JP2000513570A

JP2000513570A - 固定化された微生物によるイソマルツロースの製造方法およびそのための担体

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Publication number: JP2000513570A
Application number: JP09541660A
Authority: JP
Inventors: サルッキ，マルジャ―レエナ; ヘイッキラ，ヘイッキ; ビルジャバ，タピオ
Original assignee: XYROFIN OSAK YHTIO
Current assignee: XYROFIN OSAK YHTIO
Priority date: 1996-05-17
Filing date: 1997-05-16
Publication date: 2000-10-17
Also published as: DE69712206D1; CA2254956A1; IL127013A0; DE69712206T2; KR20000011105A; IL127013A; ATE216726T1; BR9709100A

Abstract

(57)【要約】本発明は、生存できる固定化されたイソマルツロース形成微生物によるスクロースのイソマルツロースへの異性化方法に関する。微生物細胞は顆粒アニオン交換材料からなる担体材料上に固定化される。生じたイソマルツロースは甘味料目的のためのイソマルトの製造のために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】固定化された微生物によるイソマルツロースの製造方法およびそのための担体本発明は、生存できる（viable）固定化されたイソマルツロース形成微生物によるスクロースのイソマルツロースへの異性化方法に関する。本発明はまた、アニオン交換材料からなり、かつその上に固定化された生存できるイソマルツロース形成微生物細胞を有する担体材料にも関する。本発明はさらに、スクロースからイソマルツロースを介するイソマルトの製造に関する。イソマルツロース（またはパラチノース）は、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトフラノースの系統名を有する還元二糖である。イソマルツロースは、食品産業において甘味料としての使用が提案されており、また水素化によるイソマルト（パラチニット）の製造のための原料である。イソマルトは、実質的にα−Ｄ−グルコピラノシル−（１，６）−ソルビトールおよびα−Ｄ−グルコピラノシル−（１，６）−マンニトールの等モル混合物である。イソマルトは、穏やかな甘味を有することが記載されている非カロリー性特定甘味料である。スクロースのイソマルツロースへの様々な異性化方法が報告されている。異性化は、α−グルコシルトランストランスフェラーゼ（サッカロースムターゼ）酵素であって、プロタミノバクタールブルム（Protaminobacter rubrum）、セラチカプリムチカ（Serratica plymuthica）、エルビニアラポンチシ（Erwini a rhapontici）等によって行われると考えられている。既知の異性化技術は、生存もしくは死滅している微生物、または抽出された形態における酵素での異性化を含む。酵素の固定化のための様々な技術はまた報告されている。それゆえ、例えばEP-B1-0028900は、様々な異性化微生物、好ましくはＥ．ラポンチシの酵素の固定化を示唆している。好ましい固定化技術は、死滅微生物細胞をカルシウムアルギン酸塩ペレット中に捕捉することからなる。ジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥセルロース）の濃厚水性スラリー中での固定化もまた記載されているが、しかし不十分な結果を与えることが報告されている。 US4386158は、α−グルコシルトランスフェラーゼを固定化するために使用されるカルシウムアルギン酸塩ゲルの物理的な強度を、ポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドでの処理によって改良することを開示している。 US4640894は、Ｐ．ルブルムの固定化された死滅している細胞を含む反応器を使用することによるイソマルツロースの製造を記載している。様々な固定化技術、例えばゲル中への捕捉および凝集剤での凝集が開示されている。 US4337313およびEP-B-0077971は、タンニンおよび長鎖ポリアミンでの凝集、エピハロヒドリン／ポリアミンコポリマーとグルタルアルデヒドの付加物との反応、および乾燥によるＰ．ルブルムの生存できる細胞の固定化を開示している。 EP-B-0049801は、様々な担体材料、例えば中空糸またはカチオン交換樹脂上への、Ｐ．ルブルムから単離されたスクロース転化酵素の固定化を開示している。 EP-B-0200069は、アニオン化可能な担体材料、特にスルホン酸カチオン交換マトリックス上への、抽出されたサッカロースムターゼ酵素の選択的固定化を開示している。 EP-A-0160253は、スクロースのイソマルツロースへの転化のための生体触媒を与える、重合の間のポリマー系中への捕捉によるＰ．ルブルム細胞の固定化を開示している。スクロースのイソマルツロースへの転化のための従来の方法は、完全に満足すべきものではない。担体材料は一般にその場で製造される。固定化方法は複雑で、また管理は敏感な酵索に害を及ぼさないように行わなければならない。アルギン酸塩またはカラギナンゲル中への捕捉は、いくつかの分離処理工程を行うことを必要とし、またグルタルアルデヒドでの最終架橋がしばしば必要である。凝集剤での溶液中における従来技術の凝集は、乾燥、押出しおよび造粒を含む、酵素に影響を与えるいくつかの後製造工程を必要とする。重合の間のポリマー中への酵素の包接は、物理的に強い生成物を与え得ることができるが、しかしこの方法はまた複雑であり、かつ敏感な酵素の活性に影響し得る。担体マトリックス自体の製造の間に担体中に生存または死滅している微生物細胞を包接する従来技術の方法に関連するさらなる不利な点は、活性が失われたとき、全ての担体が廃棄されなければならないという事実にある。本発明の目的は、イソマルツロース形成微生物の固定化のための従来の技術の不利な点を克服し、そしてイソマルツロースおよびイソマルトのイソマルツロースからの技術的に利用可能な製造方法を提供することである。本発明の目的はまた、固体担体の製造のために必要とされる反応に微生物を暴露すること無しに、生存できる微生物を固定化することによる、スクロースのイソマルツロースへの転化方法を提供することでもある。本発明の他の目的は、イソマルツロース形成微生物の生存できる細胞の担体上への固定化が技術的に複雑でないところの方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、充填されたカラム中でスクロースをイソマルツロースへ転化するための連続法であって、固定化された細胞は製造の間に容易に再賦活または再活性化されるところの方法を提供することである。本発明の目的はまた、良い物理的な強度を有し、そしてカラムを通したスクロース溶液の流れに低い圧力低下のみしか起こさない担体を含む充填された該カラム中での、イソマルツロースの製造方法を提供することでもある。本発明の特別な目的は、イソマルツロース形成生存微生物細胞を有する担体系であって、該担体は使用後再生されることができるところのものを使用する方法を提供することである。固定化された生存できる微生物細胞によるスクロースのイソマルツロースへの転化のための技術的に複雑でない方法は、担体として弱塩基性アニオン交換特性を有する固体多孔質材料を使用することによって提供されることができることが、驚くべきことに見いだされた。本発明は添付された請求の範囲において定義される。従って、本発明は、アニオン交換材料上に固定化された生存できるイソマルツロース形成微生物細胞によるスクロースのイソマルツロースへの異性化方法に関する。前記方法において、スクロース含有溶液は、不活性かつ実質的に非圧縮性の固体マトリックスの形態にある弱塩基性アニオン交換材料からなる多孔質粒状担体材料上に固定化された前記イソマルツロース形成微生物細胞と接触させられ、その後、異性化生成物が溶液から回収される。本発明の方法は、回分法または連続法のいずれかで行われ得る。連続法が担体で充填されたカラム中で好ましく行われる。生存できる微生物細胞は、好ましくは担体マトリックスの形成後に多孔質担体の表面上に固定化される。担体は、例えば栄養および／または成長培養液をカラムを通して供給することによって、連続的にまたは断続的に再賦活される。特に好ましい態様に従うと、担体材料は使用後、全ての微生物細胞の除去、洗浄および新しい生存できる細胞の再投入によって再生されることができる。本発明はまた、スクロースからのイソマルトの製造方法であって、前記方法は、スクロース含有溶液を、不活性かつ実質的に非圧縮性の固体マトリックスの形態にある弱塩基性アニオン交換材料からなる多孔質粒状担体材料上に固定化された生存できるイソマルツロース形成微生物細胞と接触させること、該イソマルツロースをイソマルトに水素化すること、および該イソマルトを回収することの工程を含む方法にも関する。本発明はまた、スクロースからのイソマルツロースおよび／またはイソマルトの製造方法における使用のための担体であって、該担体は、不活性かつ実質的に非圧縮性の固体マトリックスの形態にある弱塩基性アニオン交換材料からなり、その表面上に固定化された生存できるイソマルツロース形成微生物細胞を有するものを提供する。本明細書および請求の範囲において使用される用語“イソマルツロース形成微生物”は、スクロースをイソマルツロースに転化することができ、かつ弱塩基性アニオン交換担体材料の表面上に固定されることができるあらゆる微生物を意昧することを意図する。そのような微生物の例は、それらに限定されることなく上記従来技術の特許明細書に述べられたものを含む。特に好ましい微生物は、プロタミノバクタールブルム（CBS 574.77）であり、なぜならばとても有効でかつ食品配合物の製造のために安全に使用されることができるからである。良い結果はまた、例えばセラチカプリムチカおよびエルビニアラポンチシでも得られるが、しかしこれらの微生物は毒性を有し、かつ使用のためにより安全でない。他の適したイソマルツロース形成微生物はまた、テンサイおよび同様な起源から単離されることもでき、または当業者に明らかである様々な技術によってそのような微生物から得られることができる。本発明において担体として有用なアニオン交換材料は、吸着によって生存できる微生物細胞を結合に適せしめるアニオン交換能力を有するべきである。弱塩基性アニオン交換体が好ましい。弱塩基性アニオン交換体は、第一および／または第二／または第三アミノ基を有する材料である。それらは解離し、そして酸性溶液中で交換能力を有する。第三アミノ基を有する材料は、多少塩基性特性を有し、そしてそれらはまた中塩基性アニオン交換体と呼ばれる。担体は、スクロースのイソマルツロースへの転化に影響するべきでないという意味において不活性であるべきである。担体は、しかしながら、好ましくはその表面への微生物細胞の結合を促進するべきである。本発明に従う担体に使用される用語“多孔質”は、固体担体が、例えばほぼ同一半径を有する球の表面積に比較して非常に大きい表面積を与える多数の中空および細孔からなる固体担体を意味することを意図する。本明細書および請求の範囲において使用される用語“実質的に非圧縮性”は、固体担体が転化処理の間に広く行われる圧力にて感知できる程度で変形しないことを意味することを意図する。これは、従来技術において使用される変形可能なアルギン酸塩ゲルペレットからの明らかな差異である。本発明の担体材料は、変形に抗しかつカラムを通るスクロース溶液の流れを大きな圧力低下を起こさないものにすることができる固体多孔質マトリックスを有するべきである。本発明に従って使用され得る担体材料は、固体顆粒または粒子の形状である弱塩基性アニオン交換体である。この型の市販で入手可能な担体の例は、本明細書の作業実施例において使用されるものである。担体材料粒子は、流れにより少ない抵抗を与えるように、好ましくは一般に球状である。担体材料はまた、大きな表面積を与えるために、好ましくは粗大多孔質であるべきである。本発明の好ましい担体材料は、ジエチルアミノエチル変性セルロース（ＤＥＡＥセルロース）の形態にある弱塩基性アニオン交換材料であって、ポリスチレンと凝集した微小繊維または微小粒子を含み、開示が引用文献によってここに組み入れられるUS特許4355177において記載されるものからなる。大きな表面積を有する多孔質担体材料の形態にある弱塩基性アニオン交換体を使用することの利点は、微生物が担体の表面上に固定され、アルギン酸塩ゲルおよびその場で形成されるポリマーの場合のように担体材料の中に捕捉されないことである。スクロース溶液は、担体自身の中に浸透する必要はなく、そして従って、転化速度は、微生物が担体材料中に捕捉されるところの系と比較して増大される。生存できる微生物細胞は、一般に転化部位の担体材料上に固定化される。しかしながら、担体材料はまた、使用前に微生物細胞と共に投入されることもでき、そして投入された担体は保存されるかまたは他の位置での使用のために運搬される。本発明の一つの面は、実際、生存できるイソマルツロース形成微生物細胞を含む多孔質固体担体材料に関する。本発明の第三の面は、固定化された生存できる微生物細胞を使用する転化方法によってスクロースから生成されたイソマルツロースの水素化による、イソマルトの製造に関する。回分またはカラムにおける反応後、イソマルツロースは精製され、そして反応溶液から回収され得る。イソマルツロースは、例えば、不純物および副生成物を除去するためにイオン交換によって精製され、そして冷却結晶化によって結晶化され得る。イソマルトはイソマルツロースから水素化によって生成されることができる。水素化は、例えば、触媒としてラネーニッケルを使用する溶液（３０ないし５０重量％）中での接触水素化で行われ得る。温度は一般に約１００ないし１３０℃に合わせられ、水素圧は約４０ないし１００ｋｇ／ｃｍ²であり、処理期間は約３ないし１０時間である。水素化の完了後、触媒は反応溶液から分離される。溶液はろ過され、そして、所望により、生じたイソマルトは再びイオン交換によって精製され得る。イソマルトは液状で使用されることができ、または当業者に良く知られた方法において溶液から回収され得る。さもなくば、イソマルツロースは先立つ結晶化および精製無しにイソマルトに水素化され得る。スクロースをイソマルツロースに転化するための本発明に従う方法は、粒状担体上に固定された生存できる微生物細胞を含む反応タンク中で回分法として行われ得る。８０％またはそれ以上のスクロースの転化のための十分な反応時間後、固体担体はろ過によって溶液から除去され得る。反応後、溶液は主反応生成物としてイソマルツロース、少量のトレハルロース、フルクトースおよびグルコース、並びにあらゆる未反応スクロースを含む。好ましい方法において、処理は担体で充填されたカラム中での連続法として行われる。いくつかのカラムが存在することができ、それらは一連におよび／または、例えば一方のカラムが運転中に他方が再生に供されることを可能にするために並列に結合され得る。スクロース溶液はまた、転化を増大せしめるために一つまたはいくつかのカラムを通して再循環されることもできる。担体は、その表面上に固定化された微生物細胞（イソマルツロース形成微生物細胞）を含む生存できるグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む。担体表面上の微生物の固定化は、 −細胞懸濁液を担体で充填されたカラムを通して供給することによる“カラム投入”、または −繁殖の間に振盪フラスコまたは同様な容器中の培地に担体を導入することによる“振盪フラスコ投入” のいずれかによって行われ得る。双方の方法において、カラムを通して新しい栄養培養液を供給することによってカラム中の投入をさらに増大することが好ましい。 “カラム投入”は、あらゆる固定化が行われる前に、カラムが新しい担体材料で充填されることを可能にする。微生物を投入することは容易で、またさらなる反応工程は固定化が行われた後に必要でない。従って、微生物はあらゆる厳しい処理条件に暴露されない。所望により、担体上への微生物細胞の固定化は、溶液にグルタルアルデヒドのような架橋剤を添加することによって増大され得る。従来技術において既知であるもののような凝集剤を添加することも可能である。凝集は、転化を増大させ、そして固定化された系の半減期を延長することが見いだされた。しかしながら、本発明における凝集は、固体担体マトリックス上に固定化された微生物細胞で行われるので、乾燥工程は必要とされない。凝集および架橋された担体は、それ自体で使用可能である。反応は、充填されたカラム中で２５ないし３５℃、好ましくは約３０℃の最適温度で好ましく行われる。３５ないし４５℃の温度は部分的に不活性化することが証明されている。５５℃より高い温度は、Ｐ．ルブルムカラムを２４時間中に完全に不活性化する。精製された形態にあるまたは糖蜜としてのスクロースを含有する溶液は、充填されたカラムを、ＣＯ₂の除去を促進するために好ましくは下端から上端へ流され、ＣＯ₂はあらゆる通気空気と一緒にカラムの上端まで流れ上がる。溶液のスクロース濃度は、約２０ないし４０％、より好ましくは２５ないし３５％で好ましく保持されるべきである。５５％より高いスクロース濃度は、短い間の時間における転化を著しく減少させることが見いだされている。スクロース溶液のｐＨは、約４ないし８、より好ましくは５．５ないし７で好ましく保持される。スクロース溶液の流速は、非常に高いスクロースのイソマルツロースへの転化を与えるために非常に低くすることができるけれども、商業的な方法は、好ましくは反応器体積を保存するために、最大転化より低く運転される。約８０％までの転化がほとんどの適用において適している。異性化はイソマルツロース収率が低下するまで継続される。栄養物をカラム中に供給することによって、断続的に微生物活性を再賦活することが好ましく、または必要である。恒常的な低濃度の栄養物供給もまた使用され得る。本発明に従う方法の好ましい態様に従うと、異性化は、弱塩基性アニオン交換特性を有する実質的に非圧縮性の担体の表面に結合された固定化された微生物細胞を含む充填されたカラム反応器中での連続法として行われる。担体は好ましくは連続多孔質床、またはさもなくば窪みが付けられたもしくは網状の多孔質顆粒からなる。マトリックスまたは顆粒は個々の微小粒子または微小繊維からなり得る。この担体構造は、微生物細胞の固定化のための非常に大きな表面積を与える。好ましい担体の粒子またはマトリックス性質は、微小繊維、微小顆粒、微小球、微小ビーズ等からなる個々の微小粒子が一緒になって弱く結合、フェルト化、編織、接着または凝集することによって生成される。結合は、個々の微小粒子の間の接触点のいくつかで化学的、付着的または機械的な結合が確立されることによって達成される。化学的な結合は、これらの点で化学架橋反応が起こることによって達成される。付着的な結合は、熱可塑性樹脂のようなさらなる配合物の使用によって微小粒子を一緒に凝集または接着することによって達成される。機械的な結合は、接触点で繊維が絡まることもしくは結ばれること、またはそれらの表面が一緒になって噛み合うことによって粒子が一緒になることにより達成される。後者の形態において、マトリックスは、まるで管の中に充填されたろ紙の綿毛のような反応器を通した連続構造からなる。またある場合には、それらの最終形態において、粒子は分離しそして孤立する。微小粒子は、所望による粗い表面の微粒子に形成されることができる弱塩基性アニオン交換物質からなる。これらの物質は、天然もしくは再賦活セルロースまたはレーヨンであって、アニオン交換性質を与えるために誘導されたもの、合成アニオン交換樹脂、例えばフェノールホルムアルデヒド樹脂、アクリル樹脂およびポリスチレン樹脂、並びにアガロースまたはデキストリンをベースとするアニオン交換樹脂を含む。好ましい担体は、アニオン交換性質を与えるために化学変性されたセルロースまたはレーヨンから誘導された多孔質粒子のアニオン交換物質である。特に好ましい態様は、ポリスチレンとの凝集によって付着的に結合されたジエチルアミノエチル置換セルロースの微小繊維または微小粒子を含む。正荷電された樹脂と負荷電された微生物との間に確立される電気力は、樹脂の表面への微生物細胞の結合の主な原因であると考えられている。この結合は実質的に微生物の浸出を減じ、一方微生物とスクロース溶液の間の密接な接触を可能にする。上記で表した種類の弱塩基性アニオン交換体は、スクロースのイソマルツロースへの転化のための適したかつ活性な担体材料を与えることにおいて、特に有利であることが証明されている。これらの担体は固体かつ非変形性であり、それは長い運転寿命および低い流れ抵抗を与える。それらは大きな表面積を有し、それは転化のために与えられる体積当たりの大きな微生物数を可能にする。本発明の担体系の特別な利点は、転化が何度かの再賦活サイクル後に低下したとき、担体は再生され、再投入され、そして新しい使用に供せられることができることである。これは特に、本発明の好ましい担体、即ち固体ポリスチレンマトリックスからなるＤＥＡＥ変性セルロースの場合についてである。しかしながら、グルタルアルデヒドでの架橋が行われた場合、再賦活は複雑となり得る。本発明は今や以下の限定しない実施例で詳細に説明される。実施例１固定化のための担体（ＤＥＡＥ）の製造顆粒誘導セルロースを、以下のようにUS特許4355117に従って製造した。繊維セルロース２５部を二酸化チタン２５部と混合し、そして該混合物を二軸押出機を使用して食品等級高衝撃強度ポリスチレン５０部と混合した。押出物を水中で冷却し、そして０．３５ないし０．８５ｍｍの粒子寸法に篩分けした。篩分けされた顆粒の凝集したセルロース粒子を、上記US特許において記載されるようにＤＥＡＥセルロースを形成するために誘導した。生成した顆粒ＤＥＡＥセルロース２０ｇを、蒸留水中で５時間浸漬することによって水和した。水和ＤＥＡＥセルロース担体を、エタノール（７５％）中に１時間浸漬することによって消毒し、そして殺菌ガラスカラム（高さ６０ｃｍ、直径１．５ｃｍ）に移す前に殺菌水で濯いだ。プロタミノバクタールブルム（CBS574.77）の細胞懸濁液の製造プロタミノバクタールブルム種（CBS574.77）の培養からの細胞を、食塩水１０ｍｌで希釈した。生じた懸濁液のアリコート０．１ｍｌを、殺菌された１０００ｍｌ振盪フラスコ中の成長培養液３００ｍｌに接種するために使用した。培養液は以下のものである。スクロース４０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、肉エキス３ｇ／ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ２ｇ／ｌ、ｐＨ７。接種されたフラスコ３×３００ｍｌを、２３０ｒｐｍで３０℃で２０時間振盪し、５×１０⁹細胞／ｍｌを超える濃度に達せしめた。ＤＥＡＥセルロース担体上へのバクテリアの固定化細胞懸濁液７５０ｍｌを、カラム中の担体床を通して流速３５ｍｌ／ｈ（＝０．５ＢＶ／ｈ）で２５℃で上端から下端にポンプ送りした。カラム中の固定化された微生物の量は、細胞懸濁液を供給した後、カラムに新しい成長培養液７５０ｍｌを供給することによって増加した。カラム中の担体はこの時点で製造工程のために使用可能となった。カラム中でのイソマルツロースの製造２５％（ｐＨ７．５）のスクロース溶液を、ＤＥＡＥセルロース担体上に固定化されたＰ．ルブルムのカラムの下端に３０℃で連続して供給し、そして生成溶液を上端から除去した。この系はＣＯ₂を解放し、そしてカラムの上端から除去することを可能にした。異なる転化を流速またはスクロース濃度に依存して行った（以下の表を見よ。）。表１スクロース濃度２５％流速（ＢＶ／ｈ）^* ０．６０．３０．１５０．０８イソマルツロース１２２２３５６１トレハルロース１２２．５４．５フルクトース１２２２．５グルコース１１．５１．５２スクロース８５７３６０３０流速０．０８ＢＶ／ｈスクロース濃度２５％３５％５５％イソマルツロース６１４３１２トレハルロース４．５２１フルクトース３３１グルコース２２．５０．６スクロース３０５０８６（^*ＢＶ＝床体積）ＤＥＡＥセルロース担体上に固定化されたＰ．ルブルムのカラムを二週間、運転し続けた。転化は時間が経過するにつれて減少した。固定化された細胞を、二週間後、カラムに新しい殺菌培養液（１０ＢＶ）を供給することによって再賦活した。この再賦活サイクル後、スクロース溶液（２５％、３０℃）の流速を０．０８ＢＶ／ｈに調整し、スクロースは以下の生成物に転化した（ＨＰＬＣによる分析、Ｐｂ⁺⁺形態におけるイオン交換樹脂）。イソマルツロース７９％、トレハルロース０．９％、フルクトース０．４％、グルコース０．６％、スクロース１８．５％。固定化されたＰ．ルブルムのカラムから得たイソマルツロース溶液を、温度７０ないし８５℃で濃度７０％に蒸発させ、そして６５℃から２５℃への直線的な冷却によって結晶化した。イソマルツロース結晶を洗浄での遠心によって回収し、そして５０℃で乾燥した。遠心収率は７０％（イソマルツロースからイソマルツロース）であり、また結晶のイソマルツロース含有量は９５ないし１００％であった。イソマルツロース溶液（５０重量％）を、触媒としてラネーニッケルを使用してイソマルトに水素化した（ｐＨ９、温度１００℃、水素圧４０ｋｇ／ｃｍ²、３時間）。水素化の完了後、ラネーニッケルを反応溶液から分離した。溶液を蒸発によって濃縮し、そしてイソマルトを溶液から慣用の方法において結晶化した。使用１カ月後、ＤＥＡＥセルロース担体を、固定化されたＰ．ルブルム細胞を１ＭＮａＯＨ（６０℃）で担体の元の色が達成されるまで洗い出すこと、水で洗浄すること、ｐＨ５に緩衝させること、および殺菌水で洗浄することによってカラム中で再生した。その後、担体は再投入および新しい製造期間のために使用可能となった。実施例２エルビニアラポンチシ（ATCC29284）の細胞懸濁液の製造エルビニアラポンチシ（ATCC29284）の培養からの細胞を、食塩水１０ｍｌで希釈した。生じた懸濁液のアリコート０．１ｍｌを、殺菌された１０００ｍｌ振盪フラスコ中の成長培養液３００ｍｌに接種するために使用した。培養液は以下のものである。スクロース４０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、肉エキス６ｇ／ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．０１Ｍ、ｐＨ７。接種されたフラスコ３×３００ｍｌを、２３０ｒｐｍで３０℃で２４時間振盪し、２×１０⁹細胞／ｍｌを超える濃度に達せしめた。セレチアプリムチカ（ATCC15928）の細胞懸濁液の製造セレチアプリムチカ（ATCC15928）の培養からの細胞を、食塩水１０ｍｌで希釈した。生じた懸濁液のアリコート０．１ｍｌを、殺菌された１０００ｍｌ振盪フラスコ中の成長培養液３００ｍｌに接種するために使用した。培養液は以下のものである。スクロース４０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、肉エキス６ｇ／ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．０１Ｍ、ｐＨ７。接種されたフラスコ３×３００ｍｌを、２３０ｒｐｍで３０℃で２４時間振盪し、２×１０⁹細胞／ｍｌを超える濃度に達せしめた。固定化されたセレチアプリムチカ（ATCC15928）およびエルビニアラポンチシ（ATCC29284）によるカラム中でのイソマルツロースの製造Ｓ．プリムチカおよびＥ．ラポンチシのＤＥＡＥ担体、スペザイム（spezyme ）ＧＤＣ（製造者クルトルリミテッド）上への固定化を、実施例１において記載されたように行った。２５％スクロース溶液（ｐＨ７．５）を、３０℃で連続して固定化された細胞カラムを通してポンプ送りした。流速は、流出液中のイソマルツロース濃度が最大となるように調節した。スクロースは以下の生成物に転化した（ＨＰＬＣによる分析、Ｐｂ⁺⁺形態におけるイオン交換樹脂）。Ｓ．プリムチカＥ．ラポンチシ流速０．１２ＢＶ／ｈ０．０２ＢＶ／ｈイソマルツロース８０％７９％トレハルロース７．５％１５％フルクトース５．５％０．５％グルコース３％０．５％スクロース − − それらの特定の固定化された微生物細胞を有するカラム双方を二週間、運転し続けた。生成は時間が経過するにつれて減少した。微生物は、カラムに新しい殺菌培養液（１０床体積、ＢＶ）を供給することによって断続的に再賦活した。再生何度かの再賦活サイクル（１カ月の使用）後、スペザイムＧＤＣ担体を、固定化された微生物細胞を１ＭＮａＯＨ（６０℃）で担体の元の色が達成されるまで洗い出すこと、水で洗浄すること、ｐＨ５に緩衝させること、および殺菌水で洗浄することによってカラム中で再生した。その後、担体は再投入および新しい製造期間のために使用可能となった。実施例３アニオンおよびカチオン交換樹脂の試験プロタミノバクタールブルム（CBS574.77）を、実施例１においてと同一条件において培養した。５時間の培養後、試験されるイオン交換材料それぞれ３ｇを培養液７５ｍｌ中に添加した。振盪フラスコ中での培養を１３時間継続し、イオン交換材料にＰ．ルブルムの細胞を投入した。イオン交換材料を培養液からろ過によって分離し、そして水で洗浄した。二つのスペザイムＧＤＣ担体試料の一方を、架橋のためのグルタルアルデヒド処理に暴露した。固定化されたＰ．ルブルムを有するスペザイムＧＤＣ３ｇを、０．３％グルタルアルデヒド１５ｍｌと混合した。０．５時間の低速による攪拌後、スペザイムＧＤＣを蒸留水１５０ｍｌで洗浄した。グルタルアルデヒド処理されたスペザイムＧＤＣを含むそれぞれのイオン交換材料上に固定化されたＰ．ルブルム細胞の活性を、グルコシルトランスフェラーゼ活性として決定した。試験の結果を表２において表す。担体材料の特性を表３において表す。表２様々な担体上に固定されたＰ．ルブルムの活性イオン交換体は以下から購入した。¹ クルトルリミテッド² ロームアンドハースリミテッド³ プロライトリミテッド⁴ ミツビシケミカルコーポレーション表３担体材料の特性能力表面細孔 m当量/ml m²/g Å 弱塩基性アニオン交換体スペザイム GDC担体 0.2-0.25デュオライト A568 1.2 1(ml/g) 150-250アンバーライト IRA93 0.85 25 300-1000マクロネット MN-100 0.15 800-1000 850-950 弱酸性カチオン交換体デュオライト C464 2.7 強塩基性アニオン交換体マクロネット MN400 0.3 800-1000 850-950アンンバーライト IRA900 1.0 18 100-1000 強酸性カチオン交換体レシディオン EXC 1.1 200アンバーライト IRC200 1.75 45 100-500 グルコシルトランスフェラーゼ活性の決定培養試験：０．０５ＭＫＨ₂ＰＯ₄バッファ、ｐＨ７中の１０％スクロース溶液５ｍｌを、水５ｍｌ中の固定化物１ｇと試験管中で混合した。混合物を３０℃ で６０分間穏やかに振盪しながら培養した。酵素反応を、試験管を１００℃で水浴中で２分間加熱することによって停止させた。対照試料を同様に製造したが、しかし酵素反応を酵素試料の添加後直ちに停止した。反応において形成されたイソマルツロースを還元糖として決定した（ＤＮＳ法）。Ｕ／ｇ＝（μモル／ｍｌ ×５ｍｌ）／（６０分×試料の量、ｇ）。実施例４プロタミノバクタールブルム（CBS574.77）の細胞懸濁液の製造プロタミノバクタールブルム種（CBS574.77）の培養からの細胞を、食塩水１０ｍｌで希釈した。生じた懸濁液のアリコート０．１ｍｌを、殺菌された１０００ｍｌ振盪フラスコ中の成長培養液３００ｍｌに接種するために使用した。培養液は以下のものである。スクロース４０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、肉エキス３ｇ／ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ２ｇ／ｌ、ｐＨ７。接種されたフラスコ３×３００ｍｌを２３０ｒｐｍで３０℃で２０時間振盪し、５×１０⁹ 細胞／ｍｌを超える濃度に達せしめた。細胞懸濁液は遠心（５０００ｒｐｍ、２０分）によって元の１／８の体積まで濃縮した。タンニン酸（ＴＡ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびグルタルアルデヒド（ＧＡ）を使用するＤＥＡＥセルロース上へのバクテリアの固定化上記のＰ．ルブルム細胞懸濁液とスペザイムＧＤＣ担体材料（製造者クルトルリミテッド）の混合物を以下の処理に暴露した。１．濃縮された細胞懸濁液４０ｍｌおよび湿式スペザイムＧＤＣ担体２０ｍｌを、磁気攪拌機で室温で３０分間攪拌した。２．濃縮された細胞懸濁液４０ｍｌおよび湿式スペザイムＧＤＣ担体２０ｍｌを、磁気攪拌機で室温で３０分間攪拌した。その後、１０％グルタルアルデヒド（ＧＡ）溶液０．６ｍｌを、細胞をスペザイムＧＤＣ担体上に架橋するために添加し、そして攪拌をさらに３０分間継続した。３．濃縮された細胞懸濁液４０ｍｌおよび湿式スペザイムＧＤＣ担体２０ｍｌを、磁気攪拌機で室温で３０分間攪拌した。その後、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（２５％）０．４ｍｌを、細胞を凝集させるために同じ混合物に添加し、そして混合を１０分間継続した。反応混合物を、グルタルアルデヒド（１０％）０．６ｍｌを混合物に添加することによって架橋し、そして攪拌をさらに３０分間継続した。凝集剤の顆粒型が溶液中に現れた。４．濃縮された細胞懸濁液４０ｍｌおよび湿式スペザイムＧＤＣ担体２０ｍｌを、磁気攪拌機で室温で３０分間攪拌した。その後、タンニン酸（ＴＡ）（４％）１ｍｌを、細胞懸濁液を凝集させるために添加し、そして混合物を３０分間攪拌した。凝集は、ＰＥＩ（２５％）１ｍｌを添加することおよび反応を１０分間攪拌下で進行させることによって、さらに増大させた。凝集塊とスペザイムＧＤＣ担体の架橋を、グルタルアルデヒド（１０％）０．６ｍｌを混合物に添加することによって行い、そして攪拌をさらに３０分間継続した。溶液は、吸着された細胞を含むスペザイムＧＤＣ顆粒の混合物および集合された細胞および細胞マスの分離した顆粒凝集塊を含んでいた。上記の４種の反応混合物１ないし４のそれぞれを、それぞれのカラム（直径２ｃｍ、体積７０ｍｌ）に移した。さらなる反応溶液を、カラム中でスペザイムＧＤＣおよびＰ．ルブルム細胞含有顆粒凝集塊を通してろ過した。カラムに上端から０．０５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７）中の３２％スクロース溶液を室温で投入することを、供給速度４．４ｍｌ／ｈ（＝０．２５ＢＶ／ｈ）で直ちに開始した。それぞれのカラムの転化能力を連続して２０日間運転して試験した。結果を以下の表４において表す。表４カラム試行の概略試行１２３４スペザイムスペザイムスペザイムスペザイム +GA +GA+PEI +TA+PEI+GAイソマルツロース収率 16 14 53 73 d.s.に基づく%（1日目）イソマルツロース収率 g/l(カラム)/h １日後 14 12 44 54 20日後 4.5 6 27 38 半減期h 250 500 800 850 （22-24℃）カラム試行の観測期間は２０日であり、そして流れの抵抗における変化は観察されなかった。スペザイムＧＤＣ担体は、固定化担体として総合効果を有する。該担体は、溶液中の細胞の吸着ための良い塩基を提供し、また分離した凝集塊のための流れの助けとして役立つ。本発明はいくつかの特定の例によって説明されている。しかしながら、これらの実施例は説明するのみのものであり、そして本発明は、添付された請求の範囲から逸脱することなく多くの方法に変化し得ることは当業者に明らかである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年１２月１２日（１９９７．１２．１２）【補正内容】請求の範囲１．生存できる固定化されたイソマルツロース形成微生物によるスクロースのイソマルツロースへの異性化方法であって、 −スクロース含有溶液を、実質的に非圧縮性の多孔質粒状固体材料の形態にある弱塩基性アニオン交換物質からなる担体の表面上に固定化された生存できるイソマルツロース形成微生物細胞と接触させ、そして −異性化生成物を溶液から回収することを特徴とする方法。２．前記方法は、前記担体で充填された一つまたはそれ以上のカラム中で行われる連続転化法であることを特徴とする、請求項１記載の方法。３．前記微生物細胞は、前記カラムに微生物溶液を供給することによって前記担体表面上に固定化されていることを特徴とする、請求項２記載の方法。４．担体上の微生物密度を、固定化微生物細胞に栄養培養液を供給することによって増加することを特徴とする、請求項１、２または３のうちのいずれか一項記載の方法。５．固定化された微生物細胞の微生物活性を、担体に栄養溶液を供給することによって断続的に再賦活することを特徴とする、請求項１記載の方法。６．担体を、微生物細胞の除去、洗浄および新たな生存できる微生物細胞の再投入によって再生することを特徴とする、請求項１記載の方法。７．前記固定化された微生物細胞を有する担体を、架橋および／または凝集特性を有する化合物から選択される物質で処理することを特徴とする、請求項１記載の方法。８．前記固定化された微生物細胞を有する担体を、タンニン酸、ポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドからなる群より選択される物質で処理することを特徴とする、請求項７記載の方法。９．スクロース含有溶液は、２０ないし４０％、好ましくは２５ないし３５％のスクロース含有量を有することを特徴とする、請求項１記載の方法。１０．前記担体は、実質的に非圧縮性の多孔質粒状固体材料の形態にある弱塩基性アニオン交換物質から構成されることを特徴とする、請求項１記載の方法。１１．前記担体の前記固体材料は、ポリマーマトリックスに結合された弱塩基性アニオン交換特性を有する物質を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。１２．前記担体は、ポリスチレンとの凝集によって付着的に結合されたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）変性セルロースの微小繊維または微小粒子を含むアニオン交換体であることを特徴とする、請求項１記載の方法。１３．スクロースのイソマルツロースへの異性化のための微生物方法における使用に適した担体であって、該担体は、実質的に非圧縮性の多孔質粒状固体材料の形態にある弱塩基性アニオン交換物質からなり、その表面上に固定化された生存できるイソマルツロース形成微生物細胞を有するものからなることを特徴とする担体。１４．前記担体は、ポリマーマトリックスに結合されたアニオン交換特性を有する物質を含むことを特徴とする、請求項１３記載の担体。１５．前記担体は、ポリスチレンとの凝集によって付着的に結合されたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）変性セルロースの微小繊維または微小粒子を含むアニオン交換材料であることを特徴とする、請求項１４記載の担体。１６．スクロースからのイソマルトの製造方法であって、前記方法は、 −スクロース含有溶液を、実質的に非圧縮性の多孔質粒状固体材料の形態にある弱塩基性アニオン交換物質からなる担体の表面上に固定化された生存できるイソマルツロース形成微生物細胞と接触させること、および −生じたイソマルツロースをイソマルトに水素化すること、および −前記イソマルトを回収することの工程を含むことを特徴とする方法。１７．生存できる固定化されたイソマルツロース形成微生物によるスクロースのイソマルツロースへの異性化方法であって、 −スクロース含有溶液を、実質的に非圧縮性の多孔質粒状固体材料の形態にある弱塩基性アニオン交換物質からなる担体の表面上に固定化された生存できるイソマルツロース形成微生物細胞と接触させ、そして −異性化を継続し、スクロースの８０％またはそれ以上の転化をなすことを特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 19/12 Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｐ 19/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ビルジャバ，タピオフィンランド国エフアイエヌ―02460 カントビクコルサリンチエ 18

Claims

【特許請求の範囲】１．生存できる固定化されたイソマルツロース形成微生物によるスクロースのイソマルツロースへの異性化方法であって、 −スクロース含有溶液を、実質的に非圧縮性の多孔質粒状固体材料の形態にある弱塩基性アニオン交換物質からなる担体の表面上に固定化された生存できるイソマルツロース形成微生物細胞と接触させ、そして −異性化生成物を溶液から回収することを特徴とする方法。２．前記方法は、前記担体で充填された一つまたはそれ以上のカラム中で行われる連続転化法であることを特徴とする、請求項１記載の方法。３．前記微生物細胞は、前記カラムに微生物溶液を供給することによって前記担体表面上に固定化されていることを特徴とする、請求項２記載の方法。４．担体上の微生物密度を、固定化微生物細胞に栄養培養液を供給することによって増加することを特徴とする、請求項１、２または３のうちのいずれか一項記載の方法。５．固定化された微生物細胞の微生物活性を、担体に栄養溶液を供給することによって断続的に再賦活することを特徴とする、請求項１記載の方法。６．担体を、微生物細胞の除去、洗浄および新たな生存できる微生物細胞の再投入によって再生することを特徴とする、請求項１記載の方法。７．前記固定化された微生物細胞を有する担体を、架橋および／または凝集特性を有する化合物から選択される物質で処理することを特徴とする、請求項１記載の方法。８．前記固定化された微生物細胞を有する担体を、タンニン酸、ポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドからなる群より選択される物質で処理することを特徴とする、請求項７記載の方法。９．スクロース含有溶液は、２０ないし４０％、好ましくは２５ないし３５％のスクロース含有量を有することを特徴とする、請求項１記載の方法。１０．前記担体は、実質的に非圧縮性の多孔質粒状固体材料の形態にある弱塩基性アニオン交換物質から構成されることを特徴とする、請求項１記載の方法。１１．前記担体の前記固体材料は、ポリマーマトリックスに結合された弱塩基性アニオン交換特性を有する物質を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。１２．前記担体は、ポリスチレンとの凝集によって付着的に結合されたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）変性セルロースの微小繊維または微小粒子を含むアニオン交換体であることを特徴とする、請求項１記載の方法。１３．スクロースのイソマルツロースへの異性化のための微生物方法における使用に適した担体であって、該担体は、実質的に非圧縮性の多孔質粒状固体材料の形態にある弱塩基性アニオン交換物質からなり、その表面上に固定化された生存できるイソマルツロース形成微生物細胞を有するものからなることを特徴とする担体。１４．前記担体は、ポリマーマトリックスに結合されたアニオン交換特性を有する物質を含むことを特徴とする、請求項１３記載の担体。１５．前記担体は、ポリスチレンとの凝集によって付着的に結合されたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）変性セルロースの微小繊維または微小粒子を含むアニオン交換材料であることを特徴とする、請求項１４記載の担体。１６．スクロースからのイソマルトの製造方法であって、前記方法は、 −スクロース含有溶液を、実質的に非圧縮性の多孔質粒状固体材料の形態にある弱塩基性アニオン交換物質からなる担体の表面上に固定化された生存できるイソマルツロース形成微生物細胞と接触させること、および −生じたイソマルツロースをイソマルトに水素化すること、および −前記イソマルトを回収することの工程を含むことを特徴とする方法。