IT8322155A1 - Procedimento per immobilizzare materie biologiche e composto di materie biologiche adsorbite in vermiculite - Google Patents

Procedimento per immobilizzare materie biologiche e composto di materie biologiche adsorbite in vermiculite Download PDF

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Description

DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un procedimento per Immobilizzare 'materiali biologici. Pi? particolarmente l'invenzione riguarda l'immobilizzazione di materiali biologici in cui i materiali' vengono assorbiti da particelle di vermiculite che vengono quindi rivestite con un polimero.
Materiali biologici come enzimi o microorganismi o cellule che producono enzimi, vengono spesso utilizzati quali catalizzatori per reazioni di sintesi e per tecniche analitiche. Questi catalizzatori sono desiderabili in quanto operano con elevati valori di specificit? e efficienza, generalmente in condizioni d? reazione blande.
Poich? gli enzimi ed altri biocatalizzatori sono generalmente solubili in acqua, essi sono adatti per l'uso in sistemi di reazione del tipo a carica. La riutilizzazione di tali enzimi e di altri biocatalizzatori ? limitata per le difficolt? di recuperare questi meteriali dal mezzo di reazione spento, in una forma attiva o utilizzabile. Inoltre i materiali tendono a permanere nel prodotto preparato sotto forma di contaminanti. Allo scopo di evitare questi problemi, sono stati sviluppati procedimenti di immobilizzazione di materiali biologici che presentano attivit? catalitica su supporti solidi ed insolubili. L'immobilizzazione ? intesa dar luogo a materiale biologico stabilizzato che pu? resistere ai rigori di un uso ripetuto o continuo.
Sono stati riportati vari,sistemi di immobilizzazione per materiali biologici. Gli enzimi sono stati immobiiiz-? zati per assorbimento .su materiale' insolubili come ad esempio carbone dolce, vetro, cellulosa, gel di fosfato di calcio, montmorillonite e resine organiche a scambio ionico. L'immobilizzazione ? anche stata ottenuta intrappolando in gel di ?amido ed acrilammide, con legame covalente tra gli enzimi ed i polimeri organici insolubili, come pure con legame covalente tra le molecole di enzima stesse.,
I procedimenti 'della tecnica nota danno spesso luogo a prodotti con attivit? biologica ridotta, quando confrontati con quelli del corrispondente materiale biologico non legato. Questi materiali biologici sono noti essere sensibili alla denaturazione o disattivazione termica e chimica. La pertita di attivit? biologica avviene spesso quando le operazioni di immobilizzazione vengono condotte in condizioni severe che possono essere particolarmente problematiche quando sono coinvolte reazioni di condensazione del polimero. Inoltre i prodotti risultanti dai procedimenti della tecnica nota sono spesso svantaggiosi relativamente alle loro caratteristiche idrofile, di resistenza, di durata e di porosit?.
Costituisce pertanto uno scopo della presente invenzione sviluppare un procedimento di immobilizzazione di atieriali
/biologici che non riduce l'attivit? biologica dei prodotti.
Costituisce un ulteriore scopo della presente invenzione.; sviluppare un procedimento -di immobilizzazione di materiali biologici in cui i prodotti risultanti presentano eccellenti valori di resistenza,.durata, porosit? e stabilit? biologica. Costituisce un ulteriore scopo dell'invenzione provvedere un procedimento di immobilizzazione di una quantit? elevata di materiale biologico per unit? di volume del supporto finale (densit? elevata).
E' stato ora scoperto che i materiali biologici possono essere immobilizzati in modo semplice e molto economico, pur mantenendo un grado elevato della loro attivit? catalitica. Il procedimento della presente invenzione produce un composito di materiale biologico insolubilizzato che contiene materiale biologico intrappolato in particelle di vermiculite rivestite con un polimero di polialchilenimmina reticolato o condensato. Avviene una perdita di attivit? molto piccola quando viene preparato il composito e tali compositi presentano valori eccellenti della resistenza e della durata. Inoltre le caratteristiche idrofile di questi materiali possono essere aggiustate variando il grado di reticolazione o condensazione. Il procedimento della presente invenzione produce un composito che pu? essere separato dalla miscela di reazione mediante semplice filtrazione, oppure utilizzato in procedimenti continui ^ reazione, come quelli in cui un substrato reagente fluisce attraverso un reattore a colonna impaccato.
In accordo con il procedimento della presente invenzione, particelle di vermiculite vengono poste a contatto con il materiale biologico, come cellule intere bagnate raccolte da un brodo di fermentazione. Il materiale biologico viene assorbito nelle particelle di vermiculite. Viene aggiunta polialchilenimmina alla vermiculite in modo da rivestire le particelle. Dialdeide glutarica pu? quindi essere aggiunta per reticolare la polialchilenimmina e/o il materiale biologico per formare un rivestimento duro e permeabile. La polialchilenimmina pu? eventualmente essere combinata con un acido poiicarbossilico per formare un pre-polimero solubile in acqua prima di essere mescolato con la vermiculite. Si pu? aggiungere un agente di condensazione, come una carbodiimmide. L'aggiunta di un agente di condensazione comporta la formazione di un composito di materiale biologico in cui il materiale biologico ? immobilizzato nella vermiculite rivestita con polimero.
L'immobilizzazione di materiale biologico entro la vermiculite pu? avvenire per intrappolamento fisico, mediante legame covalente della polialchilenimmina tramite l'agente di reticolazione o condensazione ed i gruppi reattivi del materiale biologico, oppure mediante reticolazione entro le particelle di vermiculite tramite un materiale adatto di reticolazione. Ad esempio il materiale biol?gico pu? essere immobilizzato tramite legame covalente, dato ; che i gruppi amminico e carbossilico del materiale biologico possono sostituirsi sia ad un gruppo amminico sulla polialchilenimmina o ad un gruppo carbossilico sull'acido policarbossilico e diventare infine, legati covalentemepte al polimero tramite un agente di condensazione.
Il procedimento della presente invenzione consente la preparazione di una grande variet? di compositi di materiali biblogici. Il" materiale biologico pu?. comprendere enzimi, cellule microbiche, antigeni, anticorpi, antibiotici, coenzimi, cellule vegetali, c?llule animali, batteri, lieviti, funghi, colture di tessuti o miscele relative. I materiali biologici vengono preferibilmente aggiunti alla vermiculite in forma acquosa. E' stato scoperto che la vermiculite costituisce un supporto eccellente per l'immobilizzazione di un materiale biologico. Le particelle di vermiculite sono capaci di assorbire quantit? molto grandi di materiali biologici, dando cos? luogo ad una elevata densit? di carico. La vermiculite ? inoltre molto economica e facilmente reperibile, ci? che la rende molto utile per l'uso quale supporto nella produzione di prodotti in grande scala. Infine il supporto risultante dalla immobilizzazione ottenuto mediante il presente procedimento di immobilizzazione di materiale biologico, ? rigido ed altamente attivo. . Si ? determinato che la grandezza delle particelle di vermicolite utilizzate nel procedim?nto di immobilizzazione della presente.invenzione pu? variare in modo sostanziale. Ad esempio la grandezza delle particelle di vermicolite'pu? variare da una polvere fine a circa 1 cm, preferibilmente da circa 0,5 a 1 mm. La quantit? di materiale biologico aggiunto alla vermiculite pu? variare in accordo con l'uso finale specifico del composito di materiale biologico. Generalmente esso varia da.circa 0,001 a 2. g (su base ponderale anidra) per grammo divermiculite utilizzata, preferibilmente da circa 0,01 a circa 1 g per grammo di vermiculite.
I compositi di materiale biologico preparati con il procedimento della presente invenzione possono differire grandemente per quanto riguarda le caratteristiche idrofile, di resistenza, di durata e di porosit?. Diminuendo l'entit? con la quale il polimero utilizzato per rivestire la vermiculite viene reticolato o condensato, pu? comportare un composito dotato di caratteristiche idrofile superiori. L'aggiunta di agenti di reticolazione polifunzionali pu? aumentare la resistenza e la durata del composito polimero-vermiculite-materiale biologico, mentre gruppi funzionali addizionali condensano ulteriormente il polimero di polialchilenimmina e danno luogo ad un composito pi? idrofobo .
La porosit? globale della matrice pu? essere aumentata mediante aggiunta di un materiale in particelle solubile in acqua alla miscele del polimero prima delle sue completa condensazione. Il materiale anidro viene allontanato successivamente per aggiunta di acqua'dopo la condensazione , ci? che discioglie il solido. La porzione del composito precedentemente allontanata dai solidi viene lasciata vuota, aumentando cos? la porosit? della matrice. Per aumentare l? porosit? della miscela si pu? utilizzare qualsiasi . materiale in particelle solubile in acqua, che non influenza negativamente in modo significativo il polimero, la vermiculite o il materiale biologico. Acidi policarbossilici solubili in acqua, come quelli che vengono fatti reagire con la polialchilenimmina non condensata, sono particolarmente adatti per aumentare la porosit? della matrice, in quanto la quantit? in eccesso utilizzata per aumentare la porosit? non interferisce sostanzialmente con le reazioni di condensazione.
Le polialchilenimmine utilizzate nel procedimento e nei compositi della presente invenzione sono polimeri che possono essere sintetizzati mediante polimerizzazione di addizione con catalizzatore acido di monomeri di alch?lenimmina. Tali polimeri presentano generalmente un peso molecolare variabile da 30.000 a 100.000, in dipendenza delle condizioni di reazione e preferibilmente presentano -una struttura a catena ramificata.
La polietilenimmina (PEI) costituisce la pol.ialchilenimmina preferita, in quanto ? normalmente di facile reperimento a prezzo relativamente basso e funziona bene nelle reazioni .di condensazione utilizzate secondo il presente procedimento. La polietilenimmina viene preparata mediante polimerizzazione di apertura dell'anello della etilenimmina in presenza di catalizzatori, come acidi minerali. Il polimero ? altamente ramificato e contiene gruppi ammanici primari, secondari e terziari. PEI ? solubile in acqua e dopo reticolazione o condensazione delle catene polimeriche d? luogo ad un prodotto insolubile in acqua.
La polietilenimmina pu? essere reticolata mediante un agente di reticolazione amminico per impartire stabilit? addizionale e resistenza addizionale. Questo trattamento comporta il fatto che il materiale biologico viene intrappolato, con una certa reticolazione tra la polialchilenimmina ed i gruppi amminici liberi del materiale biologico. Gli agenti di reticolazione comprendono dialdeide glutarica, diisocianati , poliisocianati , 2,4,6-tricloro-s-triazina, bisossirano, bisimmidato, divinilsolfone, 1 ,5-difluoro-2,4--dinitrobenzene e simili. La dialdeide glutarica ? preferita per tale scopo.
La polialchilenimmina viene generalmente aggiunta al composito in quantit? sufficiente da rivestire sostan- . zial-mente'le-particelle di vermicul?te e questa quantit? varia sostanzialment? in dipendenza della grandezza delle particelle della vermicul?te,. della natura dei materiali biologici e delle caratteristiche fisiche desiderate. Generalmente la polialchilenimmina pu? variare da circa 0,5 a circa 25% in 'peso nel composito e preferibilmente varia da circa 2% ? circa 15% in p?so del composito. La quantit? di agente di reticolazione e/o condensazione utilizzata ? c?llegata alla quantit? di polialchilenimmina, come pi? oltre-indicato.
Un procedimento altamente efficiente di condensazione della polietilenimmina utilizza un acido policarbossilico (PCA) per collegare a ponte i gruppi amminici su catene adiacenti di PEI. Gli agenti di condensazione, preferibilmente carbodiimmidi, influenzano facilmente la reazione di condensazione. Le reazioni coinvolte nella formazione di polietilenimmina condensata della presente invenzione vengono illustrate di seguito:
La reazione (1) illustra la polimerizzazione di etilenimmina per formare P?I avente una struttura di catena ramificata, in cui-n e n' sono?interi superiqri a O e n"-pu? essere 0 (indicando che ? assente il gruppo (CH2CH2NH]?) oppure superiore a 0. La.reazione (2) mostra la formazione di un sale.dei gruppi amminici di PEI con un acido policarbossilico, in cui R pu? essere un .gruppo sostituito o idrocarburico, le reazioni (3) e (4) mostrano la condensazione di PEI e dell'acido policarbossilico, utilizzando l'agente di condensazione carbodiimmide. R ed R' sono gruppi idrocarburici .che, unitamente agli altri reagenti ed alle altre condizioni di reazione per le reazioni illustrate, vengono descritti pi? completamente di seguito.
In generale gli acidi policarbossilici adatti per l'uso secondo la presente invenzione possono essere acidi carbossilici sostituiti o non sostituiti dotati di almeno due gruppi carbossilici. Preferibilmente gli acidi policarbossilici sono solubili in acqua, in modo tale che essi possono essere utilizzati per aumentare la porosit? del composito, come pure per condensare la polialchilenimmina. Esempi di acidi policarbossilici che possono essere utilizzati nei procedimenti e nei compositi della presente invenzione, comprendono gli acidi adipico, azelaico, 1,11?undecanoico, 1,12-dodecanoico, traumatico, pentadecandioico, esadecandioico, sebacico, suberico, glutarico, maionico, pimelico, succinico, malico, maleico, glut?mmico, aspartico, ossalico, fumarico, poliaspartico' e simili. Gli acidi bicarbossilici sono preferiti per l'uso secondo la presente invenzione e comprendono l'acido maleico, l'acido succini? co, l'acido glutarico e l'acido adipico. Gli acidi policarbossilici superiori possono essere qualsiasi sostanza che contiene 2 o pi? gruppi acidi carbossilici e comprendono materiali polimerici con peso molecolare elevato, come acido poliaspartico, aventi un peso molecolare da 5.000 a 50.000. Le reazioni di condensazione sono generalmente . esotermiche, pertanto le miscele di reazione vengono vantaggiosamente raffreddate ad una temperatura che non sia deleteria verso il materiale biologico da immobilizzare, ad esempio 37?C o meno.
Il rapporto molare tra l'acido policarbossilico e la polialchilenimmina (PCA:PAI) pu? variare entro ampi limiti, data la variazione del peso molecolare dei reagenti. Generalmente tale rapporto varia da 1:20 a 1:0,0005. Quando viene aggiunto l'acido policarbossilico per aumentare la porosit? del composito della presente invenzione, si utilizza spesso un considerevole eccesso molare dell'acido policarbossilico;
L'acido policarbossilico pu? essere aggiunto nella quantit? per la condensazione alla polialchilenimmina in condizioni di pre-polimerizzazione per formare un pre-polimero solubile in acqua. Il pre-polimer? ? generalmente un liquido, viscoso, al quale pu? essere convenientemente aggiunta la vermiculite contenente il materiale biol?gico immobilizzato e mantenuta in sospensione durante la reazione di condensazione. L'agente di condensazione viene quindi aggiunto per.effettuare la condensazione.e la solidificazione del composito prepolimero-vermiculite. Il pH della miscela di reazione viene mantenuto ad un livello che sostanzialmente non disattiva o non influenza negativamente il materiale biologico. Il pH pu? variare da circa 2 a circa 12 e preferibilmente varia da circa 5 a circa 10.
Come sopra notato, per far avvenire la condensazione delle catene della polialchilenimmina tramite gli acidi policarbossilici, viene vantaggiosamente utilizzato un agente di condensazione. Generalmente si pu? utilizzare qualsiasi agente di condensazione che catalizza o facilita la reazione tra animine ed acidi carbossilici. Esempi di tali agenti di condensazione comprendono N-etil-5-fenilisoazolio-3-solfonato, n-etossicarbonil?2-etossi-l,2?diidrochinolina e varie carbodiimmidi. Gli agenti di condensazione carbodiimmide che possono essere utilizzati nella composizione della presente invenzione presentano la formula R'-N=C-CN-R" in cui R' e R" sono gruppi idrocarburici contenenti da 3 a circa 20 atomi di carbonio, preferibilmente da circa 5 a circa 12 atomi di carbonio. Tali agenti di condensazione comprendono 1-eti1-3,3-dimetilamminopropi lcarbodiimrnide, dicicloesilcarbodiiinmide, l-cicloesil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimmidemeto-p-toluensolfonato , o . sali relativi. Gli.agenti di condensazione carbodiimrnide vengono aggiunti alla miscela di reazione in quantit? per la condensazione, che generalmente ? sostanzialmente la quantit? stechiometrica; ad esempio da circa 0,2 a 3 volte, preferibilmente da circa 0,5 a 1,5 volte la quantit? stechiometrica. Ciascuna molecola di carbodiimmide reagisce con un singolo gruppo acido dell'acido policarbossi lico. Ad esempio il rapporto molare tra carbodiimmide ed acido dicarbo'ssilico di circa 2:1 viene generalmente utilizzato nel procedimento della presente invenzione. Dopo aggiunta dell'agente di condensazione alla temperatura ambiente, avviene una polimerizzazione entro 30 secondi, che generalmente ? completa entro circa 2 ore.
Quando la polietilenimmina ? stata insolubilizzata mediante l'aggiunta di un agente di condensazione, uno stadio eventuale di post-trattamento comporta la reticolazione della vermiculite condensata e rivestita con un agente di reticolazione amminico, come dialdeide glutarica, come sopra indicato, per provvedere resistenza e stabilit? addizionali al composito finale.
Mediante l'uso dei procedimenti descritti secondo la presente invenzione risulta possibile immobilizzare una grande variet? di materiali biologici per produrre . nuovi compositi biocatalitici. Negli esempi che seguono, vengono descritte con maggior dettaglio le procedure di immobilizzazione. Questi esempi descrivono il modo ed il procedimento per preparare ed utilizzare l'invenzione e mostrano varie forme di attuazione dell'invenzione, ma non devono essere considerati limitativi.
Esempio I
80 g di pasta di cellule di E.coli contenenti aspartaS i con circa 75% in peso di acqua, fu preparata da E.coli fresco contenente aspartasi. Per formare la pasta il mezzo di fermentazione fu preparato sciogliendo in un litro di acqua: 24 grammi di estratto di lievito, 30 grammi di acido fumarico, 2 grammi di carbonato di sodio, 2 mM di solfato di magnesio e 0,1 mM di cloruro di calcio ed il valore di pH fu aggiustato a circa 7,2 con idrossido di ammonio. Questo mezzo fu inoculato con 1 mi di una coltura di E.coli (ATCC No. 31976) che era stato sottoposto ad incubazione per 12-16 ore a 37?C in mezzo di peptone contenente 0,5% di glutammato monosodico. Il mezzo inoculato fu sottoposto ad incubazione per 12?14 ore a 37?C. Le cellule furono raccolte mediante centrifugazione a 5000 giri per minuto per 30 minuti.
80 grammi di E.coli contenenti aspartase furono aggiunti a 20 grammi di particelle di vermiculite. Dopo che la pasta delle cellule fu lasciata assorbire nella vermiculite, furono aggi?nti.10 grammi di polietileni.mrnina ; alla miscela e si agit? fino ad ottenere una buona distribuzione. Fu quindi aggiunta dialdeide glutarica (20 grammi di una soluzione al 25% in acqua^e si mescol? fino ad ottenere particelle dure. Una seconda carica di-materiale fu preparata mediante? la stessa procedura. Entrambe le cariche di materiale furono lasciate essiccare per una notte.
Il materiale fu impaccato in una colonna con un volume finale d?i letto di'353 cc. La colonna fu quindi utilizzata per convertire fumarato di ammonio in acido
L-aspartico. Una soluzione 1,5 M di fumarato di ammonio
con solfato di magnesio 1 mM, pH 8,5, a 37?C, fu fatta passare attraverso la colonna a 360 cc/ora (1,0 SV^ ^).
L'effluente fu controllato relativamente alla attivit?
di aspartasi misurando la scomparsa dell'acido fumarico
allo spettrofotometro a 240 nm. La colonna fu mantenuta
in operazione continuamente per 151 giorni. Durante questo
tempo furono saggiati campioni dell'effluente della colonna
per determinare il percento di conversione del substrato.
I risultati vengono riportati nella tabella 1.
TABELLA I
Esempio II
Fu seguita la procedura generale dell'esempio 1 utilizzando 120 grammi di pasta di cellule e 15 grammi di polietilenimmina. Una carica di materiale immobilizzato fu impaccata in un reattore a colonna con volume del letto di 173 cc. La colonna-fu utilizzata con successo nel convertire 99% di una soluzione di fumarato di ammonio 1,8 M a 360 cc/ora (2,08 SV ). La produttivit? di questa colonna viene calcolata pari a 493 grammi di acido L-aspartico prodotto/litro di volume di cellule immobilizzate/ora a 37?C (3,7 moli/litro/ora).
Esempio III
Dieci cariche di cellule di E.coli immobilizzate (100 grammi di vermiculite/carica) furono preparate mediante la procedura generale dell'esempio II.
Il biocatalizzatore fu Quindi impaccato in una
colonna con volume del letto paria 12,5 litri. Fu fatto
passare fumarato di ammonio (.1,8- M)' a 37?C, attraverso la
colonna con varie velocit? di flusso e l'effluente fu
saggiato relativamente alla conversione del. fumarato di
ammonio come nell'esempio I. La tabella II mostra i risultati della prova.
TABELLA II .
Esempio IV
La procedura generale dell'esempio III fu ripetuta
con una carica fresca di cellule di E.coli con l'eccezione
che le cellule fresche contenevano una attivit? 29% superiore di quella della carica precedente. Quando il substrato
fu fatto passare attraverso la colonna alla velocit? di
62,5 litri/ora (come nell'esempio III) la quantit? di acido
aspartico prodotto fu pari a 10,56 kg/ora (6,35 moli/litro/ora). Ci? costituisce un incremento del 27% nella produttivit? rispetto all'esempio III.
Esempio V
L'enzima triptofano sintetasi pu? essere utilizzato nel procedimento della,presente invenzione per catalizzare la conversione di indolo e serina in triptofano. Furono mescolati assieme particelle di vermiculite .(2 grammi) e 4 mi di soluzione,di estratto greggio di triptofano sintetasi. L'estratto,fu' lasciato assorbire nella vermiculite. Fu quindi aggiunta polietilenimmina (1 grammo) alla?miscela per rivestire le particelle di vermiculite. Fu quindi aggiunta dialdeide? glutarica .(2 mi di soluzione al 25% in acqua) a si mescol? fino ad ottenere particelle rivestite e dure. L'intera quantit? di materiale fu quindi posta in una colonna e fu lavata con una soluzione di substrato consistente di serina 0,05 M, indolo 0,05 M, glutatione 0,005 M, fosfato potassico bibasico 0,005 M e 200 mg di piridossale-5-fosfato/litro, pH aggiustato a 7,8. La colonna fu quindi ripetutamente utilizzata in un sistema a carica circolante per produrre 80 mg di L-triptofano in 24 ore.

Claims (37)

RIVENDICAZIONI
1. Procedimento per immobilizzare materiali .biologici mediante preparazi?ne di un composito insolubilizzato di materiale biologico, che comprende gli stadi di:
(a) aggiungere particelle di vermiculite ad un mezzo acquoso di materiale biologico;
(b) consentire che detto mezzo acquoso di materiale biologico venga assorbito in detta vermiculite;
(c) rivestire detta vermiculite con un polimero di polialchilenimmina; e
(d) reticolare detta vermiculite rivestita con un agente di reticolazione amminico o condensare con un agente di condensazione.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta vermiculite rivestita con polimero di polialchilenimmina viene mescolata con un agente di reticolazione di un agente di reticolazione amminico per immobilizzare il materiale biologico entro detta vermiculite rivestita.
3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto polimero di polialchilenimmina viene mescolato con una quantit? condensante di un acido policarbossilico per produrre un polimero solubile in acqua precondensato e parzialmente polimerizzato prima della miscelazione con detta vermiculite.
4. Procedimento secondo le rivendicazioni l o 3, caratterizzato dal fatto che detta vermiculite? rivestita viene condensata mediante aggiunta di .una quantit? condensante di un agente di condensazione carbodiimmide in condizioni di condensazione.
5;. Procedimento -secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto di comprendere ulteriormente il modificare il composito di .materiale biologico insolubilizzato mediante post-trattamento con un agente di reticolazione amminico per impartire .resistenza e stabilit? addizionali al composito.
6. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2, 3 o 4, caratterizzato dal fatto che PAI presenta un peso molecolare da circa 30.000 a circa 100.000.
7. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2, 3, 4 o 5, caratterizzato dal fatto che il polimero di polialchilenimmina viene scelto nel gruppo consistente di polieti? lenimmina, polipropilenimmina , polibutilen-immina e polipen? tilenimmina.
8. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2, 3, 4 o 5, caratterizzato dal fatto che il polimero di polialchilenimmina ? polietilenimmina.
9. Procedimento secondo le rivendicazioni 3 o 4, caratterizzato dal fatto che l'acido policarbossilico ? un acido bicarbossilico.
10. Procedimento secondo le rivendicazioni 3 o 4, caratterizzato dal fatto che l'acido policarbossilico viene sceltd nel gruppo consistente di acido maleico, acido succinico ed acido.adipico.
11. Procedimento secondo le rivendicazioni 3-o 4, caratterizzato dal fatto che 1'acido policarbossilico ? l'acido succi nico.
12. ? Procedimento secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che l'agente di condensazione carbodiimmide viene' scelto nel gruppo consistente di 1?alchi1-3,3?di? metilamminopropilcarbodiimmide cloridrato, dicicloesilcarbodiimmide e 1?cicloesil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimmidemeto--p?toluensolfonato e sali relativi.
13. Procedimento secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che l'agente di condensazione carbodiimmide ? 1?etil?3,3?dimetilamminopropilcarbodiimmide o un sale relativo.
14. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 o 5, caratterizzato dal fatto che l'agente di reticolazione amminico viene scelto nel gruppo consistente di dialdeide glutarica, diisocianati , poliisocianati , 2,4,6-tricloro-5--triazina, bisossirano, bisimmidato, divinil-solfone e 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene .
15. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 o 5, caratterizzato dal fatto che detto agente di reticolazione amminico ? dialdeide glutarica.
16. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la quantit? di detto agente biologico aggiunto a detta vermiculite varia da circa 0,001 a circa 2 grammi, su base ?nidra, per grammo di vermiculite.
17. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che il rapporto molare della p?lialchilenimmina rispetto all'acido policarbossilico varia da circa 1:20 a 1:0,0005.
18. Procedimento secondo la rivendicazione 17, caratterizzato dal fatto che la carbodiimmide viene utilizzata in quantit? variabile da circa 0,2 a 3 volte la quantit? stechiometrica, relativamente all'acido policarbossilico.
19 Procedimento secondo la rivendicazione 17, caratterizzato dal fatto che la carbodiimmide viene utilizzata in quantit? variabile da circa 0,5 a 1,5 volte la quantit? stechiometrica, relativamente all'acido policarbossilico.
20. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, .2 3 o 4, caratterizzato dal fatto che il materiale biologico immobilizzato ? un enzima
21. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 3 o 4, caratterizzato dal fatto che il materiale biologico immobilizzato comprende cellule intere
22. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 2, 3 o 4, caratterizzato dal fatto che il materiale biologico ? aspartasi prodotto microbiologicamente.
23. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2, 3 o 4, caratterizzato dal fatto che l'enzima ? triptofano si?ntetasi.
24. Composito di materiale biologico insolubilizzato comprendente un materiale biologicamente attivo adsorbito in particelle di vermicolite che vengono immobilizzate in un polimero di polialchilenimmina, in cui detto polimero ? reticolato con un agente di reticolazione amminico.
25. Composito secondo'la rivendicazione 24,- caratterizzato dal fatto che l'agente reticolante amminico viene scelto nel gruppo consistente di dialdeide glutarica, diisocianati, poliisocianati , 2,4,6-tricloro-S-triazina, bisossirano, bisimmidato, divinilsolfone e 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene .
26. Composito secondo la rivendicazione 24, caratterizzato dal fatto che l'agente reticolante amminico ? dialdeide glutarica.
27. Composito di materiale biologico insolubilizzato comprendente un materiale biologicamente attivo adsorbito in particelle di vermiculite che vengono immobilizzate in un polimero di polialchilenimmina, in cui detto polimero ? condensato mediante un agente di condensazione.
28. Composito secondo la rivendicazione 27, caratterizzato dal fatto che l'agente di condensazione viene scelto nel gruppo consistente di l-etil3,3-dimetilamminopropilcarbodiimmide cloridrato.dicicl?esilcarbodiimniide, l-ciclo'esil--3-(2-m?rf'olinoeti1)carbo'diimmidem?to-p-tpluensolfonato e sali relativi.
29... Composito secondo la rivendicazione 27, caratterizzata. dal fatto che l'agente di condensazione ? 1-etil?3,3-dimetilamminopropilcarbodiimmide cloridrato o un siio sale.
30.? Composito secondo le rivendicazioni 24 o 27, caratterizzato dal fatto che il polimero di polialchilenimmina viene scelto nel gruppo consistente di polietilenimmina, . polipropilenimmina , ?polibutilenimmina e polipentilenimmina.
31. Composito secondo le rivendicazioni 24 o 27, caratterizzato dal fatto che il polimero di polialchilenimmina ? polietilenimmina.
32. Composito secondo le rivendicazioni 24 o 27, caratterizzato dal fatto che il materiale biologicamente attivo viene scelto nel gruppo consistente di enzimi, cellule microbiche, antigeni, anticorpi, antibiotici, coenzimi, cellule vegetali, cellule animali, batteri, lieviti, funghi e colture di tessuti.
33. Composito secondo le rivendicazioni 24 o 27, caratterizzato dal fatto che il materiale biologicamente attivo viene scelto nel gruppo consistente di enzimi e cellule intere.
34. Composito secondo le rivendicazioni 24 o 27, caratterizzato dal fatto che il materiale biologicamente attivo ? aspartasi
35. Composito secondo le rivendicazioni 24 o 27, caratterizzato dal fatto che il materiale biologicamente attivo ? triptofano sintetasi .
36 Procedimento per produrre acido aspartico che comprende- il porre a contatto, in condizioni di produzione dell'acido aspartico, un substrato contenente fumarato di ammonio con un composito di materiale biologico insolubilizzato di aspartasi o cellule?microbiche contenenti aspar-' tasi, assorbite in particelle di vermiculite ed immobilizzate in un polimero di polialchilenimmina, in cui la vermiculite immobilizzata viene reticolata con un agente reticolante amminico o condensata con un agente di condensazione.
37. Procedimento per produrre triptofano che comprende il porre a contatto, in condizioni di produzione del triptofano, un substrato contenente indolo e serina con un composito di materiale biologico insolubilizzato di triptofano sintetasi o cellule microbiche contenenti triptofano sinte? tasi, adsorbite in particelle di vermiculite ed ivi immobilizzate in un polimero di polialchilenimmina, in cui la vermiculite immobilizzata viene reticolata con un agi di reticolazione amminico oppure condensata con un di condensazione.
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