KR20000011105A - 고정된 미생물에 의한 이소말툴로즈의 제조방법 및 제조용 담체 - Google Patents

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마르자-리나 사크키
하이크키 하이크킬래
타피오 빌자바
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쿠르키넨 유하, 니일롤라 요르마
자이로핀 오와이
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Abstract

본 발명은 생존가능한 고정된 이소말툴로즈 형성 미생물의 도움으로 슈크로즈를 이소말툴로즈로 이성체화하는 방법에 관한 것이다. 미생물 세포는 과립의 음이온 교환 물질을 포함하는 담체 물질에 고정된다. 생성된 이소말툴로즈는 감미용의 이소말트를 제조하는 데 사용될 수 있다.

Description

고정된 미생물에 의한 이소말툴로즈의 제조방법 및 제조용 담체
본 발명은 생존가능한 고정된 이소말툴로즈 형성 미생물의 도움으로 슈크로즈를 이소말툴로즈로 이성체화시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 음이온 교환 물질을 포함하고 그 위에 고정된 생존가능한 이소말툴로즈 형성 미생물 세포를 갖는 담체 물질에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 슈크로즈로부터 이소말툴로즈를 경유하여 이소말트를 제조하는 것에 관한 것이다.
이소말툴로즈(또는 팔라티노즈)는 분류명이 6-O-α-D-글루코피라노실-D-프룩토푸라노즈인 환원 디사카라이드이다. 이소말툴로즈는 식품 산업에서 감미제로서 사용할 것이 제안되어 왔고, 수소화 반응에 의해 이소말트(팔라티니트)를 제조하는 원료이다. 이소말트는 실질적으로 등몰의 α-D-글루코피라노실-(1,6)-소르비톨과 α-D-글루코피라노실-(1,6)-만니톨 혼합물이다. 이소말트는 온화한 감미향을 갖는 비카리에스 유발성의 특별한 감미 향료이다.
슈크로즈를 이소말툴로즈로 이성체화하는 각종 방법이 보고되어 있다. 이성체화는 프로타미노박터 루브룸(Protaminobacter rubrum), 세라티카 플리무티카(Serratica plymuthica), 에르비니아 라폰티시(Erwinia rhapontici) 등과 같은 미생물에 존재하는 것으로 발견된 α-글루코실 트랜스퍼라제(사카로즈 무타제) 효소에 의해 수행되는 것으로 여겨진다. 공지된 이성체화 기술은 생존가능하거나 죽은 미생물 세포로 이성체화하거나 추출된 형태의 효소로 이성체화한다. 다양한 효소의 고정화 기술이 또한 보고되어 있다.
따라서, 예를 들면, EP-B1 제0 028 900호는 다양한 이성체화 미생물, 바람직하게는 E. 라폰티시의 효소의 고정화를 제안한다. 바람직한 고정화 기술은 죽은 미생물 세포를 칼슘 알기네이트 펠릿 내에 포획(entrapping)함을 포함한다. 디에틸아미노에틸 셀룰로즈(DEAE-셀룰로즈)의 농후한 수성 슬러리에서의 고정화도 기재되어 있으나 보다 불량한 결과를 제공하는 것으로 보고되어 있다.
US 제4,386,158호에는 α-글루코실 트랜스퍼라제를 고정하는 데 사용되는 칼슘 알기네이트 겔의 물리적 강도를 폴리에틸렌이민과 글루타르알데하이드로 처리함으로써 향상시키는 것이 기재되어 있다.
US 제4,640,894호는 P. 루브룸의 고정된 죽은 세포를 포함하는 반응기를 사용함으로써 이소말툴로즈를 제조하는 것을 기술하고 있다. 겔 중의 포획 및 응집제로의 응집과 같은 다양한 고정화 기술이 기재되어 있다.
US 제4,337,313호 및 EP-B 제0 077 971호에는 탄닌과 장쇄 폴리아민으로 응집시키고 에피할로하이드린/폴리아민 공중합체 부가물과 글루타르알데하이드를 반응시켜 건조시킴으로써 P. 루브룸의 생존 세포를 고정화하는 것이 기재되어 있다.
EP-B 제0 049 801호에는 중공 섬유 또는 양이온 교환 수지와 같은 다양한 담체 물질 상에서의 P. 루브룸으로부터 분리된 슈크로즈 전환 효소의 고정화가 기재되어 있다.
EP-B 제0 200 069호에는 음이온성 담체 물질, 특히 설폰산 양이온 교환 매트릭스 상에서의 추출된 사카로즈 무타제 효소의 선택적인 고정화가 기재되어 있다.
EP-A 제0 160 253호에는 중합 동안 중합체 시스템에 포획시킴으로써 P. 루브룸 세포를 고정시켜 슈크로즈를 이소말툴로즈로 전환시키기 위한 생체 촉매물을 제공하는 것이 기재되어 있다.
슈크로즈를 이소말툴로즈로 전환시키기 위한 선행 기술 방법은 전적으로 만족스럽지 않다. 일반적으로 담체 물질은 현장에서(on-site) 제조된다. 고정화 공정은 복잡하고 민감한 효소를 상하게 하지 않도록 주의해서 수행해야 한다. 알기네이트 또는 카라게난 겔 속에 포획시키기 위해서 몇몇의 분리된 공정 단계를 수행할 것이 요구되고 글루타르알데하이드로의 최종 가교가 종종 필요하다. 용액 속에서 응집제로 응집시키는 선행 기술은 건조, 압출 및 과립화를 포함하여, 효소를 포함시키는 몇가지 후속적인 제조 단계를 필요로 한다. 중합 동안 중합체에 효소를 포함시키는 것은 물리적으로 강한 생성물을 제공할 수는 있으나 이러한 공정은 또한 복잡하고 민감한 효소의 활성에 영향을 미칠 수 있다.
담체 매트릭스 자체를 제조하는 동안 담체에 생존가능하거나 죽은 미생물 세포를 포함시키는 선행 기술 방법에서의 추가의 단점은 활성이 상실되는 경우 전체 담체를 폐기해야 한다는 사실이다.
본 발명의 목적은 이소말툴로즈 형성 미생물을 고정화하는 선행 기술의 단점을 극복하고, 슈크로즈로부터 이소말툴로즈 및 이소말트를 제조하기 위한 기술적으로 편리한 공정을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은, 미생물을 고체 담체를 제조하기 위해서 필요한 반응 등에 노출시키지 않고서 고정된 생존가능한 미생물에 의해 슈크로즈를 이소말툴로즈로 전환시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 이소말툴로즈 형성 미생물의 생존 세포를 담체 물질에 고정시키는 것이 기술적으로 복잡하지 않은 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 패킹된 칼럼에서 슈크로즈를 이소말툴로즈로 전환시키기 위한 연속 공정을 제공하는 것이며, 여기서, 고정된 세포는 제조 동안 쉽게 재신선화하거나 재활성화시킬 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 물리적 강도가 우수하고 슈크로즈 용액이 당해 칼럼을 통하여 유동할 때 낮은 압력 저하만을 발생시키는, 담체를 포함하는 패킹된 칼럼에서 이소말툴로즈를 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 특별한 목적은, 담체를 사용 후 재생시킬 수 있는, 이소말툴로즈 형성 생존가능한 미생물 세포를 함유하는 담체 시스템을 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
놀랍게도 생존가능한 미생물 세포에 의해 슈크로즈를 이소말툴로즈로 전환시키기 위한 기술적으로 복잡하지 않은 방법을 담체로서 약염기성 음이온 교환 특성을 갖는 고체 다공성 물질을 사용함으로써 제공할 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 첨부된 청구항으로 한정된다.
따라서, 본 발명은 음이온 교환 물질에 고정된 생존가능한 이소말툴로즈 형성 미생물 세포의 도움으로 슈크로즈를 이소말툴로즈로 이성체화하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법에서, 슈크로즈 함유 용액을 불활성이고 실질적으로 비압축성 고체 매트릭스 형태의 약염기성 음이온 교환 물질을 포함하는 다공성 입상 담체 물질에 고정시킨 이소말툴로즈 형성 미생물 세포와 접촉시킨 다음 이성체화 생성물을 용액으로부터 회수한다.
본 발명의 방법은 배치식 또는 연속식 공정으로서 수행될 수 있다. 바람직하게는 연속식 공정은 담체로 패킹된 칼럼에서 수행한다.
생존가능한 미생물 세포는 바람직하게는 담체 매트릭스를 형성시킨 후 다공성 담체의 표면에 고정시킨다. 담체는, 예를 들면, 칼럼을 통해 영양소 및/또는 성장 배지를 공급함으로써 연속적으로 또는 간헐적으로 재신선화시킬 수 있다.
특별히 바람직한 양태에 따라, 담체 물질은 사용 후에 모든 미생물 세포를 제거하고 세척하여 신선한 생존 세포로 재로딩함으로써 재생시킬 수 있다.
또한 본 발명은 슈크로즈로부터 이소말트를 제조하는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 슈크로즈 함유 용액을, 불활성이고 실질적으로 비압축성 고체 매트릭스 형태의 약염기성 음이온 교환 물질을 포함하는 다공성 입상 담체 물질에 고정된 생존가능한 이소말툴로즈 형성 미생물 세포와 접촉시키는 단계, 당해 이소말툴로즈를 이소말트로 수소화시키는 단계 및 이소말트를 회수하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 슈크로즈로부터 이소말툴로즈 및/또는 이소말트를 제조하는 공정에 사용하기 위한 담체를 제공하며, 당해 담체는 이의 표면에 고정된 생존가능한 이소말툴로즈 형성 미생물 세포를 갖는 불활성이고 실질적으로 비압축성 고체 매트릭스 형태의 약염기성 음이온 교환 물질을 포함하는 다공성 입상 물질을 포함한다.
본 명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같이 용어 "이소말툴로즈 형성 미생물"은 슈크로즈를 이소말툴로즈로 전환시킬 수 있고 약염기성 음이온 교환 담체 물질의 표면에 고정될 수 있는 임의의 미생물을 의미한다. 이러한 미생물의 예는, 이에 제한되지 않고서, 앞에서 언급한 선행 기술 특허 명세서에 언급되어 있는 미생물이 포함된다. 특별히 바람직한 미생물은 프로타미노박터 루브룸(CBS 574.77)이며, 이는 매우 효과적이고 식품 성분의 제조에 안전하게 사용될 수 있기 때문이다. 예를 들면, 세라티아 플리무티카 및 에르비니아 라폰티시로도 우수한 결과를 얻을 수 있으나, 이러한 미생물은 병원성이 있기 때문에 사용하기에 덜 안전하다. 또한 기타 적합한 이소말툴로즈 형성 미생물은 당해 기술분야의 숙련가에게는 명백한 바와 같이 다양한 기술에 의해 사탕무 또는 유사한 공급원으로부터 분리할 수 있거나 이와 같은 미생물로부터 유래할 수 있다.
본 발명에서 담체로서 유용한 음이온 교환 물질은 흡착에 의해 생존 미생물 세포에 결합하는 데 적합한 음이온 교환 용량을 갖는다. 약염기성 음이온 교환체가 바람직하다.
약염기성 음이온 교환체는 1급 및/또는 2급 및/또는 3급 아미노 그룹을 갖는 물질이다. 이들은 산성 용액에서 해리되고 교환 능력을 가진다. 3급 아미노 그룹을 갖는 물질은 보다 염기성이고, 또한 이들은 중간 염기성 음이온 교환체로 칭한다.
담체는 슈크로즈가 이소말툴로즈로 전환되는데 영향을 미치지 않아야 한다는 점에서 불활성이어야 한다. 그러나, 담체는 바람직하게는 이의 표면에 대한 미생물 세포의 결합을 촉진해야 한다.
본 발명에 따라 담체에 사용되는 용어 "다공성"은, 고체 담체가, 예를 들면, 대략 동일한 반경을 갖는 구의 표면적에 비하여 보다 큰 표면적을 제공하는 다수의 중공 및 기공을 포함함을 의미한다.
명서세 및 청구항에 사용된 바와 같이 용어 "실질적으로 비압축성"은 고체 담체가 전환 공정 동안 우세한 압력에서 어떠한 식별가능한 정도로도 변형되지 않음을 의미한다. 이는 선행 기술분야에서 사용된 변형가능한 알기네이트 겔 펠릿과 뚜렷하게 구별된다.
본 발명의 담체 물질은 내변형성이고 큰 압력 저하를 유발하지 않으면서 칼럼을 통해 슈크로즈 용액을 유동할 수 있게 하는 고체 다공성 매트릭스이어야 한다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 담체 물질은 고체 과립 또는 입자 형태의 약염기성 음이온 교환체이다. 이러한 유형의 시판 담체의 예는 본원 명세서의 실시예에서 사용된 것들이다. 바람직하게는 담체 물질 입자는 일반적으로 구형이어서 보다 적은 내유동성을 제공한다. 또한 바람직하게는 담체 물질은 큰 표면적을 제공하기 위해서 거대 다공성이어야 한다.
본 발명의 바람직한 담체 물질은, 본원에서 참조로 인용하는 문헌인 US 특허 제4,335,117호에 기술된 바와 같이, 폴리스티렌과 함께 응집된 미세섬유 또는 미세입자를 포함하는 디에틸아미노에틸 개질된 셀룰로즈(DEAE 셀룰로즈) 형태의 약염기성 음이온 교환 물질을 포함한다.
표면적이 큰 다공성 담체 물질 평태의 약염기성 음이온 교환체를 사용하는 잇점은 미생물이 담체 표면에 고정되고 알기네이트 겔 및 동일반응계 내에서 형성된 중합체의 경우에서와 같이 담체 물질내에 포획되지 않는다는 것이다.
생존가능한 미생물 세포는 일반적으로 전환 부위에서 담체 물질에 고정된다. 그러나, 담체 물질은 또한 사용하기 전에 미생물 세포로 로딩할 수 있고, 로딩된 담체는 저장할 수 있거나 또 다른 위치에서 사용하기 위해서 수송할 수 있다. 본 발명의 한 양태는, 실제로, 생존가능한 이소말툴로즈 형성 미생물 세포를 포함하는 다공성 고체 담체 물질에 관한 것이다.
본 발명의 제3 양태는 고정된 생존가능한 미생물 세포를 사용하는 전환 공정에 의해 슈크로즈로부터 제조된 이소말툴로즈를 수소화시킴으로써 이소말트를 제조하는 것에 관한 것이다.
배치 또는 칼럼에서 반응 후, 이소말툴로즈를 정제하고 반응 용액으로부터 회수할 수 있다. 예를 들면, 이소말툴로즈는 이온 교환에 의해 정제하여 불순물 및 부산물을 제거하고 결정을 냉각시킴으로써 결정화한다. 수소화 반응은, 예를 들면, 촉매로서 라니 니켈을 사용하여 용액 속에서(30 내지 50w/w%) 촉매적 수소화 반응으로 수행할 수 있다. 온도는 일반적으로 약 100 내지 130℃, 수소 압력은 약 40 내지 100kg/cm2, 공정 시간은 약 3 내지 10시간으로 조절한다.
수소화 반응이 완결된 후 촉매는 반응 용액으로부터 분리한다. 용액은 여과하고, 경우에 따라, 생성된 이소말트는 이온 교환에 의해 다시 정제할 수 있다. 이소말트는 액체 형태로 사용할 수 있거나, 당해 기술분야의 숙련가에세 널리 공지된 방법으로 용액으로부터 회수할 수도 있다. 대안으로서, 결정화와 정제를 진행시키지 않고서 이소말툴로즈를 이소말트로 수소화시킬 수 있다.
슈크로즈를 이소말툴로즈로 전환시키기 위한 본 발명에 따르는 방법은 입상 담체에 고정된 생존가능한 미생물 세포를 포함하는 반응 탱크에서 배치식 공정으로서 수행할 수 있다. 슈크로즈가 80% 이상 전환되는 충분한 반응 시간 후에, 고체 담체는 여과에 의해 용액으로부터 제거할 수 있다. 반응 후 용액은 반응 주 생성물로서의 이소말툴로즈, 약간의 트레할룰로즈, 프룩토즈 및 글루코즈 뿐만 아니라 약간의 미반응 슈크로즈를 함유한다.
바람직한 방법에 있어서, 공정은 담체로 패킹된 칼럼에서 연속 공정으로서 수행된다. 예를 들면, 한 칼럼을 재생시키는 동안 다른 칼럼은 작동시키기 위해서, 직렬식으로 및/또는 병렬식으로 연결된 몇 개의 칼럼이 있을 수 있다. 또한 슈크로즈 용액은 전환율을 증가시키기 위해서 하나 또는 몇 개의 칼럼을 통해 재순환시킬 수 있다.
담체는 이의 표면에 고정된 미생물 세포(이소말툴로즈 형성 미생물 세포)를 함유하는 생존가능한 글루코실트랜스퍼라제 효소를 포함한다. 담체 표면에 미생물을 고정시키는 것은 담체로 패킹된 칼럼을 통해 세포 현탁액을 공급함으로써 "칼럼 위 로딩(on column loading)"을 통해 또는 진탕 플라스크 또는 유사 용기 속에서 번식 동안 배양 배지에 담체를 도입함으로써 "진탕 플라스크 로딩(in shake flask loading)"을 통해 수행할 수 있다.
추가로 양 방법에서, 칼럼을 통해 신선한 영양소 배지를 공급함으로써 칼럼에의 로딩을 증가시키는 것이 바람직하다.
"칼럼 위 로딩"은 칼럼을 어떤 고정화가 일어나기 전에 새로운 담체 물질로 패킹시킨다. 미생물로의 로딩은 용이하고 고정화가 일어난 후에는 어떠한 추가의 반응 단계도 필요하지 않다. 따라서, 미생물은 어떠한 엄중한 처리 조건에도 노출되지 않는다.
담체에 미생물 세포를 고정화하는 것은, 경우에 따라, 용액에 글루타르알데하이드와 같은 가교제를 첨가함으로써 증가시킬 수 있다. 또한 선행 기술에 공지된 것과 같은 응집제를 가할 수도 있다. 응집은 전환율을 증가시키고 고정된 시스템의 반감기를 지속시키는 것으로 발견되었다. 그러나, 본 발명에서의 응집은 고체 담체 매트릭스에 고정된 미생물 세포로 수행하기 때문에 어떠한 건조 단계도 필요하지 않다. 응집되고 가교된 담체는 그대로 즉시 사용할 수 있다.
반응은 바람직하게는 패킹된 칼럼에서 25 내지 35℃, 바람직하게는 약 30℃의 최적 온도에서 수행한다. 35 내지 45℃의 온도는 부분적으로 불활성화시키는 것으로 증명되었다. 55℃ 이상의 온도는 24시간 내에 P. 루브룸을 완전히 불활성화시킨다.
정제된 형태 또는 당밀로서의 슈크로즈를 함유하는 용액을 패킹된 칼럼을 통해, 바람직하게는 CO2제거를 촉진시키기 위해서 하단에서부터 상단까지 유동시키며, 이는 임의의 통기 공기와 함께 칼럼의 상단까지 유동한다.
용액의 슈크로즈 농도는 바람직하게는 약 20 내지 40%, 보다 바람직하게는 25 내지 35%로 유지되어야 한다. 55% 이상의 슈크로즈 농도는 단시간 동안 전환율을 상당히 감소시키는 것으로 발견되었다. 슈크로즈 용액의 pH는 바람직하게는 약 4 내지 8, 보다 바람직하게는 5.5 내지 7로 유지되어야 한다.
슈크로즈 용액의 유속은 슈크로즈의 이소말툴로즈로의 매우 높은 전환율을 제공하기 위해서 아주 느릴 수 있음에도 불구하고, 공업 공정은 바람직하게는 반응기 용적을 줄이기 위해서 최대 전환율 미만에서 작동시킨다. 대부분의 적용에서 약 80% 이상의 전환율이 적합하다. 이성체화는 이소말툴로즈 수율이 떨어질 때까지 계속할 수 있다. 때때로 영양소를 칼럼에 공급함으로써 미생물 활성을 재신선화하는 것이 바람직하거나 필요하다. 낮은 영양소를 일정하게 공급할 수도 있다.
본 발명에 따르는 공정의 바람직한 양태에 따라, 이성체화는 약염기성 음이온 교환 특성을 갖는 실질적으로 비압축성인 담체의 표면에 결합된 고정된 미생물 세포를 함유하는 패킹된 칼럼 반응기에서 연속 공정으로 수행한다. 담체는 바람직하게는 연속적인 다공성 상(bed)으로 구성되거나, 대체하여 움푹 들어가거나 망상의 다공성 과립으로 구성된다. 매트릭스 또는 과립은 개개의 미세입자 또는 미세섬유로 구성될 수 있다. 이러한 담체 구조는 미생물 세포의 고정화를 위해서 매우 큰 표면적을 제공한다.
바람직한 담체의 입상 물질 또는 매트릭스 특징은 미세섬유, 미세과립, 미세구, 미세비드 등을 포함하는 개개의 미세입자와 함께 느슨하게 결합, 펠팅, 제직, 접착 또는 응집시킴으로써 생성된다. 개개의 미세입자 사이의 몇몇 접촉점에서 화학적 접착 또는 기계적 결합을 설정함으로써 결합시킨다. 화학 결합은 이 지점에서 화학 가교 반응을 발생시킴으로써 수행한다. 접착성 결합은 열가소성 수지와 같은 추가의 성분을 사용함으로써 미세입자를 함께 응집시키거나 접착시킴으로써 수행한다. 기계적 결합은 접촉점에서 섬유를 엉키게 하거나 매듭이 생기게 하거나 이들의 표면을 함께 엉키게 하여 입자들을 연결시킴으로써 수행한다. 후자 형태에 있어서, 매트릭스는, 마치 튜브에 패킹된 여과지의 면 보풀과 같이, 반응기 전체를 통해 연속적인 구조를 포함할 것이다. 또한 이러한 경우에, 이들의 최종 형태에 있어서, 입자는 분리되고 개별적이다.
미세입자는 목적하는 거친 표면의 미세입자로 형성될 수 있는 약염기성 음이온 교환 물질로 구성된다. 이러한 물질은 음이온 교환 특성(페놀포름알데하이드 수지, 아크릴 수지 및 폴리스티렌 수지와 같은 합성 음이온 교환 수지 뿐만 아니라 아가로스 또는 덱스트린계 음이온 교환 수지)을 제공하기 위해서 유도된 천연 또는 재생 셀룰로즈 또는 레이온을 포함한다. 바람직한 담체는 음이온 교환 특성을 제공하기 위해서 화학적으로 개질된 셀룰로즈 또는 레이온으로부터 유도된 다공성의 입상 음이온 교환 물질이다. 특히 바람직한 양태는 응집에 의해 폴리스티렌과 부착될 수 있게 결합된 디에틸아미노에틸 치환된 셀룰로즈의 미세섬유 또는 미세입자를 포함한다.
양하전된 수지와 음하전된 미생물 세포 사이에 확립된 전기장은 주로 미생물 세포를 수지의 표면에 결합시키는 것으로 생각된다. 이러한 결합은 실질적으로 미생물의 침출을 감소시키는 반면, 미생물과 슈크로즈 용액 사이를 친밀하게 접촉되게 한다.
위에 제공된 종류의 약염기성 음이온 교환체는 슈크로즈를 이소말툴로즈로 전환시키기 위한 안정되고 활성이 있는 담체 물질을 제공하는 데 특히 유리함이 증명되었다. 이러한 담체는 고체이고 변형되지 않으며, 긴 작동 수명과 낮은 내유동성을 제공한다. 이들은 표면적이 크기 때문에 전환을 위해 제공되는 용적 단위당 미생물 개체군이 많다.
본 발명의 담체 시스템의 특별한 장점은, 몇회의 재신선화 사이클 후 전환율이 떨어지는 경우, 담체를 재생하고 재로딩하며 새로이 사용할 수 있다는 것이다. 이는 특히 본 발명의 바람직한 담체, 즉 고체 폴리스티렌 매트릭스를 포함하는 DEAE-개질된 셀룰로즈를 사용하는 경우 그러하다. 그러나, 글루타르알데하이드로 가교시키는 경우에 있어서 재생이 복잡할 수 있다.
이제 본 발명은 다음의 제한하지 않는 실시예로 상세하게 설명하고자 한다.
실시예 1
고정용 담체(DEAE)의 제조
과립의 유도된 셀룰로즈는 US 특허 제4,355,117호에 따라 다음과 같이 제조한다.
섬유상 셀룰로즈 25부를 이산화티탄 25부와 혼합하고, 혼합물을 이축 압출기를 사용하여 식품 등급의 고 내충격성 폴리스티렌 50부와 배합한다. 압출물을 물로 냉각시키고 0.35 내지 0.85mm의 입자 크기로 체 친다.
체 친 과립의 응집된 셀룰로즈 입자를 위에서 언급한 US 특허에 기술된 바와 같이 유도체화하여 DEAE-셀룰로즈를 형성시킨다.
제조된 과립 DEAE 셀룰로즈 20g을 5시간 동안 증류수에 침지시킴으로써 수화시킨다. 수화된 DEAE-셀룰로즈 담체는 1시간 동안 에탄올(75%)에 침지시킴으로써 소독하고 멸균 유리 칼럼(높이 60cm, 직경 1.5cm)에 옮기기 전에 멸균수로 세정한다.
프로타미노박터 루브룸(CBS 574.77)의 세포 현탁액 제조
프로타미노박터 루브룸 균주(CBS 574.77)의 배양균으로부터의 세포를 식염수 10㎖로 희석시킨다. 생성된 현탁액의 앨리쿼트 0.1㎖를 1000㎖ 멸균 진탕 플라스크에서 성장 배지 300㎖를 접종하는 데 사용한다. 배지는 다음과 같다: 슈크로즈 40g/ℓ, 펩톤 10g/ℓ, 이스트 추출물 5g/ℓ, 육류 추출물 3g/ℓ, Na2HPO42g/ℓ, pH 7. 접종시킨 플라스크 3x300㎖를 30℃에서 230rpm으로 20시간 동안 진탕시켜 109세포/㎖ 이상의 농도가 되게 한다.
DAEA-셀룰로즈 담체에 박테리아 고정
세포 현탁액 750㎖를 25℃에서 35㎖/h(=0.5BV/h)의 유속으로 칼럼 중의 담체 상을 통해 상단에서부터 하단까지 펌핑시킨다. 칼럼 중에 고정된 미생물의 양은 세포 현탁액을 공급한 후 신선한 성장 배지 750㎖를 칼럼에 공급함으로써 증가시킨다. 칼럼 중의 담체는 이제 제조 단계에 들어갈 준비가 된다.
칼럼에서의 이소말툴로즈 제조
25% 슈크로즈 용액(pH 7.5)을 30℃에서 DEAE-셀룰로즈 담체에 고정된 P. 루브룸의 칼럼 하단에 연속적으로 공급하고 생성물 용액을 상단으로부터 회수한다. 이러한 시스템은 CO2가 칼럼의 상단로부터 방출되고 제거되게 한다. 유속 또는 슈크로즈 농도에 따라 상이한 전환율이 달성된다(아래 표 참조).
슈크로즈 농도 25%
유속(BV/h)* 0.6 0.3 0.15 0.08
이소말툴로즈 12 22 35 61
트레할룰로즈 1 2 2.5 4.5
프룩토즈 1 2 2 2.5
글루코즈 1 1.5 1.5 2
슈크로즈 85 73 60 30
유속 0.08BV/h
슈크로즈 농도 25% 35% 55%
이소말툴로즈 61 43 12
트레할룰로즈 4.5 2 1
프룩토즈 3 3 1
글루코즈 2 2.5 0.6
슈크로즈 30 50 86
[*BV = 상 용적(Bed Volume)]
DEAE-셀룰로즈 담체에 고정된 P. 루브룸의 칼럼은 2주 동안 계속 작동시킨다. 시간에 따라 전환율은 감소된다. 고정된 세포는 2주 후에 칼럼에 신선한 멸균 배지로 칼럼에 공급함으로써 재신선화시킨다(10BV). 이러한 재신선화 사이클 후, 슈크로즈 용액(25%, 30℃)의 유속을 0.08BV/h로 조정하여 슈크로즈가 다음 생성물로 전환된다(HPLC에 의해 분석; Pb++형태의 이온 교환 수지): 이소말툴로즈 79%, 트레할룰로즈 0.9%, 프룩토즈 0.4%, 글루코즈 0.6%, 슈크로즈 18.5%.
고정된 P. 루브룸의 칼럼으로부터 수거한 이소말툴로즈 용액을 70 내지 85℃의 온도에서 증발시켜 70% 농도가 되게 하고, 65℃에서 25℃로 선형 냉각시킴으로써 결정화한다. 이소말툴로즈 결정을 원심분리에 의해 회수하고 세척하여 50℃에서 건조시킨다. 원심분리 수율은 70%(이소말툴로즈로부터의 이소말툴로즈)이고 결정 중의 이소말툴로즈 함량은 95 내지 100%이다.
이소말툴로즈 용액(50w/w%)을 촉매로서 라니 니켈을 사용하여 이소말트로 수소화시킨다(pH 9, 온도 100℃, 수소 압력 40kg/cm2, 3시간). 수소화 반응이 완결된 후, 라니 니켈을 반응 용액으로부터 분리한다. 용액을 증발시켜 농축시키고 이소말트는 통상적인 방법으로 용액으로부터 결정화한다.
1개월 후에 사용할 때, DEAE-셀룰로즈 담체는 고정된 P. 루브룸 세포를 담체의 원래 색으로 될 때까지 1M NaOH(60℃)로 세척하고 물로 세척하고 pH 5로 완충시키고 멸균수로 세척하여 칼럼에서 재생시킨다. 이후, 담체는 재로딩하고 새로운 제조 기간에 대한 준비가 된다.
실시예 2
에르비니아 라폰티시(ATCC 29284) 세포 현탁액의 제조
에르비니아 라폰티시(ATCC 29284)의 배양균으로부터의 세포를 식염수 10㎖로 희석시킨다. 생성된 현탁액의 앨리쿼트 0.1㎖를 1000㎖ 멸균 진탕 플라스크에 성장 배지 300㎖를 접종하는 데 사용한다. 배지는 다음과 같다: 슈크로즈 40g/ℓ, 펩톤 10g/ℓ, 육류 추출물 6g/ℓ, KH2PO40.01M, pH 7. 접종시킨 플라스크 3x300㎖를 30℃에서 230rpm으로 24시간 동안 진탕시켜 2x109세포/㎖ 이상의 농도가 되게 한다.
세레티아 플리무티카(ATCC 15928) 세포 현탁액의 제조
세레티아 플리무티카(ATCC 15928)의 배양균으로부터의 세포를 식염수 10㎖로 희석시킨다. 생성된 현탁액의 앨리쿼트 0.1㎖를 1000㎖ 멸균 진탕 플라스크에 성장 배지 300㎖를 접종하는 데 사용한다. 배지는 다음과 같다: 슈크로즈 40g/ℓ, 펩톤 10g/ℓ, 육류 추출물 6g/ℓ, KH2PO40.01M, pH 7. 접종시킨 플라스크 3x300㎖를 30℃에서 230rpm으로 24시간 동안 진탕시켜 2x109세포/㎖ 이상의 농도가 되게 한다.
고정된 세레티아 플리무티카(ATCC 15928) 및 에르비니아 라폰티시(ATCC 29284)에 의한 칼럼에서의 이소말툴로즈의 제조
DEAE 담체, 스페자임 GDC(Spezyme GDC, 제조원: Cultor Ltd) 상의 S. 플리무티카 및 E. 라폰티시의 고정은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행한다. 25% 슈크로즈 용액(pH 7.5)을 고정된 세포 칼럼을 통해 30℃에서 연속적으로 펌핑시킨다. 유속은 유출시 이소말툴로즈 농도가 최대가 되게 조정한다. 슈크로즈는 다음 생성물로 전환된다(HPLC에 의해 분석; Pb++형태의 이온 교환 수지).
S. 플리무티카 E. 라폰티시
유속 0.12BV/h 0.02BV/h
이소말툴로즈 80% 79%
트레할룰로즈 7.5% 15%
프룩토즈 5.5% 0.5%
글루코즈 3% 0.5%
슈크로즈 - - %
이들의 특정 고정된 미생물 세포를 함유하는 칼럼 둘 다 2주 동안 계속 작동시킨다. 시간에 따라 생성은 감소된다. 미생물은 신선한 멸균 배양 배지(10 상 용적, BV)를 함유하는 칼럼을 공급함으로써 때때로 재신선화시킨다.
재생
몇회의 재신선화 사이클 후(1개월 후 사용), 스페자임 GDC 담체를 고정된 P. 루브룸 세포를 원래 담체색으로 될 때까지 1M NaOH(60℃)로 세척하고 물로 세척하고 pH 5로 완충시키고 멸균수로 세척하여 칼럼에서 재생시킨다. 이후, 담체는 재로딩하고 새로운 제조 기간에 대한 준비가 된다.
실시예 3
음이온 및 양이온 교환 수지의 시험
프로타미노박터 루브룸(CBS 574.77)을 실시예 1에서와 동일한 조건으로 배양한다. 5시간 배양 후, 각각의 시험된 이온 교환 물질을 배양 배지 75㎖에 가한다. 진탕 플라스크에서 13시간까지 계속 배양하여 P. 루브룸 세포를 함유하는 이온 교환 물질을 로딩시킨다. 이온 교환 물질을 여과에 의해 배양 배지로부터 분리하고 물로 세척한다. 2개의 스페자임 GDC 담체 샘플 중의 하나를 가교시키기 위해서 글루타르알데하이드 처리에 노출시킨다. 고정된 P. 루브룸을 함유하는 스페자임 GDC 3g을 0.3% 글루타르알데하이드 15㎖와 혼합한다. 0.5시간 동안 서서히 교반한 후, 스페자임 GDC를 증류수 150㎖로 세척한다. 글루타르알데하이드 처리된 스페자임 GDC를 포함하여, 각 이온 교환 물질에 고정된 P. 루브룸 세포의 활성은 글루코실트랜스퍼라제 활성으로서 측정한다. 시험 결과는 표 2에 나타내었다. 담체 물질의 특성은 표 3에 나타내었다.
각종 담체에 고정된 P. 루브룸 세포의 활성
이온 교환체 고체 매트릭스 상표명 글루코실-트랜스퍼라제활성 U/g
약염기성 음이온 교환체:
DEAE-셀룰로즈 폴리스티렌 스페자임 GDC1 1.0
DEAE-셀룰로즈 폴리스티렌 스페자임 GDC +글루타르알데하이드 0.8
3급 아민 페놀형 알데하이드 듀오라이트(Duolite) A 5682 1.3
3급 아민 스티렌-디-비닐벤젠 앰버라이트(Amberlite) IRA 932 0.6
3급 아민 폴리스티렌 마크로넷(Macronet) MN-1003 0.3
약산성 양이온 교환체:
카복실릭 폴리아크릴릭 듀오라이트 C 4642 0
강염기성 음이온 교환체:
4급 암모늄 폴리스티렌 마크로넷 MN 4003 0
4급 암모늄 스티렌-디-비닐벤젠 앰버라이트 IRA 9002 0
강산성 양이온 교환체:
설폰 폴리스티렌 레지디온(Residion) EXC4 0
설폰 스티렌-디-비닐벤젠 앰버라이트 IRC 2002 0
이온 교환체는 다음 제조원으로부터 구입한다.
1컬터 리미티드(Cultor Ltd.)
2롬 엣 하스 리미티드(Rohm et Haas Ltd.)
3퓨로라이트 리미티드(Purolite Ltd.)
4미쓰비시 케미칼즈 캄파니(Mitsubishi Chemicals Co.)
담체 물질의 특성
용량meq/㎖ 표면m2/g 기공Å
약염기성 음이온 교환체:
스페자임 GDC 담체 0.2 내지 0.25
듀오라이트 A 568 1.2 1(㎖/g) 150 내지 250
앰버라이트 IRA 93 0.85 25 300 내지 1000
마크로넷 MN-100 0.15 800 내지 1000 850 내지 950
약산성 양이온 교환체:
듀오라이트 C 464 2.7
강염기성 음이온 교환체:
마크로넷 MN 400 0.3 800 내지 1000 850 내지 950
앰버라이트 IRA 900 1.0 18 100 내지 1000
강산성 양이온 교환체:
레지디온 EXC 1.1 200
앰버라이트 IRC 200 1.75 45 100 내지 500
글루코실트랜스퍼라제 활성 측정
항온배양 시험: 0.05M KH2PO4완충액(pH 7) 중의 10% 슈크로즈 용액 5㎖를 시험 튜브에서 물 5㎖ 중의 고정화물 1g과 혼합한다. 혼합물을 30℃에서 60분 동안 온화하게 진탕하면서 항온배양한다. 효소 반응은 시험 튜브를 수욕에서 2분 동안 100℃로 가열함으로써 중단시킨다. 대조 샘플은 이와 같이 준비하지만 효소 반응은 효소 샘플을 가한 후 직접 중단시킨다. 반응물에 형성된 이소말툴로즈를 환원당(DNS법)으로서 측정한다. U/g = (μMol/㎖ x 5㎖)/(60분 x 샘플량(g)).
실시예 4
프로타미노박터 루브룸(CBS 574.77)의 세포 현탁액 제조
프로타미노박터 루브룸 균주(CBS 574.77)의 배양균으로부터의 세포를 식염수 10㎖로 희석시킨다. 생성된 현탁액의 앨리쿼트 0.1㎖를 1000㎖ 멸균 진탕 플라스크에 성장 배지 300㎖를 접종하는 데 사용한다. 배지는 다음과 같다: 슈크로즈 40g/ℓ, 펩톤 10g/ℓ, 이스트 추출물 5g/ℓ, 육류 추출물 3g/ℓ, Na2HPO42g/ℓ, pH 7. 접종시킨 플라스크 3x300㎖를 30℃에서 230rpm으로 20시간 동안 진탕시켜 109세포/㎖ 이상의 농도가 되게 한다. 세포 현탁액을 원심분리(5000rpm, 20분)에 의해 농축시켜 원래 용적의 1/8이 되게 한다.
탄닌산(TA), 폴리에틸렌이민(PEI) 및 글루타르알데하이드(GA)를 사용하는 DEAE-셀룰로즈 담체에 박테리아 고정
상기 P. 루브룸 세포 현탁액과 스페자임 GDC 담체 물질(제조원: Cultor Ltd)의 혼합물을 다음 처리에 노출시킨다:
1. 농축된 세포 현탁액 40㎖와 습윤시킨 스페자임 GDC 담체 20㎖를 전자기식 교반기로 실온에서 30분 동안 교반한다.
2. 농축된 세포 현탁액 40㎖와 습윤시킨 스페자임 GDC 담체를 20㎖를 전자기식 교반기로 실온에서 30분 동안 교반한다. 이후에, 10% 글루타르알데하이드(GA) 용액 0.6㎖를 스페자임 GDC 담체에 가하여 세포를 가교시키고 추가로 30분 동안 교반한다.
3. 농축된 세포 현탁액 40㎖와 습윤시킨 스페자임 GDC 담체 20㎖를 실온에서 30분 동안 전자기식 교반기로 교반한다. 이후에, 폴리에틸렌이민(PEI)(25%) 0.4㎖를 동일한 혼합물에 가하여 세포를 응집시키고 10분 동안 계속 혼합한다. 반응 혼합물은 혼합물에 글루타르알데하이드(10%) 0.6㎖를 가함으로써 가교시키고 추가로 30분 동안 계속 교반한다. 과립 형태의 응집제가 용액 중에 나타난다.
4. 농축된 현탁액 40㎖와 습윤시킨 스페자임 GDC 담체 20㎖를 실온에서 30분 동안 전자기식 교반기로 교반한다. 이후에, 탄닌산(TA)(4%) 1㎖를 가하여 세포 현탁액을 응집시키고 혼합물을 30분 동안 교반한다. PEI(25%) 1㎖를 가하고 반응을 교반하에 10분 동안 진행시킴으로써 응집을 보다 증가시킨다. 응집괴와 스페자임 GDC 담체의 가교는 혼합물에 글루타르알데하이드(10%) 0.6㎖를 가함으로써 수행하고 추가로 30분 동안 계속 교반한다. 용액은 흡착된 세포와 응집된 세포를 함유하는 스페자임 GDC 과립과 세포괴의 분리된 과립 응집괴의 혼합물로 구성된다.
상기 네가지 반응 혼합물 1 내지 4 중의 하나씩을 개개의 칼럼에 변환시킨다(직경 2cm, 용적 70㎖). 추가의 반응 용액을 스페자임 GDC와 P. 루브룸 세포를 함유하는 과립 응집괴를 통해 칼럼으로 여과한다. 실온에서 0.05M 인산염 완충액(pH 7) 중의 32% 슈크로즈 용액으로 칼럼 상단에서부터 공급 속도 4.4㎖/h(= 0.25BV/h)로 즉시 로딩하기 시작한다. 각 칼럼의 전환율은 20일 동안 계속해서 칼럼을 실시하여 시험한다. 결과는 아래 표 4에 나타내었다.
칼럼 시행 요약
시행 1 시행 2 시행 3 시행 4
스페자임 스페자임+GA 스페자임+GA+PEI 스페자임+TA+PEI+GA
-이소말툴로즈 수율d.s. 상의 %(1일째) 16 14 53 73
-이소말툴로즈 생성 g/ℓ(칼럼)/h
1일 후 14 12 44 54
20일 후 4.5 6 27 38
-반감기, h(22 내지 24℃에서) 250 500 800 850
칼럼 시행의 모니터링 기간은 20일이고, 유동 저항성 변화는 전혀 관찰되지 않는다. 스페자임 GDC 담체는 고정 담체로서 조합된 효과를 갖는다. 이는 세포의 흡착을 위한 우수한 기재로서 제공되고 분리된 응집괴에 대한 유동 보조제로서 작용한다.
본 발명은 본원에서 몇가지 특정 실시예에 의해 기술하였다. 그러나, 이러한 실시예는 단지 예시적인 것일 뿐이며, 당해 기술분야의 숙련가는 첨부된 청구항의 범위를 벗어나지 않으면서 여러 방법으로 본 발명을 변경시킬 수 있음은 명백하다.

Claims (16)

  1. 슈크로즈 함유 용액을 실질적으로 비압축성의 다공성 입상 고체 물질 형태의 약염기성 음이온 교환 물질을 포함하는 담체의 표면에 고정시킨 생존가능한 이소말툴로즈 형성 미생물 세포와 접촉시키고, 이성체화 생성물을 용액으로부터 회수함을 특징으로 하여, 생존가능한 고정된 이소말툴로즈 형성 미생물의 도움으로 슈크로즈를 이소말툴로즈로 이성체화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 방법이 담체로 패킹된 하나 이상의 칼럼에서 수행되는 연속 전환 공정임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 미생물 세포가 미생물 용액을 칼럼(들)에 공급함으로써 담체 표면에 고정화됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 담체 상의 미생물 밀도가 고정된 미생물 세포를 영양소 배지와 함께 공급함으로써 증가됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 고정된 미생물 세포의 미생물 활성이 담체에 영양소 용액을 공급함으로써 간헐적으로 재신선화됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 담체가 미생물 세포를 제거하고 세척하고 신선한 생존가능한 미생물 세포를 재로딩함으로써 재생됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 고정된 미생물 세포를 함유하는 담체가 가교 및/또는 응집 특성을 갖는 화합물로부터 선택된 물질로 처리됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 고정된 미생물 세포를 함유하는 담체가 탄닌산, 폴리에틸렌이민 및 글루타르알데하이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 물질로 처리됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 슈크로즈 함유 용액의 슈크로즈 함량이 20 내지 40%, 바람직하게는 25 내지 35%임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 담체가 실질적으로 비압축성의 다공성 입상 고체 물질 형태의 약염기성 음이온 교환 물질로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 담체의 고체 물질이 중합체 매트릭스에 결합된 약염기성 음이온 교환 특성을 갖는 물질을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 담체가 응집에 의해 폴리스티렌과 부착될 수 있게 결합된 디에틸아미노에틸(DEAE) 개질된 셀룰로즈의 미세섬유 또는 미세입자를 함유하는 음이온 교환체임을 특징으로 하는 방법.
  13. 담체가 이의 표면에 고정된 생존가능한 이소말툴로즈 형성 미생물 세포를 갖는 실질적으로 비압축성의 다공성 입상 고체 물질 형태의 약염기성 음이온 교환 물질을 포함하는, 슈크로즈를 이소말툴로즈로 이성체화하기 위한 미생물 공정에 사용되는 데 적합한 담체.
  14. 제13항에 있어서, 담체가 중합체 매트릭스에 결합된 음이온 교환 특성을 갖는 물질을 포함함을 특징으로 하는 담체.
  15. 제14항에 있어서, 담체가 응집에 의해 폴리스티렌과 부착될 수 있게 결합된 디에틸아미노에틸(DEAE) 개질된 셀룰로즈의 미세섬유 또는 미세입자를 함유하는 음이온 교환 물질임을 특징으로 하는 담체.
  16. 슈크로즈 함유 용액을 실질적으로 비압축성의 다공성 입상 고체 물질 형태의 약염기성 음이온 교환 물질을 포함하는 담체의 표면에 고정된 생존가능한 이소말툴로즈 형성 미생물 세포와 접촉시키는 단계,
    생성된 이소말툴로즈를 이소말트로 수소화시키는 단계 및
    이소말트를 회수하는 단계를 포함하여, 슈크로즈로부터 이소말트를 제조하는 방법.
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