又は
硫酸ナトリウムを結晶化剤として使用できる。使用塩の
濃度は広い限度内、例えば５〜25重量％内で変化でき
る。結晶化方法に必要な時間も広い限度内、例えば１時
間〜数日内で変化する。大結晶の製造には、徐々に冷却
することが好ましく、イソメラーゼはできるだけ精製す
べきである。結晶化は米国特許第4,699,882号明細書（V
isuri）に記載される。参考のためにここに挿入する。
結晶化後、結晶マスは母液から沈澱法又は遠心分離に
より分離する。必要の場合、結晶マスは硫酸アンモニウ
ム、硫酸マグネシウム又は結晶化に適する他の物質の純
粋溶液により洗滌する。架橋結合は過剰の遊離母液を含
まない、高密度形に沈澱又は遠心分離した結晶マスで行
なう。これらの結晶マスの代表的活性は10,000GIU/gで
ある。乾物として測定して20〜30重量％の純粋酵素たん
白を含有する。酵素結晶は乾燥する場合、その構造を失
なうことを注目すべきである。
架橋結合 結晶マスは結晶がその中に溶解しないように塩溶液に
サスペンドする。溶液の酵素結晶濃度は例えば、乾物で
２〜17重量％と広く変化できる。
アンモニウム塩は、塩溶液がアンモニウム、又は適当
なアミン、又はリジンのようなアミノ酸を初めに含有し
ない場合、塩溶液に添加する。混合物のpHは、例えば苛
性ソーダ溶液を添加することにより５〜９、好ましくは
６〜８の値に調整する。酸度はリン酸塩バツフア、例え
ば0.05Mリン酸ナトリウムにより、又はアルカリ溶液
（苛性ソーダのような）による自動的pH調整により調整
する。添加アミン又はアミノ酸の有用な濃度は広い限度
内で変化し、他の成分の濃度による。本発明による生成
物は混合物の最終重量の１〜15％のアミン又はアミノ酸
濃度により高収量で製造した。
その後グルタルアルデヒドを架橋結合反応を開始する
ために混合物に添加する。グルタルアルデヒド量は湿潤
酵素結晶マス基準で１〜45重量％の広い限度内で変化で
きる。好ましい量は例えば混合物に含有されるアミン濃
度による。一般に、好ましい濃度は乾燥酵素として計算
して3gのイソメラーゼにつき３〜4.5gのグルタルアルデ
ヒドに変化する。反応中、溶液はたえず攪拌する。温度
は２〜25℃の範囲である。温度は臨界的であるとは思わ
ないが、低温は有利である。反応は、特に高温では非常
に急速に、数分以内に起こる。低温における反応時間は
20時間までである。
反応後、不溶性結晶は混合物から沈澱又は遠心分離に
より分離する。結晶マスは水又は適当な塩溶液にサスペ
ンドし、再遠心分離することにより洗滌する。洗滌は結
晶マスが触媒として使用するのに十分に精製されるまで
数回反復する。洗滌に関連して微細粒状沈澱は水により
洗滌することが好ましい。
酵素方法で触媒として使用する場合、得た結晶マスを
乾燥させることは得策ではない。湿潤結晶マスは何ら特
別の処置することなく少なくとも６ケ月間その活性を十
分に保有する。
最終生成物の特徴 本発明により製造した架橋結合結晶は外観および大き
さが初めの原料結晶と同じである。結晶の大きさは臨界
的ではない。100〜200マイクロメータ又はそれより大き
い、1mmまでの直径を有する結晶は特に工業的使用に適
する。
本発明による結晶のもつとも重要な性質はこれらが
水、塩溶液および糖溶液に溶解しないことである。イソ
メラーゼ結晶が高温でさえグルコースおよびフラクトー
スの濃厚溶液に溶解しないことは特に重要なことであ
る。工業的方法では、60℃の温度および45重量％の糖濃
度を使用することは慣例的である。架橋結合結晶はこの
ような条件下で、そして任意の他の糖濃度および高温
（100℃まで）で不溶性である。架橋結合結晶の活性は
初めの酵素の活性と同じオーダである。工業的には、こ
れらの活性が不活性キヤリア上に固定した酵素の活性よ
り何倍も高いことは有利であり、重要である。
酵素を結晶形で架橋結合すると、結晶中で作用し、結
晶を天然に保有する力により酵素は著しい程度まで安定
化することで一層の利益を得る。
出発物質および最終生成物の特徴化に対し使用する方法 イソメラーゼの活性は乾燥酵素標品1gにつき国際的グ
ルコースイソメラーゼユニットとして、GIUと畧記して
測定された。１ユニツト（GIU）は次の条件下で１マイ
クロモル／分の割合でグルコースをフラクトースに転換
できる酵素量を表わす：グルコース濃度2.0モル／、p
H7.0および温度60℃。
活性測定に対し、0.1〜1gの酵素標品（初めの結晶マ
ス又は完全に洗滌した架橋結合結晶マス）を上記のよう
な基質溶液（100ml）中に混合した。適当な時間後、例
えば10分後に溶液のフラクトース含量を測定し、活性を
計算し上記ユニツトで表わした。酵素量および反応時間
は、測定結果が反応の初めの割合に関連できるように形
成フラクトース含量を全糖含量の５％より少ないように
選択した。出発物質および生成物の乾燥含量は試料を10
5℃で恒量まで乾燥することにより通例方法により測定
した。
異性化方法 結晶架橋結合酵素は通例方法でバツチ異性化方法で使
用するのに適する。その場合使用酵素は反応後、例えば
濾過により分離し、所望を場合再使用できる。
しかし、工業的規模では、連続方法として異性化を行
なうことが好ましい。それによつて異性化すべき糖溶液
は酵素カラムを通して流すことができる。反応時間およ
び／又は温度を変えることにより、異性化方法は調整が
容易である。酵素は凍結点から100℃を超える温度ま
で、広い範囲の温度内で活性である。低温では、反応が
遅く、糖（グルコースおよびフラクトース）水和物が結
晶化することが欠点であるが、高温では酵素およびフラ
クトース双方の分解がかなり急速に起こることが欠点で
ある。
連続異性化は代表的には、カラムに100〜300マイクロ
メータの架橋結合酵素結晶を満たすような方法で行な
う。カラムの大きさおよび高さは各特別の場合に必要な
容量に従つて変えることができる。小カラムでは適当な
層の高さは５〜50cmである。温度も広い限度内で変える
ことができる。室温は容易に実現できる。微生物学的汚
染が問題となる場合、少なくとも約60℃に温度を上げる
ことによりこれらは排除できる。
方法は線流速を変えることにより調整は容易である。
小カラムでは、線流速は２〜30cm/分の範囲である。新
鮮酵素に適する保留時間は１〜２分である。圧力は大気
圧である。圧力ロスは些細である（50cmの層の高さにつ
き＜0.2バール）保留時間はカラムの層の高さを変える
ことにより、および流速により調整する。異性化反応は
温度を上げることにより加速することができる。
通例の工業的方法では、大部分の場合、糖の40〜45％
がフラクトースである糖溶液を得ることが目的である。
酵素の活性はカラムの老化につれて減少する場合、所望
レベルは流速を減少することにより維持する。
次例は本発明を一層厳密に例示する。
例 １ 米国特許第4,699,882号明細書に記載のように10％硫
酸アンモニウム溶液中で結晶させた850gのグルコースイ
ソメラーゼ結晶を秤量し、この結晶にpH7.4の1000mlの1
0％硫酸アンモニウム溶液（0.5Mリン酸ナトリウムによ
り緩衝した）を添加した。混合物は10℃に冷却した。形
成混合物は結晶の損傷を軽減するために低速（200〜400
rpm）を使用するプロペラ撹拌機によりたえず撹拌し
た。25％グルタルアルデヒドの160ml試料を混合物に添
加した。１時間後、20の純水を混合物中に添加するこ
とにより反応を阻止した。撹拌は即座に終結させ、結晶
は２時間容器の底部に沈降させた。母液はデカントし、
別に結晶は流出しないように注意した。20の純水を再
び結晶マス中に混合し、洗滌水はデカントして除去し
た。尚別の水による洗滌を行なつた。水により３回洗滌
して得た湿潤イソメラーゼ結晶マスはそのまま異性化試
験活性測定および他の試験に使用した。
こうして製造した架橋結合グルコースイソメラーゼは
結晶状態（顕微鏡観察）であつた。結晶は水、各種塩の
稀薄溶液（２〜９のpH範囲）、稀酸（１モル／）、10
0℃までの熱水および熱塩溶液、および100℃までの濃厚
グルコース、フラクトースおよび糖溶液に不溶性であつ
た。結晶の外観はすべての上記条件下で無変化のままで
あつたが、架橋結合しなかつた結晶イソメラーゼは溶解
するか、又は無定形沈澱として沈澱した。架橋結合イソ
メラーゼの酵素活性は架橋結合しなかつた初めのイソメ
ラーゼ活性の52％であつた。すなわち初めのイソメラー
ゼの活性は40,000GIU/gである場合、架橋結合結晶の活
性は乾燥酵素たん白について計算して相当して20,000GI
U/gより高かつた。
例 ２ 例１のように、次の反応混合物を25℃で製造した： 純粋酵素たん白として計算して14gのイソメラーゼ、 10gの硫酸アンモニウム、 1.5gのグルタルアルデヒド（約8mlの25％溶液）、 0.05Mリン酸ナトリウムバツフア（溶液のpH7.4） 100mlの水。
１時間の反応時間後、遊離溶液は実験室遠心分離機に
より1000rpmで５分遠心分離することにより混合物から
除去した。得た結晶マスは200mlの純水にサスペント
し、上記のように再び遠心分離した。水による洗滌は上
記のようにもう一度反復した。湿潤洗滌結晶マスを回収
し、それ以上の研究に使用した。こうして製造した結晶
マスの活性は初めの結晶マスの活性の49％であつた。
例３〜８ 例２と同じ初めの組成を有する反応混合物を10℃で例
１のように製造した。各種長さの反応時間後、反応を終
結させ、結晶マスを洗滌し、その後各結晶マスの活性を
測定した。結果は次の第Ｉ表に示す。
反応は非常に急速に完了し、活性は反応時間が増加し
た場合でもほとんど増加しないことが結果からわかる。
例９〜16 例１のように、次の初めの組成を有する反応混合物を
10℃で製造した： 14gのグルコースイソメラーゼたん白（結晶形の）、 10gの硫酸アンモニウム、 90mlの0.5Mリン酸ナトリウム溶液（第II表に示すよう
にpH6.0、7.0、8.0又は8.4） グルタルアルデヒド0.12、0.5、2.0、3.5又は4.12g
（第II表に示すように）。
反応時間は１時間であつた。各形成結晶マス（結晶マ
スの初めの活性基準の％）は第II表に示す。
グルタルアルデヒド量はかなり広い限度内で変化で
き、それにも拘らず高活性を得ることができることが結
果から明らかである。酸度は非常に結果に影響する。好
ましいpH値は7.0であるが有用な標品は試験した全pH範
囲内で、すなわちpH6.0〜8.4で得ることができる。
例17〜27 上記例と同じ試験シリーズを行なつた。しかし温度は
２℃で、反応時間は18時間であつた。反応混合物の組成
は次の通りであつた： 乾燥たん白として計算して3gのイソメラーゼ結晶、 媒体として5.0mlの水、 7.5gの塩（硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび
／又は硫酸アンモニウム、第III表参照）、 7.0にpH調整用の苛性ソーダ（２ミリ当量より多くな
い、すなわち80mg）、 0.125〜2.5gのグルタルアルデヒド（第III表参照）。
架橋結合をアンモニウム塩を使用せずに行なう場合、
不溶性結晶は得られない。グルタルアルデヒドの高濃度
によつてさえ得られない。少量のアンモニウム塩でも不
溶性結晶の形成を促進する。
例28〜38 不溶性イソメラーゼ結晶を次の一般的方法に従つて各
種窒素化合物を使用して製造した： 乾燥たん白として計算して3gの結晶イソメラーゼ、 7.5gの硫酸マグネシウム、 10ミリモルの窒素化合物（第IV表参照）、 2.5gのグルタルアルデヒド（100％として計算）、 温度２℃、および 反応時間18時間。
第 IV 表 窒素化合物 量（ｇ） 活性（％） 例28 リジン 1.83 80 例29 アルギニン 1.74 17 例30 ヒスチジン 1.55 26 例31 グルタミン 1.46 18 例32 ロイシン 1.31 21 例33 イソロイシン 1.31 18 例34 プロリン 1.15 10 例35 メチオニン 1.49 27 例36 フエニルアラニン 1.65 17 例37 トリプトフアン 2.04 44 例38 ベタイン 1.17 23 多数の異るアミンは架橋結合方法に関し同じ効果を有
することが結果からわかる。
例39〜51 不溶性イソメラーゼ結晶を次の一般式教示に従つて異
る用量のグルタルアルデヒドおよびリジンにより製造し
た： 乾燥たん白として計算して3gの結晶イソメラーゼ、 7.5gの硫酸マグネシウム、 0.47〜2.34gのリジン（第Ｖ表参照）、 苛性ソーダ溶液により8.0にpH調整、 0.5〜1.25gのグルタルアルデヒド（100％、第Ｖ表参
照）。
溶液は18時間２℃で反応させた。
リジンおよびグルタルアルデヒドの用量間の比は不溶
性結晶の形成に影響する、すなわち、最適リジン用量レ
ベルは各グルタルアルデヒド用量レベルで知り得ること
が結果からわかる。
例52〜57 イソメラーゼ結晶は次の一般的教示に従つて硫酸アン
モニウムおよびリジン溶液中で架橋結合した： 10％硫酸アンモニウム中の10gのイソメラーゼ結晶
（すなわち、乾物として計算して3.72gの精製イソメラ
ーゼたん白、0.63gの硫酸アンモニウム、および5.65gの
水）、 5gの硫酸アンモニウム、 45gの水、 1.25gのグルタルアルデヒド、100％として計算、 ０〜3gのリジン（第VI表参照）。
すべての反応成分のpHは撹拌前に苛性ソーダにより8.
0に調整した。
混合物は３℃で18時間撹拌した。
第 VI 表 リジン（ｇ） 活性（％） 例52 ０ 40 例53 0.3 62 例54 0.6 66 例55 1.2 72 例56 1.8 92 例57 3.0 96 リジンは架橋結合の収量に非常に有利に影響すること
が結果からわかる。硫酸アンモニウムは、たとえ硫酸ア
ンモニウム単独で満足できる結果を得るとしても、リジ
ンを利用できる場合の結果より大きい効果を有しない。
例58〜69 イソメラーゼおよびリジンの量は一定に保持し、他の
成分は第VII表に示すように変動した： 乾燥形で計算して3gのグルコースイソメラーゼ、 1gのリジン、 0.01gの苛性ソーダ（溶液のpH8）。
反応時間は18時間で、温度は２℃であつた。
反応混合物の濃度は最終結果にほとんど効果を有しな
いことが結果からわかる。反応成分〔酵素、リジン（又
はアミン）およびグルタルアルデヒド〕間の重量比は非
常に大きい効果を有する。
例70 水により洗滌した1gの架橋結合グルコースイソメラー
ゼマス（例56からのもの、0.4g乾物）をpH7.0に調整し
た100gの40％グルコース溶液中に混合した。混合物は60
℃でたえず撹拌した。試料は周期的に混合物から採取
し、試料のフラクトース含量は偏光計により測定し、グ
ルコース含量はヘキソキナーゼにより酵素的に測定し
た。溶液のフラクトース含量は３時間中に溶液の全糖含
量（グルコース＋フラクトース＝100％）に対し42％に
上昇した。試験後、架橋結合イソメラーゼを混合物から
濾過により分離し、水で洗滌した。回収した結晶マスは
その活性および乾燥含量に対し試験し、活性酵素は全く
溶解しないか又は試験で消失しないことがわかつた。試
験は同じ酵素バツチについて数回反復することができ
た。
例71 例１記載のように製造した結晶マスは微粒状沈澱を除
去するために洗滌し、結晶物質は水にサスペンドしデカ
ント（３回）することにより処理中に微細に圧砕した。
平均粒度100マイクロメータのこうして得た大結晶画分
は直径2.6cmおよび高さ5cmを有する円筒状反応器に充填
した。次の組成を有するグルコース溶液を60℃でポンプ
によりカラムを通した： 582gのグルコース１水和物 590gの水 0.37gのMgSO4・7H2O 0.19gのNaHSO3 pH6.9（1M NaOH、1ml以下の消費）。
試験の初めには流速は11ml/分であつた。それにより
カラムから排出する溶液のフラクトース含量は全糖含量
基準で42％に上つた。試験は200時間継続し、その後流
速は初めの転換（フラクトース含量42％）を維持するた
めに9ml/分に低減しなければならなかつた。従つて酵素
の活性はこの期間中初めの値から81％に低下した。結晶
マスの減少又は溶解は試験中観察できなかつた。
例72〜76 水により洗滌した43.42gの湿潤活性イソメラーゼマス
（例67の方法により製造、乾物基準で10.0gの酵素）を
秤量した。
例71に記載のように製造した200mlのグルコース溶液
を結晶マス上に注いだ。混合物は60℃で異る時間振盪
し、次に濾紙デイスクを通して混合物を濾過した。濾紙
上に残る結晶マスは水で注意深く洗滌し、すべての可溶
性物質を除去した。結晶マスは105℃でインキユベータ
中で乾燥し、秤量した。観察により次の第VIII表を得
た： 本発明方法により製造した架橋結合結晶イソメラーゼ
は通例の工業的操作条件下で基質に溶解しないことが結
果からわかる。
例77 架橋結合結晶イソメラーゼ、DEAEセルロースに結合し
たイソメラーゼおよび初めの遊離可溶性イソメラーゼを
同じ化学的および物理的条件下に保持することにより相
互に比較した。各酵素試料は適度の短時間すなわち10〜
30時間後に測定可能な程度にその活性を失なうように条
件を選択した。各酵素標品の5g部分を150mlの0.05Mリン
酸ナトリウムバツフア（pH6.0）中に混合し、これはさ
らに1.5ミリモル／ MgSO4および２ミリモル／ NaHS
O3を含有した。混合物は70℃で数時間振盪した。試料は
周期的に混合物から採取し、残留イソメラーゼの活性を
試料から測定した。各酵素試料の半減期（すなわち酵素
活性が初めの値の1/2に低下する時間）を活性減少を基
準にして測定した。結果は次の第IX表に示す。
第 IX 表 酵素試料 半減期(時間) 初めの可溶性イソメラーゼ 2.2 DEAEセルロースに結合したイソメラーゼ 3.3 架橋結合結晶のイソメラーゼ 19.0 架橋結合結晶は遊離酵素又は既知方法で固定した酵素
より実質的にすぐれた酵素活性を保有することが結果か
らわかる。
例78 架橋結合結晶イソメラーゼおよびDEAEセルロースに結
合したイソメラーゼは例71記載と同様に円筒状カラム反
応器に充填した。グルコース溶液は連続的にポンプでカ
ラムを通して送つた。グルコース溶液はpHを6.0に調整
したことを除いて例71と同じ組成を有した。カラムの温
度は試験中60℃であつた。カラムに含まれる酵素活性は
流速および流れる溶液のフラクトース含量を基準にして
計算した。結果は次の第Ｘ表に示す。
架橋結合結晶は顕著に酵素活性を保有することが結果
からわかる。
例79〜81 架橋結合結晶と先行技術の固定化イソメラーゼのカラ
ム法における比較 代表的工業的に使用するイソメラーゼの試料および本
発明の架橋結合結晶を垂直の実験室カラム中に充填し
た。結晶の架橋結合は例51記載のように行なつた。円筒
状カラムの内径は2.7cmで、高さは50cmであつた。カラ
ムは60℃に温度調節した水ジヤケツトを有した。カラム
の下端は酵素顆粒をカラムに保持し、糖溶液を流過させ
るためにスクリーンを有した。乾物で各酵素の20gを個
々のカラムに注いだ。例71の組成を有するグルコース基
質をカラムを通して調整可能な実験室ポンプによりポン
プ輸送した。基質の温度は60℃に調整した。カラムを通
して出る生成物をフラクトースおよびグルコースについ
て分析した。基質流速が同じである場合、各異る酵素標
品は異るフラクトース含量を生成することを観察した。
各カラムの流速は各生成物のフラクトース含量が全糖
（グルコース＋フラクトース）の45％と同じになるまで
試行錯誤により個々に調整した。次表は45％フラクトー
スを生成するために酵素および相当する流速を表示す
る。
市販酵素を含むカラムの流速は本工業的実施で認めら
れるきわめて代表的なものを表わす。架橋結合イソメラ
ーゼ結晶を含むカラムの流速は実質的に一層高い。工業
的実際では、架橋結合結晶の高活性は本質的に一層小さ
い酵素カラム使用の結果となり、このように投資および
加工コストを節約できる。

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】可溶性グルコースイソメラーゼ結晶を架橋
    結合により水−不溶形に転換することを特徴とする、グ
    ルコースイソメラーゼ結晶。
  2. 【請求項２】水−不溶性架橋結合結晶酵素の製造方法に
    おいて、 （ａ） 結晶イソメラーゼサスペンジョンにジアルデヒ
    ドを添加し、その場合ジアルデヒドの添加前又は架橋結
    合反応中、アンモニウム塩、アミン又はアミノ酸のよう
    な少なくとも１個のアミノ基を含有する化合物をそこに
    添加し、そして （ｂ） 架橋結合結晶を水又は何か他の液体により洗滌
    して試薬残留物を除去することを特徴とする、上記水−
    不溶性架橋結合結晶酵素の製造方法。
  3. 【請求項３】グルコース含有溶液を水−不溶性架橋結合
    結晶グルコースイソメラーゼを含有する反応器を流過さ
    せることを特徴とする、フラクトースの連続製造方法。
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