DE3323078A1

DE3323078A1 - Immobilisiertes biologisches material, verfahren zu dessen herstellung und anwendungsverfahren unter verwendung desselben

Info

Publication number: DE3323078A1
Application number: DE19833323078
Authority: DE
Inventors: Wayne Elliott 20852 Columbia Swann, Md.
Original assignee: Genex Corp
Current assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-07-20
Filing date: 1983-06-27
Publication date: 1984-01-26
Also published as: CA1195630A; IT8322155A0; NL8302587A; IT1163824B; GB2125407B; GR79324B; BR8303615A; FR2530657A1; US4504582A; FI832633A0; FI832633A; GB8319625D0; SE8304027L; DK323583D0; LU84920A1; CH661744A5; PL243093A1; SE8304027D0; IL68941A0; DK323583A

Description

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38 835 m/fg

Genex Corporation, Rockville, Maryland / USA

Immobilisiertes biologisches Material, Verfahren zu dessen Herstellung und Anwendungsverfahren unter Verwendung desselben

Die Erfindung betrifft ein immobilisiertes biologisches Material, Verfahren zu dessen Herstellung und Anwendungsverfahrön unter Verwendung desselben.

Biologische Materialien, wie Enzyme oder Enzym-produzierende Mikroorganismeen oder Zellen werden oft als Katalysatoren für synthetische Reaktionen oder für analytische Methoden verwendet. Solche Katalysatoren eignen sich besonders gut, da sie mit hoher Spezifitat und Effizienz unter im allgemeinen milden Reaktionsbedingungen wirken.

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Da Enzyme und andere Biokatalysatoren im allgemeinen wasserlöslich sind, sind sie zur Verwendung bei Reaktionen vom Chargentyp geeignet. Die Wiederverwendung solcher Enzyme und anderer Biokatalysatoren ist begrenzt, was auf die Schwierigkeiten bei der Rückgewinnung dieser Materialien aus den alten Reaktionsmedien in einer aktiven oder verwertbaren Form zurückzuführen ist. Ausserdem neigen diese Materialien dazu, im hergestellten Produkt als Verunreinigungen zu verbleiben. Um diese Probleme zu vermeiden, hat man Methoden zum Immobilisieren biologischer Materialien entwickelt, wobei letztere ihre katalytische Aktivität auf einem unlöslichen festen Träger ausüben. Die Immobilisierung soll dazu dienen, ein stabilisiertes biologisches Material zur Verfugung zu stellen, welches den strengen Anforderungen der wiederholten oder kontinuierlichen Verwendung standhält.

Es werden mehrere Immobilisierungssysteme für biologische Materialien beschrieben. Enzyme wurden durch Absorption an unlösliche Materialien, wie Kohle bzw. Aktivkohle, Glas, Cellulose, Calciumphosphatgel,
Montmorillonit und organische Ionenaustauschharze,
etc., immobilisiert. Eine Immobilisierung wurde auch erzielt durch Einschluss in Stärkeund Acrylamidgele, kovalenter Bindung zwischen Enzymen und unlöslichen organichen Polymeren, sowie einer kovalenten Bindung zwischen den Enzymmolekülen selbst.

-M-

Die im Stand der Technik bekannten Verfahren ergeben häufig Produkte mit einer reduzierten biologischen Aktivität im Vergleich zur Aktivität, die dem nichtgebundenen biologischen Material entspricht. Es ist bekannt, dass diese biologischen Materialien empfindlich gegen Wärmedenaturierung und chemische Denaturierung bzw. Inaktivierung sind. Der Verlust der biologischen Aktivität erfolgt häufig dann, wenn die Immobilisierungsschritte unter harten Bedingungen erfolgen; besonders problematisch ist es, wenn Polymerkondensationsreaktionen durchgeführt werden. Ausserdem sind die nach den herkömmmlichen Verfahren erhaltenen Produkte häufig mit einem Nachteil in bezug auf deren Hydrophilität, Stärke, Beständigkeit und Porosität behaftet.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Immobilisierung biologischer Matererialien zur Verfügung zu stellen, bei welchem keine Reduzierung der biologischen Aktivität der Produkte erfolgt.

Eine weitere Aufgabe gemäss der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Immobilisierung biologischer Materialien zu entwickeln, nach welchem die erhaltenen Produkte eine ausgezeichnete Stärke, Beständigkeit, Porosität und biologische Stabilität aufweisen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Immobilisierung einer grossen Menge an biologischem Material pro Einheitsvolumen des Trägers (final support) zur Verfügung zu stellen (hohe Dichte) .

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Es wurde nun von der Anmelderin gefunden, dass biologische Materialien auf einfache und sehr ökonomische Weise immobilisiert werden können, wobei ein hoher Grad an katalytischer Aktivität derselben beibehalten wird. Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht die Herstellung eines insolubilisierten biologischen Materialverbunds, welcher das biologische Material eingefangen bzv/. eingeschlossen in Vermiculit-Teilchen enthält, die mit einem Polymerbeschichtet sind. Je nach dem gewählten Polymer und der Natur des im Vermiculit eingeschlossenen biologischen Materials kann es vorteilhaft sein, das Polymer zu vernetzen oder zu kondensieren. Bei Herstellung des Verbundes tritt nur ein sehr geringer Aktivitätsverlust auf; diese Verbunde zeigen eine ausgezeichnete Stärke und Beständigkeit. Wenn ausserdem das Polymer vernetzt oder kondensiert wird, kann die hydrophile Eigenschaft dieser Materialien eingestellt werden, indem man das Ausmass der Vernetzung oder Kondensation variiert.

Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht die Herstellung eines Verbundes, der aus den Reaktionsgemischen durch einfache Filtration abgetrennt oder in kontinuierlichen Reaktionsprozessen verwendet werden kann, wie z.B. solchen Verfahren, bei denen das reagierende Substrat durch einen gepackten Säulenreaktor fliesst.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden Vermiculi t-Teilchen mit dem biologischen Material, wie ganze Nasszellen, die aus einer Fermentationsbrühe geerntet wurden, in Kontakt gebracht. Das biologische Material wird in den Vermeculit-Teilchen absorbiert. Ein polymeres Beschichtungsmaterial wird zu dem Vermiculit

zugegeben, um die Teilchen zu beschichten. Es können dann verschiedene Vernetzungsmittel, Kondensationsmittel und gelierende Agentien zur Vernetzung und Verstärkung des Polymers und/oder des biologischen Materials unter Bildung einer harten permeablen Beschichtung zugegeben werden. Gegebenenfalls kann das Polymer mit einer Polycarbonsäure verbunden werden, um ein wasserlösliches Prepolymer zu bilden, bevor dieses mit dem Vermiculit vermischt wird. Dieses Verfahren führt zur Bildung eines biologischen Materialverbunds, in welchem das biologische Material in dem Polymer-beschichteten Vermiculit immobilisiert ist.

Die Immobilisierung von biolgischem Material in dem Vermiculit kann durch physikalischen Einschluss, durch kovalente Bindung des Polymers über das Vernetzungs- oder Kondensationsmittel und reaktive Gruppen auf dem biologischen Material, oder durch Vernetzung in den Vermiculit-Teilchen über ein geeignetes Vernetzungsmaterial erfolgen. Wenn z.B. das Polymer ein Polyalkylenimin darstellt, kann das biologische Material durch kovalente Bindung immobilisiert werden, da die Amin- und Carbonsäuregruppen des biologischen Materials als Ersatz für entweder eine Amingruppe an dem Polyalkylenimin oder eine Carbonsäuregruppe an einer Polycarbonsäure, die zu dem beschichteten Vermiculit zugefügt werden können, dienen können. Die kovalente Bindung an das Polymer erfolgt schliesslich durch ein Kondensationsmittel.

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Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt die Herstellung einer grossen Palette von biologischen Materialverbunden. Das biologische Material kann umfassen: Enzyme, Mikrobenzellen, Antigene, Antikörper, Antibiotika, Coenzyme, Pflanzenzellen, tierische Zellen, Bakterien, Hefen, Pilze, Gewebekulturen oder Gemische derselben. Vorzugsweise werden biologische Materialien zu dem Vermiculit in wässriger Form zugegeben.

Von der Anmelderin wurde gefunden, dass Vermiculit einen besonders bevorzugten Träger für die Immobilisierung biologischen Materials darstellt. Vermiculit-Teilchen sind in der Lage, sehr grosse Mengen biologischen Materials zu absorbieren, wodurch sich eine hohe Ladungsdichte ergibt. Vermiculit ist ausserdem nicht teuer und ohne weiteres verfügbar, was dessen Verwendung als Träger für die Produktherstellung in grossem Massstab besonders ökonomisch macht. Schliesslich ist das nach diesem Verfahren der Immobilisierung biologischen Materials erhaltene immobilisierte Produkt (immobilization support) fest und in hohem Masse aktiv.

Es hat sich gezeigt, dass die Teilchengrösse des bei dem Immobilisierungsverfahren gemäss der Erfindung verwendeten Vermiculits in weitem Masse variieren kann. So kann z.B. die Teilchengrösse des Vermiculit von einem feinen Pulver bis ca. 1 cm, vorzugweise ca, 0,5 bis 1 mm, variieren. Die Menge des zu dem Vermiculit zugegebenen biologischen Materials kann je nach dem spezifischen Verwendungszweck des biologischen Materialverbunds schwanken. Im allgemeinen liegt sie im Bereich von ca. 0,001 bis 2 g (Trockengewichtsbasis) pro g an verwendetem Vermiculit, vorzugsweise von ca. 0,01 bis ca. 1 g pro g Vermiculit.

Die biologischen Materialverbunde, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt werden, können in hohem Masse in ihrer hydrophilen Charakteristik, Stärke, Beständigkeit und Porosität variieren. Die Veringerung des Ausmasses der Vernetzung oder Kondensation des zur Beschichtung des Vermiculit verwendeten Polymeren kann einen Verbund ergeben, der eine grössere hydrophile Charakteristik besitzt. Die Zugabe von multifunktionellen Vernetzungsagentien kann die Stärke und Beständigkeit des Polymer-Vermiculit-Biologisch-Materialverbunds erhöhen, wenn die zusätzlichen funktioneilen Gruppen des Polymer stärker kondensieren und zu einem stärker hydrophoben Verbund führen.

Die Gesamtporosität der Matrix kann durch Zugabe eines wasserlöslichen teilchenförmigen Material zu dem Polymergemisch, bevor er vollständig kondensiert ist, erhöht werden. Das trockene Material wird im folgenden durch Zugabe von Wasser nach der Kondensation, welches den Feststoff auflöst, entfernt. Der Bereich des Verbundes, der vorher von den Feststoffen eingenommen worden war, bleibt frei, wodurch die Porosität der Matrix erhöht wird. Jedes beliebige wasserlösliche teilchenartige Material, welches das Polymer, den Vermiculit oder das biologische Material nicht in signifikanter Weise nachteilig beeinflusst, kann zur Erhöhung der Porosität des Gemisches verwendet werden. Besonders geeignet sind wasserlösliche Polycarbonsäuren, wie z.B. solche, die mit den nicht kondensierten Polymeren reagierten, sind besonders für die Erhöhung der Matrixporosität geeignet, da im Falle der Verwendung überschüssiger Mengen zur Erhöhung der Porosität, diese praktisch die Kondensationsreaktionen nicht beeinflussen

Die bei dem erfindungsgemässen Verfahren und den Verbunden gemäss der Erfindung verwendeten Polymere variieren in ihrem Molekulargewicht, je nach den Reaktionsbedingungen; vorzugsweise haben sie eine verzweigte Kettenstruktur. Gemäss der Erfindung kann eine Vielzahl von polymeren Materialien verwendet werden, einschliessliche Polyalkylenimine, Polysaccharide, Polyacrylamid, Polyurethan, Alginat und Carageenan. Bevorzugte Polymere sind die Polyalkylenimine.

Polyalkylenimine können durch säurekatalysierte Additionspolymerisation von Alkylenimin-Monomeren synthetisiert werden. Ein bevorzugtes Polyalkylenimin stellt Polyethylenimin (PEI) dar, da es gegenwärtig zu einem geringen Preis verfügbar ist und bei den Kondensationsreaktionen, wie sie gemäss der Erfindung angewendet werden, gute Dienste leistet. Polyethylenimin wird hergestellt durch Ringöffnungs-Polymerisation von Ethylenimin in Gegenwart von Katalysatoren, wie z.B. Mineralsäuren. Das Polymer ist stark verzweigt und enthält primäre, sekundäre und tertiäre Amingruppen. PEI ist wasserlöslich; nach Vernetzung oder Kondensation der Polymerketten erhält man ein wasserunlösliches Produkt.

Das Polyethylenimin kann mit einem Amin-Vernetzungsmittel vernetzt werden, was ihm eine zusätzliche Stabilität und Stärke verleiht. Diese Behandlung führt zu einem eingeschlossenen biologischen Material, wobei zwischen dem Polyalkylenimin und den freien Aminogruppen des biologischen Materials ebenfalls eine geringe Vernetzung erfolgt. Vernetzungsmittel umfas-

sen Glutardialdehyd, Diisocyanate, Polyisocyanate, 2,4,6-Trichloro-s-triazin, Bisoxiran, Bisimidat, Divinylsulfon, 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol und dergleichen. Für den genannten Zweck ist Glutardialdehyd besonders bevorzugt.

Im allgemeinen wird das entsprechende Polymer zu dem Verbund in ausreichender Menge zugegeben, um die Vermiculit-Teilchen im wesentlichen zu beschichten; diese Menge kann in einem weiten Bereich schwanken, je nach der Teilchengrösse des Vermiculits, der Natur der biologischen Materialien und der gewünschten physikalischen Eigenschaften. Im allgemeinen kann das Polymer in einem Bereich von ca. 0,5 bis ca. 25 Gew.-% des Verbundes, vorzugsweise in einem Bereich von ca. 2 bis ca. 15 Gew.-% der Verbundes, betragen. Die Menge des Vernetzungsmittels und/oder Kondensationsmittels richtet sich nach der Polymermenge, wie nachstehend diskutiert wird.

Wenn das Polymer Polyethylenimin darstellt, so nutzt ein hoch effizientes Kondensationsverfahren eine Polycarbonsäure (PCA), um Amingruppen an benachbarten PEI-Ketten über eine Brücke zu verbinden. Kondensationsmittel, vorzugsweise Carbodiimine, beeinflussen die Kondensationsreaktion. Die entsprechenden Reaktionen, die zur Herstellung von kondensiertem Polyethylenimin gemäss der Erfindung durchgeführt werden, sind nachstehend aufgeführt:

(1)

-CH₂--> ICH₂CH₂N]_n [CH₂CH₂NH] 0.

' I

N ICH₂CH₂NH]_n--CH₂CH₂NH₂

(2)

(PEI)

NH₂

. COOH

I R

COOH

NH₂

(PEI) (PEI)

0 NH₃

Il C-O"

C-O"

NH₃

(PEI)

(PE!)

0 M Π	'3⁺	R' I
11 C-O"	I N
I	Il
I	C
R + 2	Il -
I	N
C-O" NH₃ ⁺ Il "	R"
I I O
	(CDI)

(PEI) (PEI)

0 NH₂

C-O-C

> R

C-O-C

NH₂

,NH-R¹ N-R"

.N-R"

NH-R¹

(PEI)

NH₂

^NH-R'

C-O-C.

N-R"

C-O-C

NH-R'

NH₂ (PEI)

O=C R

0-C NH

R" NH-

+ 2 O=C NH R¹

(PEI) (PEI)

IS;.-·

- 49

Reaktion (1) zeigt die Polymerisation von Ethylenimin zur Bildung von PEI mit einer verzweigten Kettenstruktur, wobei η und n¹ ganze Zahlen, die grosser als 0 sind, darstellen, und η" Ο (was bedeutet, dass die [CH„CH„NH]-Gruppe nicht vorliegt) oder grosser als 0 sein kann. Reaktion (2) zeigt die Salzbildung der Amingruppen von PEI mit einer Polycarbonsäure, wobei R eine substituierte oder Kohlenwasserstoffgruppe darstellen. Reaktionen (3) und (4) veranschaulichen die Kondensation von PEI und Polycarbonsäure unter Verwendung eines Carbodiimid-Kondensationsmittels. R und R¹ sind Kohlenwasserstoffgruppen, die ebenso wie andere Reaktanten und die Bedingungen der vorstehend angegebenen Reaktionen, nachstehend näher erläutert werden.

Im allgemeinen stellen die gemäss der Erfindung geeigneten Polycarbonsäuren substituierte oder nichtsubstituierte Carbonsäuren mit mindestens zwei Carboxylgruppen dar. Vorzugsweise sind die Polycarbonsäuren wasserlöslich, so dass sie eingesetzt werden können, um die Porosität des Verbundes zu erhöhen, als auch zur Kondensation des Polyalkylenimins. Beispiele von Polycarbonsäuren, die bei dem erfindungsgemässen Verfahren und für die Verbünde gemäss der Erfindung verwendet werden können, umfassen Adipinsäure, Azelainsäure, 1,11-Undecandionsäure, 1,12-Dodecandionsäure, Traumtinsäure, Pentadocand ionsäure, Hexadecandionsäure, Sebacinsäure, Suberinsäüre, Glutarsäure, Malonsäure, Pimellinsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, Malleinsäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Oxalsäure, Fumarinsäure, Polyasparginsäure und dergleichen. Dicarbonsäuren sind für die erfindungsgemässe Verwendung bevorzugt und umfassen Maleinsäu-

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. .,." .;;-;: 3323UYÖ

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-420-

re, Bernsteinsäure, Glutarsäure und Adipinsäure. Als höhere Polycarbonsäure sind solche Substanzen geeignet, die zwei oder mehr Carbonsäuregruppen enthalten; diese umfassen hochmolekulare polymere Materialien, wie Polyasparginsäure mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis 50.000. Die Kondensationsreaktionen sind im allgemeinen exotherm; daher kühlt man die Reaktionsgemische vorteilhafterweise auf eine Temperatur ab, die sich nicht nachteilig auf das zu immobilisierende biologische Material auswirkt, z.B. auf ca. 37°C oder darunter.

Das molare Verhältnis von Polycarbonsäure zu Polyalkylenimin (PCArPAI) kann aufgrund der Schwankungen im Molekulargewicht der Reaktanten in einem breiten Bereich variieren. Im allgemeinen liegt das Verhältnis im Bereich von 1:20 bis 1:0,0005. WEnn Polycarbonsäure zur Erhöhung der Porosität des erfindungsgemässen Verbundes zugegeben wird, so wird häufig ein nennenswerter molarer Überschuss von Polycarbonsäure angewendet.

Die Polycarbonsäure kann in einer kondensierenden Menge zu dem Polyalkylenimin unter Präpolymerisations-Bedingungen zugegeben werden, um ein wasserlösliches Präpolymer zu bilden. Das Präpolymer stellt im allgemeinen eine viskose Flüssigkeit dar, zu welcher der Vermiculit, der das immobilisierte biologische Material enthält, auf einfache Weise zugegeben und während der Kondensationsreaktion in Suspension gehalten werden kann. Es wird dann das Kondensierungsmittel zugegeben, um eine Kondensation und Verfestigung des Präpolymer-Vermiculit-Verbundes zu erzielen.

Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird auf einem Niveau gehalten, bei welchem keine nennenswerte Inaktivierung auftritt oder das biologische Material in anderer Weise nachteilig beeinflusst wird. Der pH-Wert kann von ca. 2 bis ca. 12 schwanken und liegt vorzugsweise zwischen ca. 5 und ca. 10.

Wie vorstehend angegeben, wird zur Durchführung einer Kondensation von Polyalkyleniminketten mittels PoIycarbonsäuren vorteilhafterweise ein Kondensationsmittel . verwendet . Im allgemeinen kann jedes Kondensationsmittel, welches die Reaktion von Aminen und Carbonsäuren katalysiert oder erleichtert, verwendet werde. Beispiele für solche Kondensationsmittel umfassen: N-Ethyl-S-phenyl-isoazolium-S-sulfonat, n-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihydrochinolin und verschiedene Carbodiimide. Carbodiimid-Kondenstionsmittel, die in der Zusammensetzung gemäss der Erfindung verwendet werden können, besitzen die Formel R*-N=C=N-R", worin R¹ und R" Hydrocarbylgruppen mit bis ca. 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 12 Kohlenstoffatomen, darstellen. Derartige Kondensationsmittel umfassen l-Ethyl-3,3-dimethylaminopropyl-carbodiimid, Dicyclohexyl-carbodiimid, 1-Cy-5 clohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodi imid-meth"op-toluol-sulfonat oder deren Salze. Carbodiimid-Kondensationsmittel werden zu dem Reaktionsgemisch in einer kondensierenden Menge zugegeben, die im allgemeinen praktisch eine stöchiometrische Menge darstellt; z.B. von ca. 0,2 bis dreimal, vorzugsweise von ca. 0,5 bis 1,5-mal die stöchiometrische Menge. Jedes Carbodiimidmolekül reagiert mit einer einzelnen

Säuregruppe einer Polycarbonsäure. Z.B. werden molare Verhältnisse von Carbodiimid zu Dicarbonsäure von ca. 2:1 nach der erfindungsgemässen Methode im allgemeinen angewendet. Nach Zugabe des Kondensationsini ttels bei Raumtemperatur tritt eine merkliche Polymerisation innerhalb von 30 Sekunden ein, die im allgemeinen innerhalb von ca. 2 h abgeschlossen ist

Wenn das Polyethylenimin durch Zugabe eines Kondensationsmittels insolubilisiert worden ist, so ist gegebenenfalls ein Nachbehandlungsschritt durch Quervernetzung des kondensierten, beschichteten Vermiculite mit einem Amin-Vernetzungsraittel vorgesehen, wie z.B. mit Glutardialdehyd, wie vorstehend beschrieben, um dem Endverbund eine zusätzliche Starke und Stabilität zu verleihen.

Je nach der Art des gewählten Polymers kann eine Vielzahl von Kondensationsmitteln und Vernetzungsagentien aus den im Stand der Technik bekannten Mitteln ausgewählt werden, um den Verbund zu stärken bzw. verfestigen. Mit Hilfe der beschriebenen Methoden gemäss der Erfindung ist es möglich, eine grosse Anzahl biologischer Materialien zu immobilisieren und neue biokatalytische Verbünde herzustellen. In den nachfolgenden Beispielen werden die Immobilisierungsverfahren näher erläutert. Diese Beispiele beschreiben die Art und Weise und das Herstellungsverfahren und die Verwendung der Erfindung sowie verschiedene erfindungsgemässe Ausführungsformen, ohne dass diese beschränkend wirken sollen.

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-Λ3-

Beispiel I

80 g Aspartase-haltige E.coli-Zellpaste, welche ca. 75 Gew.-I Wasser enthält, wurde aus frischen Aspartase-haltigen E.coli hergestellt. Zur Herstellung der Paste wurde das Fermentationsmedium gebildet, indem man in einem Liter Wasser 24 g Hefeextrakt, 30 g Fumarsäure, 2 g Natriumcarbonat, 2 mM Magnesiumsulfat und 0,1 mM Calciumchlorid auflöst, und den pH auf ca.

7,2 mit Ammoniumhydroxid einstellt. Dieses Medium wurde mit 1 ml einer Kultur von E.coli (ATCC-Nr. 31976), welche 12 bis 16 h lang bei 37°C in einem Peptonmedium, welches 0,5 % Mononatriumglutamat enthielt, inkubiert worden war, inokuliert. Das inokulierte Medium wurde 12 bis 14 h lang bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 5.000 UpM geerntet.

80 g Aspartase-haltige E.coli wurden zu 20 g Vermiculit-Teilchen zugegeben. Nachdem die Zellpaste in dem Vermiculit absorbiert war, wurden 10 g Polyethylenimin zu dem Gemisch zugegeben und solange gerührt, bis es gleichmässig verteilt war. Glutarsäuredialdehyd (20 g einer 25%igen Lösung in Wasser) wurde dann zugegeben und bis zur Bildung von harten Teilchen

vermischt. Eine zweite Charge an Material wurde nach dem gleichen Verfahren hergestellt. Beide Materialchargen wurden zum Trocknen über Nacht stehen gelassen.
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Das Material wurd in eine Säule mit einem endgültigen Bettvolumen von 353 ecm gepackt. Die Säule wurde dann dazu verwendet, um Ammoniumfumarat in L-Asparaginsäure umzuwandeln. Eine 1,5 M Ammoniumfumarat-Lösung mit ImM Magnesiumsulfat, pH 8,5, bei 37°C wurde durch die Säule mit 360 ccm/h (1,0 SV ) geleitet. Das Eluat wurde auf Aspartase-Aktivitat geprüft, indem das Verschwinden von Fumarsäure auf einem Spektrofotometer bei 240 nm gemessen wurde. Die Säule befand sich Tage in kontinuierlichem Betrieb. Während dieser Zeit wurden Proben des Eluats untersucht, um die prozentuale Umwandlung des Substrates zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1

Tag % Umwandlung von 1,5M Ammoniumfumarat (1 Passage bei 1 SV/h)

1 98,2

6 99,2

16 99,4

26 99,2

37 99,0

55 98,7

90 98,2

120 91,0

151 91,3

Beispiel II

Das allgemeine Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei 120 g Zellpaste und 15 g Polyethylenimin verwendet wurden. Eine Charge von immobilisiertem Material wurde in einen Säulenreaktor (173 ecm Bettvolumen) gepackt. Die Säule war in der Lage, 99 % einer 1,8M Ammoniumfumarat-Lösung bei 360 ccm/h (2,08 SV ) umzuwandeln. Die Produktivität dieser Säule wurde berechnet: 493 g gebildete L-Asparaginsäure/1 Bettvolumen von immobilisierten Zellen/h bei 37 "C (3,7 Mol/l/h).

Beispiel III
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10 Chargen immobilisierter E.coli-Zellen (100 g Vermiculit/Charge) wurden nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel II hergestellt.

Der Biokatalysator wurde dann in eine Säule mit 12,5 1 Bettvolumen gepackt. Ammoniumfumarat (1,8 M) bei 37⁰C wurde bei verschiedenen Fliessgeschwindigkeiten durch die Säule gegeben; das Eluat wurde im Hinblick auf die Umwandlung von Ammoniumfumarat wie in Beispiel I untersucht. Tabelle 2 zeigt die erhaltenen Ergebnisse.

Tabelle 2

Fliess- % Umwandgeschwin- lung (Fumardigkeit säure) (l/h)

kg/h

(L-Asparagin

säure)

Mol/l/h

(L-Aspara

gin-säure

12,50 18,75 25,00 62,50

99,1 97,5 95.0 56,00

2,97
4,38
5,69
8,38

1,79 2,63 3,42 5,04

Beispiel IV

Das allgemeine Beispiel III wurde mit einer frischen Charge E.coli-Zellen wiederholt mit der Ausnahme, dass die frischen Zellen 29 % mehr Aktivität als die vorhergehende Charge aufwiesen. Wenn das Substrat mit 62,5 l/h über die Säule gegeben wurde (wie in Beispiel III) betrug die Menge der gebildeten Asparaginsäure 10,56 kg/h (6,35 Mol/l/h). Dies ist gegenüber Beispiel III eine 27%ige Erhöhung der Produktivität.

25 Beispiel V

Das Enzym Tryptophansynthetase kann bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden, um die Umwandlung von Indol und Serin in Tryptophan zu katalysieren. Vermiculit-Teilchen (2g) und 4 ml rohe Tryptophansynthetase-Extraktlösung aus E.coli-Zellen wurden miteinander vermischt. Der Extrakt wurde stehen gelassen, um in Vermiculit zu absorbieren. Polyethylenimin (1 g) wurde dann zu dem Gemisch zugegeben, um

die Vermiculitteilchen zu beschichten. Glutarsäuredialdehyd (2 ml einer 25%igen Lösung in Wasser) wurde dann zugefügt und solange vermischt, bis harte beschichtete Teilchen erhalten wurden. Die gesamte Menge des Materials wurde dann in eine Säule gegeben und mit einer Substratlösung gewaschen, die aus 0,05 M Serin, 0,05 M Indol, 0,005 M Glutathion, 0,005 M Kaliumphosphat (dibasisch) und 200 mg Pyridoxal-5-phosphat/1 enthielt, wobei der pH-Wert auf 7,8 eingestellt wurde. Die Säule wurde dann wiederholt in einem Chargen-Rezirkulationssystem verwendet, wobei in 24 h 80 mg Tryptophan hergestellt wurden.

Beispiel VI

9 g ganze Hefezellen R.rubra, welche das Enzym Phenylalanin-ammoniak-lyase enthielten, wurden mit 3 g Vermiculit-Teilchen vermischt, zur Absorption in dem Vermiculit stehen gelassen und dann die Teilchen gründlich beschichtet und auf 10^cC abgekühlt. Eine Polysaccharid-Beschichtungslösung wurde hergestellt durch Zugabe von 0,8 g Kelco-Polysaccharid (K9A50)-Pulver zu 100 ml deionisiertem Wasser bei 80⁰C und 10-minütigem Rühren. Das Pulver löste sich auf und g Kaliumchlorid wurde zu der Lösung zugegeben." Die Lösung wurde zum Abkühlen auf 50°C stehen gelassen (wobei sie als Lösung verblieb). Die wärme Lösung wurde dann über das kalte Vermiculitmaterial unter Vermischen gegossen. Das Polysaccharid bildete sehr schnell ein Gel, beschichtete die Vermiculit-Teilchen, welche R.rubra enthielten. Die Teilchen wurden in 100 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, gegeben

und gründlich unter Rühren gewaschen. Die Teilchen wurden dann aus der Pufferlösung entfernt. Die Lösung zeigte keine Anzeichen von Trübe oder Nebelbildung und war tatsächlich frei von Hefezellen, was anzeigt, dass die Immobilisierung mit Erfolg durchgeführt worden ist. Die Teilchen wurden in 50 ml 0,1 M Ammoniumcinnamat bei pH 9,3 gegeben und die Lösung auf PAL-Aktivität durch Kontrolle der Produktion von L-Phenylalanin getestet. Das immobilisierte Zellmaterial zeigte sich erfolgreich bei der Produktion von L-Phenylanalin; zunehmende Mengen an L-Phenylanalin wurden in Abhängigkeit von der Zeit in der Reaktionslösung beobachtet.

Claims

HOFFMANN · felTL,E aIpARTNETR *". 3323078 PATENT- PATENTANWÄLTE DIPL.-1NG. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN D1PL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN · DR. RER. NAT. H.-A. BRAUNS · DIPL.-ING. K. GDRG DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE 38 835 m/fg Genex Corporation, Rockville, Maryland / USA Immobilisiertes biologisches Material, Verfahren zu dessen Herstellung und Anwendungsverfahren unter Verwendung desselben Pate nt ans ρ r ü ehe

1. Verfahren zur Immobilisierung biologischen Materials unter Bildung eines insolubilisierten biologischen Materialverbundes, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: 5

(a) Zugabe von Vermiculit-Teilchen zu einem wässrigen Medium des biologischen Materials;

(b) Absorption des das biologische Material enthaltenden Mediums im genannten Vermiculit; und

(c) Beschichtung des Vermiculite mit einem Polymer.

*■ 2 -

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der beschichtete Vermiculit gemäss Schritt (c) mit einem Vernetzungsagens vernetzt oder mit einem Kondensierungsmittel kondensiert wird.

3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , dass das Polymer aus der Gruppe Polyalkylenimine, Polysaccharide, PoIyacrylamid, Polyurethan, Alginat und Carageenan ausgewählt wird.

4. Verfahren zur Immobilisierung biologischen Materials durch Bildung eines insolubilisierten biologisehen Materialverbundes, gekennzeich net durch die folgenden Schritte:

(b) Absorption des genannten wässrigen Mediums des biologischen Materials im Vermiculit;

(c) Beschichtung des Vermiculits mit einen Polyalkyleniminpolymer; und

(d) Vernetzung des beschichteten Vermiculits mit einem Aminvernetzungsmittel oder Kondensation desselben mit einem Kondensationsmittel.

5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , dass der Polymer-beschichtete Vermiculit mit einer vernetzenden Menge eines Aminvernetzungsmittels vermischt wird, um das biologische Material in dem beschichteten Vermiculit zu immobilisieren.

6. Verfahren 'gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , dass das Polyalkyleniminpolymer mit einer kondensierenden Menge einer PoIycarbonsaure vermischt wird, um ein teilweise polymerisiertes, prekondensiertes, wasserlösliches Polymer zu bilden, bevor es mit dem Vermiculit vermischt wird

7. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der beschichtete Ver- miculit durch Zugabe einer kondensierenden Menge eines Carbodiimid-Kondensationsmittels unter kondensierenden Bedingungen kondensiert wird.

8. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch g e kennzeichnet, dass der beschichtete Vermiculit unter Zugabe einer kondensierenden Menge eines Carbodiimid-Kondensationsmittels unter Kondensationsbedingungen kondensiert wird.

9. Verfahren gemäss den Ansprüchen 7 oder 8, dadurch gekenn ζ ei chnet , dass der insolubiliserte biologische Materialverbund durch Nachbehandlung mit einem Aminvernetzungsmittel modifiziert wird, um dem Verbund zusätzlich Stärke und Stabilität zu verleihen.

10. Verfahren gemäss den Ansprüchen 4, 5, 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet , dass das Polyalkyleniminpolymer aus der Gruppe Polyethylenimin, Polypropylenimin, Polybutylenimin und Polypentylenimin ausgewählt wird.

11. Verfahren gemäss Anspruch 4, 5, 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet , dass das Polyalkyleniminpolymer die Verbindung Polyethylenimin darstellt.

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12. Verfahren gemäss Anspruch 6 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Polycarbonsäure aus der Gruppe Maleinsäure, Bernsteinsäure und Adipinsäure ausgewählt wird.

13. Verfahren gemäss Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet , dass das Carbodiimid-Kondensationsmittel aus der Gruppe l-Ethyl-3,3-dimethylaminopropyl-carbodi imid-hydrochlorid, Dicyclohexyl-carbodiimid und l-Cyclohexyl-3-(2-morpholino ethyl)-carbodiimidmetho-p-toluol-sulfonat und deren Salzen ausgewählt wird.

14. Verfahren gemäss den Ansprüchen 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet , dass das

Aminvernetzungsmittel aus der Gruppe Glutardialdehyd, Diisocyanate, Polyisocyanate, 2,4,6-Trichlor-5-triazin, Bisoxiran, Bisimidat, Divinyl-sulfon und 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol ausgewählt wird. 20

15. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet , dass das biologische Material zu dem Vermiculit in einer Menge von ca. 0,001 bis ca. 2 g auf Trockengewichtsbasis pro g Vermiculit zugegeben wird.

16. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das molare Verhältnis von Polyalkylenimin zu Polycarbonsäure ca. 1 : 20 bis 1 : 0,0005 beträgt.

17. Verfahren gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , dass das Carbodiimid in einer Menge von 0,2 bis dreifachen stöchiometrischen Menge in bezug auf die Polycarbonsäure verwendet wird.

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18. Verfahren gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Carbodiimid in einer Menge von etwa 0.5 bis 1,5-fachen stöchiometrischen Menge in Bezug auf die Polycarbonsäure verwendet wird.

19. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das immobilisierte biologische Material ausgewählt wird aus der Gruppe Enzyme, mikrobielle Zellen, Antigene, Antikörper, Antibiotika, Coenzyme, Bakterien, Hefe, Pilze, Pflanzenzellen, tierische Zellen und Gewebekulturen.

20. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 4, dadurch

gekennzeichnet, dass das biologische Material eine mikrobiell gebildete Aspartase ist.

21. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet , dass das Enzym Tryptophansynthetase darstellt.

22. Insolubilisierter biologischer flaterialverbund, gekennzeichnet durch ein biologisch aktives Material, welches in Vermiculit-Teilchen adsorbiert ist, die in einem Polymeren inünobilisiert sind.

23. Insolubilisierter biologischer Materialverbund, gekennzeichnet durch ein biologisch aktives Material, welches in Vermiculit-Teilchen adsorbiert ist, die in einem Polymeren immobilisiert sind, wobei das genannte Polymer mit einem Vernetzungsmittel vernetzt ist.

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24. Insolubilisierter biologischer Materialverbund gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Polyalkylenimin und das Vernetzungsmittel ein Aminvernetzungsmittel darstellt.

25. Verbund gemäss Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet , dass das Aminvernetzungsmittel aus der Gruppe Glutardialdehyd, Diisocyanate, Polyisocyanate, 2,4-6-Trichlor-S-triazin, Bisoxiran, Bisiomidat, Divinyl-sulfon und 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol ausgewählt wird.

26. Verbund gemäss Anspruch 24, dadurch g e -

kennzeichnet, dass das Aminvernetzungsmittel Glutardialdehyd darstellt.

27. Insolubilisierter biologischer Materialverbund, gekennzeichnet durch ein biologisch aktives Material, welches in Vermiculit-Teilchen adsorbiert ist, die in einem Polymeren immobilisiert sind, wobei das genannte Polymere mit einem Kondensationsmittel kondensiert ist.

28. Insolubilisierter biologischer Materialverbund gemäss Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Polyalkylenimin und das Kondensationsmittel ein Carbodiimid-Kondensationsmittel darstellt.

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29. Verbund gemäss Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , dass das Kondensationsmittel aus der Gruppe l-Ethyl-3,3-dimethyl-aminopropyl-carbodiimid-hydrochlorid, Dicyclohexyl-carbodiimid und l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinethyl)-carbodiimid-metho-p-toluol-sulfonat oder deren Salze ausgewählt wird.

30. Verbund gemäss Anspruch 24 oder 26, dadurch

gekennzeichnet, dass das Polyalkyleniminpolymer aus der Gruppe Polyethylenimin, Polypropylenimin, Polybutylenimin und Polypentylenimin ausgewählt wird.

31. Verbund gemäss Ansprüchen 22, 23, 24, 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet , dass das biologisch aktive Material aus der Gruppe der Enzyme, Mikrobenzellen, Antigene, Antikörper, Antibiotika, Coenzyme, Pflanzenzellen, tierische Zellen, Bakterien, Hefe, Pilze und Gewebekulturen ausgewählt wird.

32.. Verbund gemäss Anspruch 22, 23, 24, 27 oder 28, dadurch gekennze ichnet , dass das biologisch aktive Material Aspartase darstellt.

33. Verbund gemäss Anspruch 22, 23, 24, 27 oder 28, dadurch gekennze i chnet , dass das biologisch aktive Material Tryptophansynthetase darstellt.

34. Verfahren zur Herstellung von Asparginsäure, dadurch gekennzeichnet, dass unter Asparaginsäure-produzierenden Bedingungen ein Substrat, welches Ammoniumfumarat enthielt, mit einem insolubilisierten biologischen Materialverbund von Aspartase oder Aspartase-enthaltenden Mikrobenzellen, die in Vermiculit-Teilchen absorbiert und in einem Polymer immobilisiert sind, in Kontakt gebracht wird, wobei der immobilisierte Vermiculit mit einem Vernetzungsmittel vernetzt oder einem Kondensationsmittel kondensiert ist.

35. Verfahren zur Herstellung von Tryptophan, dadurch gekennzeichnet , dass unter Tryptophan-produzierenden Bedingungen ein Substrat, welches Indol und Serin enthielt, mit einem insolubilisierten biologischen Materialverbund von Tryptophansynthetase oder Tryptophansynthetase-enthaltenden Mikrobenzellen, welche in Vermiculit-Teilchen absorbiert und in einem Polymer immobilisiert sind, in Kontakt gebracht wird, wobei der immobilisierte Vermiculit mit einem Vernetzungsmittel vernetzt oder mit einem Kondensationsmittel kondensiert ist.

36. Verfahren zur Herstellung von L-Phenylal"anin, dadurch gekennzeichnet , dass unter L-Phenylalanin-produzierenden Bedingungen ein Substrat, welches Ainmoniumcinnamat enthält, mit einem insolubilisierten biologischen Materialverbund von Phenylalanin-ammoniak-lyase oder Phenylalanin-ammoniak-lyase-enthaltenden Mikrobenzellen, welche in Vermiculit-Teilchen absorbiert und in einem Polymeren immobilisiert sind, in Kontakt gebracht wird.