KR830001446B1

KR830001446B1 - 고정화효소법에 의한 6-아미노 페니실란산의 제법

Info

Publication number: KR830001446B1
Application number: KR1019790003613A
Authority: KR
Inventors: 쿠니오 마쓰모토; 히데지 세이죠오
Original assignee: 이토오 후지마; 토오요오 죠오소오 카부시키 카이샤
Priority date: 1979-10-19
Filing date: 1979-10-19
Publication date: 1983-07-29
Also published as: KR830001377A

Abstract

내용 없음.

Description

고정화효소법에 의한 6-아미노 페니실란산의 제법

본 발명은 고정화효소법에 의한 6-아미노페니실란산의 제법에 관한 것이다.

종래의 페니실린으로부터 6-아미노 페니실란산(이를 아래에서는 "6-_APA"로 기재함)을 제조하는 방법으로는, 화학적인 탈아실화법 및 효소적 탈아실화법이 여러가지로 발표되었다. 화학적 탈아실화법으로는 페니실린을 에스테르기로 보호하고서, 이미노클로라이드화, 이미노에테르화시킨 다음에 가수분해 하는 방법이 광범히 사용되고 있으나, 그 공정이 번잡할뿐만 아니라, 6-_APA자체가 의약품을 제조하기 위한 중간체이므로, 불순물이 혼입되는 문제가 있었다. 그러나 일방, 종래의 효소적 탈아실화법은, 페니실린을 저농도에서 반응시켜야 하기 때문에 6-_APA가 화학적으로 불안정성임에도 불구하고, 반응액을 농축하여야 한다는 점에 중대결함이 있었다.

실정이 이와같은데 대하여 네덜랜드의 특허공개 제7205609에서는 셀룰로우스트리아세타트섬유를 지지체로 하는 고정화페니실린 아실라아제(고정화효소)를 사용하여 6-_APA를 제조하는 방법이 발표되었고, 같은 발명이 우선권주장으로 U.S.A. 특허로 등록되었으며, 지지체(Carrier)의 종류를 달리하는 진보적발명이 예를 들면 지지체를 수용성 무수말레인산/ 메틸비닐공중합체로 하는 발명이 U.S.P. 3887432로, 덱스트란으로 하는 발명이 U.S.P. 4167446으로, 폴리아크릴아미드로하는 발명이 U.S.P. 3953291로 또 메타크릴산의 비수용성 중합체 내지 공중합체로 하는 발명이 U.S.P. 4001264로 각기 특허되었다. 발명자는 고정화효소법에 의한 6-_APA의 제조에 관하여, 다각도로 연구한 결과, 페니실린아실라아제를 고정함에 있어서, 발명자가 발견한 유리아미노기를 갖는 다공성구조의 아크릴로니트릴계열의 폴리머(중합체)를 지지체로하는 고정화 페니실린 아실리아제를 사용함에 의하여 비활성(比活性)이 2,800U/g이어서, "Method in enzymology"의 765면 Ⅲ에 기재된 최고의 비활성을 갖는 그것보다 약 4배로 되는 대단히 고도한 비

본 발명은 상술한 여러가지의 지견을 근거로하여 성취한 것으로, 페니실린에 고정화 페니실린아실라아제를 작용시켜서 효소적으로 6-_APA를 제조하는 방법을 수행함에 있어서, 평균크기가 100내지 2,000Å인 미세공 다수개를 분포함유하는 아크릴로니트릴 중합체를 불활성의 유기성매체 속에서 리튬알루미늄 하이드라이드로 환원처리함으로서 아미노기를 함유시키고서 상술의 다공성이 보유되는 섬유상으로 형성한 수불용성 아크릴로니트릴중합체를 지지체로 하고서, 불활성유기매체 속에서 가교제 또는 축합제에 의하여 페니실린아실라아제를 공유결합으로 결합시켜되는 고정화페니실린아실라아제를 사용하여 벤질페니실린 또는 그 알칼리금속염류를 효소적으로 탈아실화함을 특징으로하는 고정화효소법에 의한 6-아미노페니실란산의 제조방법이다.

아래에서는 본 발명의 방법을 더 상세히 설명한다. 본 발명에서 사용하는 페니실린은 페니실린아실라아제의 작용을 받아들이는 공지의 천연페니실린 또는 그 수용성임이다. 천연페니실린의 종류로는 G, 페니실린페니실린 V등이 바람직하며, 특히 바람직한 것은 페니실린V이다.

또 수용성염으로서는 페니실린아실라아제의 활성에 악영향을 끼치지 아니하는 수용성염이면 공지의 여하한 염일지라도 사용되는 것이나, 통상적으로는 알칼리금속염, 예를들면 나트륨염, 칼륨염등이 바람직하다.

또 페니실린의 발효액으로부터 비친수성유기용매로 페니실린을 추출하여, 이 유기층에서 수용액에로 전용시킨 단계의 추출공정중에 있는 페니실린추출액의 형태로도 사용이 가능하다.

본 발명에서 사용하는 페니실린아실라아제는, 페니실린을 기질로하고서, 이를 6-_APA에로 가수분해하는 작용을 갖는 공지의 효소이다. 효소로서는 공지인 페니실린아실라아제 생산균을 배양한 균체 또는 배양여과액등으로부터 채취한 효소제가 바람직하다. 상술의효소는 공지의 방법으로 채취하는 것이며, 부분적정제 또는 충분히 정제된 것이다. 상술한 바 있는 공지의 페니실린아실라아제 생산균을 예시하면,

Actnoolanes utahcnsis ATCC 14539

Arthrobacter tumescene ATCC 6947

Arthrobacter viscosus aI 15294

Bacillus megeterium ATCC 14945

Bacillus megaterium ATCC 14946

Bacillus megaterium B-400 FERM-P748

Erwinia stewartil ATCC 13531

Esdherichia coli ATCC 9637

Esdherichia coli ATCC 11105

Esdherichia coli ATCC 13529

Esdherichic coli NCIB, 8743

Esdherichia coli NCIB 8743A

Flavobacterium suaveolens ATCC 13533

Microccus candidus ATCC 8456

Micrococcus roseus ATCC 416

Micromonospora purpureochromogenes ATCC13634

Nocardia sp. ATCC13635

Proteus rettgeri ATCC9250

Proteus rettgeri ATCC31052

Pseudomonas aeruginosa NRRL1014J

pseudomonas Fouorescens NRRL1B10

Pseudomonas maltophila ATCC17808

Serratia rubidaes ATCC181

Streptomyces griseus KFO 3355

Streptomyces lavendlae ATCC 135544

Streptomyces lavendulae ATCC 13665

Streptomyces lavendlae ATCC 21138

등을 들 수 있다. 그러나 타종의 페니실린아실라아제 생산균도 사용될 수 있음은 물론이다. 또 Advance in Applied Microbiology Vol. 17. p. 311-369. 1974(ed. E.J. Vandamme dt al.)에 기재되어 있는 곰팽이가 생산하는 페니실린아실라아제를 사용하여도 좋다. 이 경우에는 천연페니실린으로 페니실린 V를 사용함이 바람직하다.

본 발명이 사용하는 페니실린아실라아제의 지지체로는, 유리아미노기를 갖는 아크릴로니트릴계열의 중합체로서, 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, d-클로로아크릴로니트릴, 신넘니트릴등의 아크릴로 니트릴계의 모노머로 되는 단일 중합체 또는 공중합체, 또는 아크릴로니트릴계의 모노머와 에틸렌형의 2중결합을 갖는 타종의 코모노머(Comonomer)와의 공중합체등이다.

상술의 지지체를 얻음에 있어서는, 아크릴로니트릴계열의 중합체가 다공성구조로 됨이 바람직하다. 다공성구조로 하기 위하여는, 예를들면 아크릴로니트릴의 단일중합체 또는 공중합체를 형성시킴에 있어서, 그 모노머를 물속에서 서스펜션 중합 또는 유화중합 시키거나, 또는 그 중합체를 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 진한질산, 로단염수용액, 염화아연 수용액 등이 가용화용매에 용해시키고, 이를 물, 아세톤 함유의 수용액, 에탄올함유수용액, 디메틸포름아미드수용액등으로 되는 응고육에로 적가하고,

다음에는 상술함과 같이하여 얻는 아크릴로니트릴계열의 중합체에 아미노기를 도입하여 아미노화 아크릴로니트릴계의 중합체 즉 본 발명이 말하는 지지체를 제조하는바, 이 지지체에 페니실린아실라아제를 고정화한 고정화효소를 사용하여 수성매체 속에서 반응을 수행하는 것이므로, 아미노기를 도입하는 정도는, 생성되는 지지체가 수불용성으로 되는 범위 이내에서 도입하여야 한다. 그러하기 위하여는 공지인 여러종류의 반응을 이용한다. 예를들면 아크릴로니트릴에 결합된 니프릴기를 아미노기로 환원시키는 방법이 있다. 이 환원반응은 그 중합체가 다공성구조인 경우는, 그 다공성구조가 파괴되지 아니하도록 하기 위하여, 그 증합체를 용해함이 없는 불활성의 비용매 속에서 수행함이 바람직하다. 이 환원반응에 바람직한 환원제로는 수소화리륨알루미늄을 들 수 있다. 그리고 불활성 비용매로는 디에틸에테르, 디옥산, 테트라히드로푸란등의 유기성 매체이다.

상술의 반응은, 상온 내지 사용하는 비용매의 비등점까지의 범위에서 수행한다.

반응시간은 반응온도, 사용하는 중합체의 종류, 형상, 구조, 중합도 등의 차이에 따라 변동적이나, 통상적으로는 1내지 48시간의 범위에서 적당히 수행한다. 이와 같은 반응에 의하여 그 중합체 속의 니트릴기가 환원되어서 아미노기로 변화되는 바, 아미노화의 정도는 유리아미노기가 지지체 그람당 20μM로 부터 그 지지체가 실질적으로 수용성이 되지 아니하기까지의 범위로 하는 것이다. 이같이 하여 얻는 지지체는 필요에 따라 수세, 산성수용액을 사용하는 세정, 알칼리수용액 사용의 세정등을 수행함이 좋다.

니트릴기를 아미노기에로 환원시키는 별개의 방법으로는, 아크릴로니트릴계의 중합체를 이 중합체를 용매하는 유기용매의 존재하에서 오오토클레이브 속에서 접촉환원 시킴으로서 수행할수도 있으나, 이리하면 반응진행이 과도하여서, 생성물이 수용성으로 될우려가 있고, 또 다공성 구조를 형성시키는 과정등에 비추어 바람직한 방법이라고 할 수는 없다.

아미노화 아크릴로니트릴계의 폴리머를 얻기 위한 또 하나의 방법으로는 할로겐원자단 특히 클로르 원자단을 갖는 아크릴로니트릴계열의 중합체에 암모니아를 작용시켜서 클로르원자단이 유리아미노기로 치환되게하는 방법으로 수행할 수도 있다. 또 에폭시기를 갖은 아크릴로니트릴계의 중합체에 리진, 알킬렌디아민 예를 들면 헥사메틸렌디아민, 도데카메틸렌디아민등을 반응시킴으로서도 수행된다. 또 아크릴로니트릴계의 모노머와 아미드계의 비닐모노머와의 공중합체, 즉 아미드기를 갖는 아크릴로니트릴계의 중합체를 호프만 분해함으로서도 얻는다.

또 하나의 별법으로, 스티겐계열의 모노머, 디비닐벤, 젠비닐에틸벤젠 등의 방향족 비닐 모노머와 아크릴로니트릴계열의 모노머와의 공중합체를 니트로기가 없는 경우에는, 진한 질산황산으로 니트로화하여되는 니트로화아크릴로니트릴계열의 중합체를 하이드로설파아트소오다의 수산화칼륨 용액으로 그 니트로기를 환원시킴으로서도 수행한다.

또 아크릴로 니트릴 계열의 모노머와 메틸비닐케톤과의 공중합체를 암모니아로 처리함으로서도 얻는 것이다.

이와같이하여 얻는 지지체는 바람직하게는 다공성구조를 보유하고, 섬유상, 과립상, 박막상 또는 중공섬유상등의 형상을 갖는다. 이 다공성구조는 생물학적 활성체인 페니실린아실라아제를 내측부에로 침투시킴에 유효한 공경이 큰 대공과, 그 표면 및 내측부에서 페니실린아실라아제가 지지체에 포착결합되는 것으로 추정된다. 이들의 대공 및 소공은 100내지 2000Å 정도의 공경으로 분포된다.

상술의 지지체에 페니실린아실라아제를 고정화 함에 있어서는, 물리학적 흡착법 또는 공유결합법(담체가교법)에 의하여 수행할 수 있다.

이들의 고정화법은, 유리아미노기를 갖는 지지체에 효소를 결합시키는 방법으로 발표한 문헌 예를들면 치바타 이쓰로오(天畑一郞)가 편찬한 "고정화효소"(코오단샤발행)에 발표된 공지의 상용수단에 의하여 적당히 수행할 수 있다.

예를들면 글루타르알데히드 등의 가교화제를 사용함에 의하여 지지체의 아미노기와 페니실린아실라아제와를 직접결합시키거나, 또는 리진헥사메틸렌디아민등의 스페이서어를 중개체로하여 결합시키거나, 또는 지지체의 아미노기와 무수숙신산 등과 같은 카르복실기 도입제와를 반응시킨 다음에, 이 카르복시기와 페니실린아실라아제와를 공지의 펙티드 결합법으로 결합시키거나, 또는 지지체와 페니실린아실라아제와를 직접축합제 예를들면 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)-카르보디아미드 등과 같은 수용성축합재

이와 같이하여 페니실린아실라아제를 고정화한 지지체가 보유하는 효소활성의 정도는, 물리적인 흡착법으로 고정화 시킨것이, 공유결합법으로 고정화 시킨것보다 활성이 더 고도한 고정화효소를 얻는다. 그러나 공유결합법으로 고정화한 것은 결합상태가 더 완강하므로, 장기간의 연속 사용에서 효소가 용해손실 되는 폐단잉 배제되며, 또 열, pH등의 외적요인에 대하여 안정성이 양호한 경우가 있어서 유리하다.

상술의 고정화 페니실린아실라아제를 수성매체속에서 페니실린에 작용시킴에 있어서는 고정화효소가 몰에 불용성이기 때문에 뱃치법과 같은 간단식 방법 또는 칼럼법과 같은 연속식 방법등의 어느 방법이건 이를 이용할 수 있다.

예를들면 뱃치법인 경우는, 페니실린 용액에 고정화효소를 부유시키고서, pH를 일정상태로 조절하면서 교반함에 의하여 반응이 진행하는 것이다. 고정화효소는 반응완결액에서 여과분취함에 의하여 반복 사용할 수 있다.

칼럼법인 경우는 고정화효소를 칼럼에 충입하고, 이 칼럼속으로 페니실린 용액을 통과시키는 바, 이때에는, 용액의 유속을 크게 하고서 재순환 시킴이 바람직하다. 즉 칼럼을 한번 통과함에 기인되는 탈아실화반응을 한정함에 의하여, 생성되는 카르복실산에 기인되어서 pH의 극단적 저하를 억제할 수 있는 것이다. 칼럼을 통과한 반응액은 냉각하여 저장탱크에 저장하고, 수산화알칼리등의 알칼리를 사용하여 그 pH를 언제이건을 막론하고 6.5-9.5로 중화하여, 열교환기를 경유하여 칼럼에로 재순환 시킴에 의하여, pH가 저하됨에 기인되는 고정화효소의 활성열화를 방지하고, 또 페니실린의 분해를 방지함에도 유용하게하며, 또 탈아실화반응도 촉진시킬 수 있다.

칼럼은 유속이 빠름에 기인되는 유체압의 손실을 적게하기 위하여, 가능하면 액층이 얕은 것으로 사용함이 바람직하며, 재순환은 일반적으로 액상용적(液床容積)의 100-300배의 유량으로 되게하여 수행한다. 재순환은 페니실린의 90% 이상이 6-_APA예로 전환되기까지 계속함이 바람직하다.

상술의 효소반응을 수행하는 온도는 일반적으로 15-40℃의 범위이다. 반응에 가장 적당한 pH는 페니실린아실라아제의 생산균주에 따라서 차이가 있으며, 가장 적당한 pH를 보유시킬 필요가 있는 경우에는pH를 6-9의 근방으로 하고서 반응을 수행함에 바람직하다. 반응에 소요되는 시간은, 효소의 역가(力價), 기질(氣質)의 유량 유속 등의 차이에 따라 다르나, 통상은 1-10시간이다.

상술의 효소반응에서 페니실린의 농도는 1-20W/ V%의 범위로 하는 것이나, 반응율의 고도화, 제사용율의 향상, 고정화효소의 활성이 열화함을 방지하는 것등을 감안하여, 통상은 3-12W/ V%의 범위로 함이 바람직하다.

다음에는 반응액에서 6-APA를 분리 및 정제하는 바, 이 분리 및 정제방법은 공지의 방법으로 수행할수 있다. 예를들면 반응액중에 잔존하는 페니실린 침 카르복실산을 메틸이소부틸케톤, 아세트산에틸, 아세트산부틸등의 비친수성유기용매로 산성하에서 추출제거후, pH를 4.3에로 조절하여 6-APA를 그 등전점에서 침전시켜도 좋으며, 반응액에 아세톤, 메탄올 등의 친수성 유기용매를 첨가 후 6-APA의 등전점인 pH 4.3으로 조절하여 등전점침전의 방법을 사용함도 좋다. 본 발명의 방법에서는 기질의 농도가 대단히 높으므로 반응액을 농축함이 없이, 반응액에서 6-APA를 고순도의 것으로 또 고수율로 경정화 수득함이 가능하다.

페니실린아실라아제의 역가측정법:

1) 효소액인 경우 :

효소액 0.5밀리리터, 0.1몰 농도의 인산완충액(pH 7.5) 40밀리리터, 4(W/ V)%의 PCG 칼륨염 /0.1몰인산완충액(pH 7.5) 0.5밀리리터로 되는 반응액을 37℃에서 30분간 반응시킨 것에서 0.5밀리리터를 분취하여 0.05N NaCH 1밀리리터, 20% 아세트산 2밀리리터로 되는 완충액 3밀리리터, 0.5(W/ V)% P-디메틸아미노벤즈알데히드/ 메탄올 용액 0.5밀리리터 중에 첨가하고, 실온에서 10분간 반응시킨 다음에 415nm에서의 흡광도를 측정하여 6-APA의 분량을 구한다.

효소활성은, 1분간에 1μ몰의 6-APA를 생성하는 활성을 1단위(1U)로 한다.

2) 고정화효소인 경우 :

0.1몰 인산완충액(pH 7.5) 4.5밀리리터, 4(W/ V)% PCG 칼륨염/ 0.1몰 인산완충액(pH7.5) 0.5밀리리터로 되는 용액 중에, 미리 중량이 측정된 고정화효소를 첨가하고, 37℃에서 30분간 반응시킨다. 다음의 조작은 전술한 효소액의 경우에 준하여, 생성되는 6-APA의 분량을 구한다.

다음에 참고에 및 실시예를 드는 바 이들에 의하여 본 발명이 국한되는 것 아니다.

[참고예 1]

i) 고정화효소용 지지체의 제조 :

다공성구조를 갖는 폴리아크릴도니트릴(아크릴로니트릴 90%이상)의 섬유 2.0그람을, 수소화리륨알루미늄 2.0그람이 함유된 건조 에테르 160밀리리터 속에 첨가하고, 50℃의 기름중탕속에서 1시간 가열환류한 다음 여과하여, 잔사를 디에틸에테르, 소량의 물, 1NHCl 물, 1N NaOH물, 0.1 몰인산완충액 (pH7.5)의 순서로 세정함으로서 다공성구조로 되고 또 섬유상인 아미노화폴리아크릴로니트릴 9.5그람(함수몰)을 얻는다.

[참고예 2]

수소화리튬알루미늄 2.5그람을 3구플라스크에 충입하고, 건조에테르 100밀리리터를 첨가교반하면서 참고예 1에서 얻은 다공성구조의 폴리아크릴로니트릴 2그람을 첨가하고 50℃에서 16시간 가열환류하여 반응시킨 다음 얼음으로 냉각시키면서, 물을 적가하여 미반응의 수소화 리듐알루미늄을 분해시키고, 0.1N HCl을 적가하여 분해잔사를 용해한 다음에 여과분별하여 아미노화폴리아크릴로니트릴을 회수하고 1N HCl,물, 1N NaOH물, 0.1를 인산완충액(pH 7.5)의 순서로 세정하여 다공성구조이고, 과립형인 지지체를 얻는다.

이리하여 얻은 고정화단백에 대한 측정의 결과와, 지지체의 아미노기 함량에 대한 측정의 결과는 다음의 시험법으로 측정하여 표 1내지 표 3에 기재한다.

(1) 고정화효소

위에서 말한 지지체의 제조반응에서 반응시간 만을 서로 달리하여 되는 지지체 각기의 18밀리그람씩을, 12.5% 글루타르알데히드/ 인산염환충액(pH 8.5) 10밀리몰에 첨가하고서, 이 혼합물을 0℃에서 20분간 교반한다. 섬유상태의 지지체를 여과분리하여 인산염 완충액(pH 8.5)과 0.1몰 붕산염완충액(pH 7.5)으로 서서히 세정한다. 다음에는 곧 이 섬유체를 0.3%인 소의 혈청알부민 또는 Bacillus megaterium B-400/ 0.1M 인산염완충액(pH7.5)으로 되는 페니실린아실라아제(140u/ ml)2밀리리터에 첨가하고서, 이 혼

클루타르알데히드로 처리하지 아니한 지지체도 또한 같은 소의 혈청단백 또는 페니실린아실라아제의 용액에 첨가하고서 같은 조건하에서 30℃ 1시간 진탕한 다음, 웨어서 말한 같은 방법에 의하여, 지지체의 흡착된 소의 혈청단백 또는 페니실린아실라아제의 분량을 확인하는 것이다.

(2) 아미노산의 첨가에 의하여 측정한 아미노기류의 함량

위의(1)에서와 같이 반응시간을 달리하여 되는 여러종류의 지지체(13밀리그람씩)각기를, 12.5%의글루타르알데히드용액으로 같은 방법에 의하여 처리하고서, 0.3%의 글 루타민산(Glu) 또는 트레오닌(Thr)을 함유하는 0.1M 인산염완충액 (Ph 7.5) 2밀리리터에 첨가한 다음 30℃에서 1시간 동안 진탕한다. 반응 완결의 혼합물을 여과분리하고 표면에 떠있던 부분의 아미노산 함량을 자동식 아미노산 분석장치에 의하여 정량함에 의하여, 그들 지지체의 아미노산 함량으로 그들 지지체의 아미노산에 대한 결합능력을 확인한다. 이 실험의수행으로, 그들 지지체가 아미노산을 흡착함이 없음에 관하여는, 아미노산 대신으로, 그 아미노산의 히드라지드로 실험함에 의하여 확인하는 것이다.

(3) 적정법에 의하여 측정한 아미노기류의 함량

환원시간 만을 달리하여 얻는 여러가지의 지지체(80미리그람씩)를 2mM 염산 15밀리리터 및 증류수 30밀리리터와 더불어 1시간동안 교반한다. 과잉한 분량의 염산을 2mM의 가성소오다 수용액으로 적정함에 의하여, 해당하는 지지체의 시료가 함유하는 아미노기에 의하여 소비된 염산의 분량을 확인한다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

흡착된 효소(페니실린아실라아제)

앞의(1)항에서 말한 지지체에 바칠루스 메가테륨 B-400 (FERM-P8747)을 부가하여 제조되는 페니실린아실라아제의 분량을 측정하는 대신으로, 페니실린아실라아제의 활성도의 시험은 앞에서 설명한 시험법에 의하여 측정확인 한다. 그 결과는 표 4에 표시한다.

[표 4]

[실시예 1]

i) 페니실린아실라아제 농축액의 제조

폴리펩톤 1%, 고기즙 1%, 식염 0.5%를 함유하는 배지(pH 7.0) 20리터를 용양 30리터인 발효기에 충입한 것 5대를 준비하여, 120℃, 20분간 증기멸균후, 미리 전술의 배지에 30℃, 24시간 진탕배양한 바칠루스메가테륨 B-400 FERM P No. 748의 종배양액 200밀리리터 씩을 각기 무균적으로 이식하고, 통기속도 매분간 20리터, 교반속도 매분간 300회전으로 하여 통기교반하면서, 30℃에서 72시간 배양하였다. 배양 후 5대 분의 배양물을 집합하여 웨스트파이아 원심분리기로 균체를 제거하고, 이 배양여과액에 셀라이트(Sellatite Johns Manbille Sales 회사 제 No. 560) 900그람을 첨가하고, 30분간 교반후 여과분취한다. 얻은 세셀라이트(이는 약 20U/ g의 페니실린아실라아제활성을 보유 함) 약 1.8킬로그람을 물에 첨가 분산시키고, 이를 칼럼(잭경 6.0×길이 67㎝)에 충입하고, 24% 황산암모늄 / 0.1몰 트리스히드록시메틸아미노메탄용액(pH 8.5)으로 SV0.5의 조건하에서 용출하여, 280nm의 흡수를 갖는 구회분 390밀리리터(78U/ ml)를 얻었다.

상술의 처리법과 같이하여 얻는 용출액을 합친것 760밀리리터를 0.12몰 인산완충액(pH 7.5)으로 등장(等張)시킨 바이오겔(Biogel) P-10(50~100메슈)을 충입한 칼럼(직경 5.5×길이 87cm)에 충입하고서 겔여과한다. 280nm의 흡수를 갖으며, 염의 혼입이 없는 효소액 890밀리리터(55U/ mι)을 얻는다.

상술의 처리법과 같이하여 얻는 효소액을 합친 것 2.3 리터를 투석튜우브에 충입한 것을 30% 카아보왁스(평균분자량 2만)/ 0.1 몰인산완충액(pH 7.5) 중에서 약 2배로 농축한 다음, 다시 0.1몰 인산완충액(pH 7.5)속ㅇ서 1야간 투석하여, 페니실린아실라아제의 농축액 1.1리터(120U/ mι)를 얻었다.

ii)고정화 페니실린 아실라아제의 제조

참고예 1에서 얻은 다공성구조를 갖는 섬유상의 아미노ㅎ하 폴리아크릴로니트릴 3그람을 12.5% 글루타아르 알데히드/ 붕산완충액(pH 8.5) 200밀리리터에 첨가하고, 0℃에서 20분간 교반한다. 반응후 지지체를 여과 분취하여 붕산완충액(pH 8.5), 0.1몰 인산 완충액(pH 7.5)으로 세정 후, 차앞의 i)에서 얻은 페니실린아실라아제 농축액 240밀리리터 속에 첨가하고, 실온에서 4시간 교반한다. 50℃에서 1야간 방치 후 0.5몰 NaCl/ 0.1몰인산완충액(pH 7.5), 0.1몰 인산완충액(pH 7.5)의 순서로 세정하여 고정화페니

iii)6-APA의 제조

앞의 ii)에서 얻은 고정화 페니실린아실라아제 7.4그람(함습중량)을 25℃로 보온한 쟈켓트 착설의 칼러먀지름 2.6 × 길이 27cm)에 충입하고, 페니실린 G 칼륨염 10그람을 0.02몰 인산완충액(pH 7.5)에 용해하여 pH9.0으로 조절한 용액 150밀리리터를 유속 매시간 2.6리터로 흘려보내서, 칼럼에서 흘러나오는 액체를 냉각된 저장조 내에서 4N 수산화나트륨 수용액으로 Ph 8.7-9.3으로 조절하고 열교환기를 경유하여, 칼럼에 재순환 시킨다. 이 조작을 3시간 동안 계속하여, 칼럼에서의 유출액에 pH 의 저하가 거의 없는 단계에서 재순환을 중지하고, 같은 인산완충액으로 컬럼을 세정하여 재순환액 및 칼럼 세정액 180밀리리터를 채취하여, 이에 아세톤 90밀리리터를 첨가하고, 냉각하에서 6N 염산으로 pH 4.3으로 조절하여 냉장고 속에 1야간 방치한다. 석출한 침전을 여과분취하여, 아세톤으로 세전후 건조하여 6-APA 5.3그람(수율 91%, 순도 98%, 페니실린 G 0.5%이하, 페닐아세트산 0.1%이하)을 얻는다.

상술의 조작을, 한번씩의 간단식조작(뱃치식 조작)으로하여, 80회에 긍하여 실시하였던바, 칼럼내이 고정화효소의 역가는 최초의 50%로 감소 되었으나, 6-APA의 수율 및 순도는 감소되지 않았다.

[실시 예 2]

앞의 실시예 1의 i)의 전반부에 기재된 방법에 의하여 페니실린아실라아제를 흡착시킨 셀라이트(셀라이트효소)를, 24% 황산암모늄/ 0.1몰 인산2나트륨(pH 8.5, NaOH로 조절)으로 용출하여, 용출액(280nm의 흡수를 표시하는 구회분)을 한외 거르기 하여, 분자량 6000이하의 부분을 제거함과 동시에 탈염하고 농축하여 황산암모늄의 농도가 0.03%로 되기까지 탈염한 페니실린아실라아제 농출액(40U/ mι)을 얻는다.

[실시 예 3]

참고예2에서 얻는 다공성구조를 갖는 과립형지지체 300밀리그람(함습중량) 빙냉된 12.5% 글루타아르알데히드/붕산완충액(pH 8.5) 50밀리리터에 첨가하고, 0℃에서, 20분간 교반 후 여과분취하여, 0.1몰 인산완충액(pH 7.5)으로 세정 후, L형 시험관에 용입된 바칠루스·메가테륨 B-400이 생산하는 아실라아제 효소액(72U/ mι) 3밀리리터 중에 첨가하고, 30℃, 60분간 교반하고 여과분취하여, 0.5몰 식염/ 0.1몰 인산완충액(pH 7.5), 0.1몰 인산완충액(PH 7.5)으로 세정하여, 고정화 페니실린아실라아제(아실라

[실시 예 4]

옥수수 침지액(코온스팁리켜) 2%, 페닐아세트산 0.2%를 함유하는 배지 160밀리리터(수산화칼륨 수용액으로 pH 7.0으로 조절)를, 용량 250리터의 발효탱크에 충입하고, 120℃에서 30분간 증기멸균 후, 상술함과 같은 조성의 배지에 30℃내지 18시간 미리부터 배양한 엣세리히아콜리 ATCC 11.105의 종배양액 400밀리리터를 무균적으로 이식하고, 통기속도 매분간 150리터, 교반속도 매분간 150회전으로 하여, 30℃에서 17시간 통기배양한다. 얻은 배양액에서는 웨스트파리아식 원심분리기를 사용하여 균체를 수집한

참고예 1에서 얻은 다공성구조이고 섬유형인 아미노화폴리아크릴토니트릴 3그람을, 12.5% 글루타아르알데히드/ 붕산완충액(pH 8.5) 200밀리리터 속에 첨가하고, 0℃에서 20분간 교반한다. 반응후에는 지지체를 여과분취하여 붕산완충액(pH 8.5), 0.1몰 인산완충액(pH 7.5)으로 세정후, 전술의 페니실린아실라아제 농축액 100밀리리터에, 0.1몰 인산완충액(pH 7.5) 140밀리리터를 첨가한 용액에 첨가한다. 실온에서 4시간 교반후, 50℃로 하여 1야간을 방치후, 여과분취하여, 0.5몰 NaCl/ 0.1몰 인산완충액(pH 7.5), 0.1몰 인산완충액(pH 7.5)의 순서로 세진하여, 섬유형의 고정화 페니실린아실라아제 11.5그람(함수중량)을 얻는다. 780(U/ g).

상술의 고정화 페니실린아실라아제를 사용하여 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 6-APA를 제조하였던 바, 6-APA 5.2그람(수율 89.3%, 순도 98%)을 얻었다.

Claims

평균크기가 100내지 2000Å인 미세공 다수개를 분포함유하는 아크릴로니트릴중합체를 불활성의 유기성매체속에서 리튬알루미늄하이드라이드로 환원처리 함으로서 아미노기를 함유시키고서 상술의 다공성이 보유되는 섬유상으로 형성한 수불용성 아크릴로니트릴 중합체를 지지체로 하고서, 불활성유기매체 속에서 가교제 또는 축합제에 의하여 페니실린아실라아제를 공유결합으로 결합시켜되는 고정화 페니실린아실라아제를 사용하여 벤질페니실린 또는 그 알칼리금속염류를 효소적으로 탈아실화함을 특징으로 하는 고정화효소법에 의한 6-아미노페니실산산의 제조방법.