JPH0257919B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は触媒として活性のある微生物の細胞を
寒天ゲル繊維に固定する方法に関する。 酵素を触媒としてそのままあるいは細胞内の形
で固定して使用することは化学工業における完全
な一つの態様となつてきた。固定化触媒は多くの
化学製品および食品の製造について開発されてお
り、アスパルターゼ、ペニシリンアシラーゼ、グ
ルコースイソメラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
α−アミラーゼおよびアミノアシラーゼのような
酵素系を含んでいる。そのような触媒の固定化は
一般に交叉結合したゲル内に抱合；中空繊維また
はマクロカプセル内に充填；不活性支持体または
イオン交換樹脂への吸着；多くの官能基を有する
試薬による交叉結合；および重合性支持体への共
有結合である。これら種々の方法およびそれらの
適用の例は文献及び論文（たとえばApplied
Biochemistry and Bioengineering Vol.L、
Immobilized Enzyme Principles）に多く示さ
れているのでここでは議論しない。これらの種々
の方法の工業への適用は、大規模操作のために選
択された支持マトリツクスが実際に得られるか否
かにかかつている。マトリツクスが良好な機械的
安定性および良好な流体力学的特性を有すること
により、長く使用しても支持体の圧縮、縮小化お
よび／または破裂が生じないことが工業上の適用
のためには特に重要である。上記支持体はまた適
当な透過性と表面積を有し固定化された触媒（酵
素）の活性が最大となり拡散抵抗が最小となるよ
うな構造でなければならない。 このような要求の答えるために、Chibata等
（米国特許第3791926）は合成タイプの重合体マト
リツクス（たとえばポリアクリルアミド）内に酵
素または微生物をとじ込める種々の方法を特にア
スパラギン酸の製造のために開発した。Nelson
（米国特許3957580）は同様に、他のタイプの合成
重合体系内に酵素含有微生物細胞をとじ込めるか
あるいは交叉結合する方法であつて該固定化細胞
がさらに重合体マトリツクスにグルタールアルデ
ヒドのような多官能性試薬により交叉結合されて
いる方法を報告した。これらのタイプの合成重合
体系は２つの主たる欠点を有する。第１は固定化
触媒の製造が毒性ある刺激性の物質（単量体、開
始剤、交叉結合剤等）を使用しなければならず、
このことが食品級製品の製造に問題を生ぜしめる
ことである。第２の支持体マトリツクスが大規模
カラム反応容器系の中で長期間使用していると変
形したり縮小化したりすることである。 ゲル内にとじ込められた固定化触媒の特性を改
善するために、Chibata等は硫酸エステル化多糖
類ゲル（カツパーカラゲン等）を支持体マトリツ
クスとして使用することを検討した（米国特許
4138292）。これらのタイプのゲルは種々の形（ビ
ーズ、膜等）で使用できる。これらの適用におけ
る限界は、多糖類が10重量％の硫酸基を有しなけ
ればならないこと及びゲル硬化剤（たとえば水溶
性有機アミンまたは原子量24を越える金属イオ
ン）を使用して安定なゲル支持体を確保しなけれ
ばならないことである。上述の文献には微生物を
とり込んだ寒天ゲルマトリツクス（特開昭50−
95470号）は特に40℃以上の温度ではゲルの形に
とどまつておらず、ゾルの形に変換していること
を示している。同様に、カラゲニンも上述のタイ
プのゲル硬化剤を使用して機械的安定性を維持し
なければ上述の寒天ゲルマトリツクスと同じく形
または構造を失うことを示している。 本発明者等は10重量／重量％未満の硫酸基を有
する寒天ゲルを使用することにより従来使用され
たゲル硬化剤を必要としない安定な触媒活性系が
得られることを見出した。さらに、このタイプの
系はカラム反応器中で“繊維触媒”の形で使用で
きその形を失わない。この新しく開発された固定
化方法の具体例としては、フマール酸アンモニウ
ム基質からＬ−アスパラギン酸を連続的流れ操作
で製造するための固定化細胞カラム反応器として
使用されるアスパルターゼ含有微生物を使用す
る。アスパラギン酸の工業的生産は一般にアスパ
ルターゼ含有微生物を使用して反応を行い１回使
用後捨てるバツチ発酵方法かあるいは連続的流れ
操作の中で繰返し使用できる固定化アスパルター
ゼ含有微生物の使用を含有している。後者の方法
は労働コストが低く、触媒が再使用できる形なの
でバツチタイプの系よりも一般に好ましいが、適
当に設計された（良好な活性、安定性等）固定化
細胞触媒が使用されるべきである。本発明はその
ような固定化細胞による触媒の生産を可能にする
ものである。 本発明の方法は他の固定化細胞の方法（たとえ
ばペニシリンアシラーゼ系）にも適用でき、酵素
そのものの固定化にも適用できる。実際の適用は
本発明を実施する者に依るであろう。 本発明は固定化が全細胞酵素を寒天ゲルの繊維
粒子内にとじ込めることにより行なわれる該固定
化された酵素含有微生物細胞の製造方法に関す
る。得られた繊維は次いで製品の連続的流れ操作
による製造のために適当に設計された反応器中で
使用できる。 本発明は下記段階(a)ないし(c)よりなる酵素含有
微生物の細胞を固定化する方法： (a) 上記細胞を約45〜60℃の温度で約1.0〜8.0重
量／重量％の硫酸残基を有する寒天溶液と接触
させ； (b) 無機ナトリウム塩の0.10〜5.0M溶液を約0゜〜
20℃の温度で、上記(a)で形成された混合物の流
れと接触させて細胞を含有する寒天繊維を形成
させ； (c) 上記細胞を含有する寒天繊維を回収する。 (a) 上記寒天が2.0〜3.0重量／重量％の硫酸残
基を有し、 (b) 上記無機ナトリウム塩の溶液が塩化ナトリ
ウムの3.0〜5.0M溶液であり、 (c) 上記の塩溶液が5゜〜15℃の温度である方法
が好ましい。 上記微生物細胞が酵素としてアスパルターゼ
（アスパラギン酸アンモニアリアーゼ）、ペニシリ
ンアシラーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、フマラーゼ、インベルター
ゼ、シス−トランスマレイン酸イソメラーゼ、ま
たはＬ−アスパルテートβ−デカルボキラーゼを
含有する方法が好ましい。アスパルターゼ含有微
生物細胞がバチラス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）種のものであり、一方、細胞がさ
らに処理される前にまず15゜〜45゜の温度でフマレ
ートまたはアスパルテートイオンの0.1〜2.0M溶
液と接触させる方法も好ましい。細胞含有寒天繊
維をフマール酸アンモニウムの0.1〜2.0M溶液と
PH8.0〜9.5で約25゜〜55℃の温度で接触させる方法
もさらに好ましい。 酵素含有細胞、好ましくはバチルス・メガテリ
ウム（Bacillus Megaterium）またはプロテウ
ス・レトゲリ（Proteus rettgeri）種の細胞を含
有する寒天繊維も本発明の方法によつて得られ
る。 ペニシリンアシラーゼ含有微生物細胞がプロテ
ウス・レトゲリ（Proteus rettgeri）種である方
法も好ましい。 本発明の方法を実施する際の、酵素含有微生物
細胞は繊維状寒天マトリツクス内にとじ込められ
る。寒天自体は種々の属の寒天産生海草から抽出
される天然多糖類複合体である。構造的には寒天
は種々のレベルの硫酸残基を含有するα（１−３）
およびβ（１−４）結合多糖類の複合体混合物で
ある。本発明で使用される寒天の特定組成は、１
〜８％、好ましくは２〜３％、もつとも好ましく
は約2.54重量／重量％の硫酸残基を含んでおり、
典型的には重量／重量％として、0.13％のカルシ
ウム、0.01％のバリウム、0.19％のケイ素、0.43
％の塩化物および0.17％の窒素を含有する。本発
明で使用される寒天の硫酸残基の割合は従来の他
の研究者の多糖類タイプの調製物に使用された10
（またはそれ以上）％の硫酸残基より少ないこと
に注目すべきである。 機械的に安定な支持体マトリツクスとして使用
できる寒天の特性は、高温で水性コロイド状“ゾ
ル”を形成し、冷却するとゲル網状組織に転換
し、ほとんどの酵素反応に使用する温度ではゾル
にもどらない能力である。 本発明に使用されるアスパルターゼ含有微生物
細胞はバチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）であり、これらの細胞はフマール
酸またはアスパラギン酸で前処理（ゲルにとり込
ませる前）して細胞内アスパルターゼ活性を増加
させることができる。とり込まれたアスパルター
ゼ含有バチルス・メガテリウム細胞の繊維状寒天
粒子は典型的には長さ1.9〜3.7cm、巾0.1〜0.2cm
である。形成した寒天繊維のサイズは処理条件を
変えることにより変化させられる。繊維状寒天に
とり込まれた細胞は1.5Mフマール酸アンモニウ
ム供給流からＬ−アスパラギン酸を連続的流れ操
作で製造するのに使用される。反応器内の至適条
件は、PH8.5〜9.0、温度37℃〜45℃、であつて、
98％のモル転化収率のレベルを達成するには（好
適）逆流供給速度1.5〜3.0床容量／時間を必要と
する。反応体カラム系の流体力学的特性に影響を
与えることなく連続的に操作できる。固定化され
た全細胞アスパルターゼ活性のとり込みは典型的
には遊離の全細胞活性70〜100％であり、触媒半
減期は少なくとも132日であり、277日間は活性が
高い。全細胞アスパルターゼを使用して本発明を
適用する具体例を下記に説明する。 典型的実験として、使用される寒天がデイフ
コ・ラボラトリーズ（ミシガン州デトロイト）製
の乾燥抽出物として得られ、2.54重量／重量％の
硫酸残基を含有していた。これを90℃〜100℃の
水に撹拌しながら溶解して水性寒天の５％コロイ
ド状ゾルを得た。このゾルの形成後、温度を45℃
〜60℃に低下させてからアスパルターゼ含有全細
胞を導入した。ゾルの温度を45℃以下に低下させ
ると寒天ゾルがゲル化する。60℃よりはるかに高
い温度は全細胞が寒天ゾルに添加されたとき細胞
内酵素の熱変性の可能性があるので避けなければ
ならない。アスパルターゼ含有バチルス・メガテ
リウムは遠心分離により濃縮細胞ペーストまたは
スラリーとして使用された。この細胞ペーストま
たはスラリーを0.25〜0.50容量部の水対1.0重量部
の細胞（湿時）と混合してもつて容易に加工し易
い細胞塊にする。この時点でアスパルターゼ含有
バチルス・メガテリウム細胞を任意にフマール酸
アンモニウム基質の1.5M溶液とインキユベート
できる。0.5重量部の細胞ペーストまたはスラリ
ー対1.0容量部の上記基質を使用して25℃で12〜
16時間保持すると観察される細胞内アスパルター
ゼ活性が３倍迄増加する。この観察される活性の
増加が固定化の際にも維持されると、至適生産性
のある反応器系の設計が可能となる。 細胞ペーストまたはスラリー（前処理または未
処理）は次いで寒天ゾルと混合する前に撹拌しな
がら45℃に加熱しなければならない。この細胞ペ
ーストまたはスラリーを次いで0.25〜0.75重量部
（湿時）の細胞対1.0容量部の５％寒天ゾルの比で
撹拌しながら加える。温度を混合段階の間45℃〜
60℃に維持してゲル化を防止する。均一な細胞と
寒天との混合物を、1.0〜12.0／時間の速度で
直径0.3175cm（0.125インチ）のノズルを通して
10℃〜15℃に維持され撹拌された0.10〜50M無機
ナトリウム塩溶液に注入する。この細胞と寒天の
混合物１容量部を４容量部の上記冷塩溶液に、寒
天と細胞の混合物の連続的添加流を維持するよう
な速度で注入する。上記撹拌された生理塩溶液の
表面に上記混合物の接触するやいなや、寒天の繊
維に細胞をとじ込めて固化したものが形成する。
寒天と細胞との混合物のすべてを上記塩溶液に加
えた後、触媒繊維をラツプ（Lapp）フイルター
を通して過して集め、1.0〜2.0容量の水で洗つ
た。触媒繊維中の湿めつた細胞の重量は触媒全重
量（湿時）の30〜40％である。次いで、触媒繊維
は、パツクされたベツドカラム反応器中での使用
に備えて1.5Mフマール酸アンモニウム基質溶液
中に入れておかなければならない。 固定化細胞カラム反応器の設計はＬ−アスパラ
ギン酸の産生が至適なるようなものにする。至適
触媒充填量は典型的には1.0容量部の反応器内空
間当り0.7重量部（湿時）の触媒繊維である。
1.5Mフマール酸アンモニウム基質溶液は1.5〜3.0
床容量（カラムの）／時間で、PH8.5〜9.0で37℃
〜45℃の温度でカラムに通す。良い設計のカラム
では代表的には98％のＬ−アスパラギン酸モル収
率が得られる。生成物は連続的結晶化によりカラ
ム溶出流から直接沈殿する。該連続的結晶化は、
溶出流のPHを硫酸によつて3.2に調節し、得られ
たＬ−アスパラギン酸結晶を30分間顆粒化させる
ことによる。 本発明は種々の酵素系に等しく適用できる。た
とえば、ペニシリンアシラーゼ、グルコースイソ
メラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フマラー
ゼ、インベルターゼ、シス−トランスマレイン酸
イソメラーゼ、およびＬ−アスパテートβ−デカ
ルボキシラーゼなどが本発明の方法によつて固定
化できる。ペニシリンアシラーゼが必要な場合、
プロテウス・レツトゲリの細胞が使用される。グ
ルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、フマラーゼ、インベルターゼ、シス−トラン
スマレイン酸イソメラーゼまたはＬ−アスパルテ
ートβ−デカルボキシラーゼを含有する細胞の固
定化が望ましいときは、使用できる微生物はスト
レプトマイセス（Streptomyces）、バチルス
（Bacillus）、アセトバクター（Acetobacter）、シ
ユードモナス（Psoudomonas）およびアスペル
ギルス（Aspergillus）属の微生物である。この
タイプの微生物は必然的に無傷の生細胞ではない
が、本発明で使用する前に物理的または化学的に
処理できる。本発明の方法によつて寒天繊維中に
細胞外の酵素すなわち酵素そのものをとじ込める
ことも可能である。 本発明の方法の態様は下記例によつて詳しく説
明される。 例 １ NZアミンＢとコーンステイープリカー基質で
28℃、PH8.5で18時間好気条件下に生育させたバ
チルス・メガテリウム（Bacillus Megaterium）
（ATCC21209）発酵プロスを15000ｇで15分間遠
心分離した。遠心分離した細胞重量（湿時）は発
酵プロスリツトル当り34.7ｇであつた。細胞を固
定化する前に、56.0ｇの湿つた細胞を約100mlの
1.5Mフマール酸アンモニウム溶液中で16時間25
℃に保持した。この懸濁液を次いで15000ｇで15
分間遠心分離した。湿つた細胞収量は38.0ｇ（す
なわちフマール酸アンモニウム基質中でインキユ
ベーシヨンしたとき得られた細胞の湿時重量の32
％が損失した。）これらの処理された細胞のアス
パルターゼ活性は湿つた細胞１ｇ当り１時間当り
生成された約5.17ｇのＬ−アスパラギン酸であつ
た。 90℃〜95℃の水63mlに、3.3ｇのバクト−アガ
ール（Bacto−Agar）（ミシガン州デトロイトの
デイフコラボラトリーズ製）を加え、この混合物
をコロイド状のゾルが形成するまで90℃〜95℃で
撹拌した。次いでこのゾルを撹拌しながらゆつく
りと55℃〜60℃に冷却した。５％寒天ゾルの55℃
における粘度は640センチポイズであつた。 上記バクトアガールの組成は下記のとおりであ
る。（以下の実施例で使用されたバクトアガール
も同じ組成を有する。）

【表】 処理されたバチルス・メガテリウム細胞35ｇに
9.0mlの水を加え、細胞スラリーを撹拌しながら
45゜〜50℃に加温した。この加熱した細胞スラリ
ーを次いで撹拌しながら且つ温度を50℃以上に維
持しながら５％寒天ゾルに加えた。細胞寒天懸濁
液をよく混合して細胞を均一に分散させた。 細胞−寒天懸濁液を55℃に維持し、直径0.3175
cm（0.125インチ）のノズルを通して約１リツト
ル／時間の速度で10゜〜15℃に維持され撹拌され
た3.0M塩化ナトリウムの溶液440mlに注入した。
固定化アスパルターゼを含有するバチルス・メガ
テリウム細胞を寒天繊維内にとじ込めたものは、
上記寒天−細胞懸濁液を冷生理塩溶液の表面と接
触させるとすぐ形成した。この細胞を固定化した
繊維をラツプ（Lapp）フイルターで取し、水
で洗つた。この触媒繊維の湿時重量は106ｇでそ
のうち約33％（35.0ｇ）は固定化されたバチル
ス・メガテリウム細胞であつた。 触媒繊維のアスパルターゼ活性は、ゲル１ｇ当
り時間当り生成されたＬ−アスパラギン酸約1.68
ｇ、すなわち固定化細胞１ｇ（湿時）当り時間当
り生成されたＬ−アスパラギン酸5.08ｇであつ
た。したがつ寒天−触媒繊維中の活性の保持は処
理された未固定化全細胞の活性の98.2％であつ
た。 この触媒繊維をカラム反応器で使用するまでフ
マール酸アンモニウム基質中に保持した。 例 ２ 例１において調製されたアスパルターゼ含有触
媒繊維95ｇを147ml（2.5cm×30cm）のジヤケツト
付ガラスカラムに充填した。45℃に維持した水を
上記カラムのジヤケツトに還流させ、1.5Mフマ
ール酸アンモニウム基質溶液（1.0ミリモルMg⁺⁺
イオン含有）を前以つて加熱するのに使用した。
前以つて加熱された基質をカラムを通して7.35
ml／分（3.0床容量／時間）の速度で注入（上か
ら下へ）し、溶出物を集めた。溶出物をHPLC
（高速液体クロマトグラフイー）で分析したとこ
ろＬ−アスパラギン酸が98.3％のモル収率で生成
していることがわかつた。58％硫酸溶液で抽出物
をPH調節（3.2に）することによつて生成したＬ
−アスパラギン酸を回収した。回収率は、結晶化
と顆粒化温度（45℃〜25℃）に依つて84％〜94％
（乾燥時重量）であつた。 例 ３ グルコース基質の上で28℃でPH6.8〜7.0で好気
条件下に生育させたプロテウス・レツトゲリ
（Proteus rettgeri）〔ATCC31052（ATCC9250）〕
の培養物を遠心分離し、分離した細胞を水で洗つ
た。洗つた細胞50ｇ（湿時）25mlの水と混合し、
細胞スラリーを45℃に加熱した。５％寒天水溶液
（バクト−アガール（Bacto−Agar）（デイフコ
製）100mlを95℃で調製し55℃に冷却した。前以
つて加熱したプロテツス・レツトゲリ（Proteus
rettgeri）・の細胞スラリーを寒天溶液と混合し、
温度を55℃に維持した。寒天と細胞のスラリーを
口経0.3175cm（0.125インチ）の供給チユーブを
通して1.0リツトル／時間の速度で700mlの撹拌さ
れ５〜10℃に維持された3.0M塩化ナトリウム水
溶液に注入した。ペニシリン−アシラーゼを含有
するプロテウス・レツトゲリ（Proteus
rettgeri）細胞を寒天繊維にとり込んだものは寒
天と細胞のスラリーを上記生理食塩水と接触させ
るとすぐ形成した。この繊維の湿時重量は173ｇ
であつた。 ペニシリンアシラーゼの活性についての研究は
22.8ｇの繊維を5.6cm×3.3cmのシリンダー状のガ
ラス反応器に充填された繊維触媒について行つ
た。この反応器の温度は37℃に維持され、10重
量／重量％のペニシリンＧカリウム塩（PH8.0）
溶液1.0リツトルを前以つて37℃に加熱し、22.1
〜48.7床容量／時間（29.9〜65.9ml／分）の流速
で反応器に通つて再循環させた。水酸化アンモニ
ウム（1.0N）を再循環させたペニシリンＧ基質
に加えてPHを8.0に維持した。そして反応の進行
は、添加された水酸化アンモニウムの量を監視す
ること及び残留するペニシリンＧをHPLC分析す
ることにより追跡された。反応器を３時間操作し
た後の転化収率は19％であつた。 本発明の方法において硫酸残基1.0〜8.0％を含
有する寒天ポリサツカライドを使用することによ
つてもたらされる有利な効果は、上述の如く、有
機アミンや原子量24より大な金属イオンのような
ゲル硬化剤を存在させる必要がない点である。元
来、固定化触媒による食品の製造は毒性ある刺激
物（たとえばアミン類）あるいは金属イオンの不
存在下に行なわれるべきである。そのような刺激
物は最終生成物の品質を低下させ、金属イオンは
固定化触媒の活性を失活するからである。 本発明は、硬化剤を必要とせずしかも硫酸残基
を1.0〜8.0重量％にとどめることによつて、固定
化触媒活性を低下させることなく高品質無毒性の
食品を得ることができるという顕著な効果を奏す
るものである。このような本発明により、微生物
固定化技術の適用可能範囲を拡大できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記段階(a)ないし(c)よりなる酵素含有微生物
   の細胞を固定化する方法： (a) 上記細胞を約45°〜60℃の温度で約1.0〜8.0重
   量／重量％の硫酸残基を有する寒天水溶液と接
   触させ； (b) 無機ナトリウム塩の0.10〜5.0M溶液を約0゜〜
   20℃の温度で、上記(a)で形成された混合物の流
   れと接触させて細胞を含有する寒天繊維を形成
   させ； (c) 上記細胞を含有する寒天繊維を回収する。 ２ (a) 上記寒天が2.0〜3.0重量／重量％の硫酸
   残基を有し、 (b) 上記無機ナトリウム塩の溶液が塩化ナトリウ
   ムの3.0〜5.0M溶液であり、 (c) 上記の塩溶液が5゜〜15℃の温度である特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３ 上記微生物の細胞がアスパルターゼ（アスパ
   ラギン酸アンモニアリアーゼ）を含有している特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 微生物の細胞がペニシリンアシラーゼを含有
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ アスパルターゼを含有する微生物細胞がバチ
   ルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）の
   ものである特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６ 上記ペニシリンアシラーゼ含有微生物細胞が
   プロテウス・レツドゲリ（Proteus rettgeri）の
   ものである特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７ バチルス・メガテリウム（Bacillus
   megaterium）のアスパルターゼ含有細胞を、ま
   ず最初にフマレートまたはアスパルテートイオン
   の0.1〜2.0M溶液と15〜45℃で接触させる特許請
   求の範囲第３項の方法。 ８ 細胞含有寒天繊維をPH8.0〜9.5で約25゜〜55℃
   の温度でフマール酸アンモニウムの0.1〜2.0M溶
   液と接触させる特許請求の範囲第３項記載の方
   法。