CH640882A5 - Verfahren zur immobilisierung eines intrazellulaeren enzyms. - Google Patents
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Description
Diese Erfindung betrifft die Immobilisierung einer speziellen Kategorie von intrazellulären Enzymen, die gegenüber Glutaraldehyd sensitiv sind. Enzyme dieser Kategorie sind oft Thiol-Enzyme. Das bedeutet, dass diese Enzyme an den aktiven Stellen, oder zumindest in der Nähe der aktiven Stelle der Enzymmolekel, SH-Gruppen aufweisen. Solche Enzyme werden daher durch Reaktion mittels Thiol-reaktiven Gruppen oder Verbindungen wie zum Beispiel Glutaraldehyd inaktiviert. Ein typisches Beispiel eines solchen Enzyms ist Urease.
Verschiedene Methoden für die Herstellung von immobilisierten Enzyme sind in Methods of Enzymology, Vol. 44 (1977) (Academic Press), beschrieben. Die meisten dieser Methoden umfassen spezielle Substrate mit den damit verbundenen Nachteilen der hohen Preise solcher Substrate. Zusätzlich müssen bei solchen Verfahren die enzymatischen Aktivitäten immer stark verdünnt werden.
Es ist auch beschrieben worden, dass Glukoseisomerase mittels Vernetzung von Glukoseisomerase enthaltenden Zellen mit Glutaraldehyd und weiteren Behandlungen immobilisiert werden kann. Siehe dazu beispielsweise die U.S.-Patent-schrift Nr. 3980521. Glukoseisomerase aber ist ein Enzym, das nicht sehr sensitiv gegenüber Glutaraldehyd ist und die Ausbeute gemäss der oben angegebenen Methode an immobilisiertem Enzym ist daher hoch. Glutaraldehyd ist aus verschiedenen Gründen der bevorzugte Reaktionsteilnehmer bei Vernetzungsumsetzungen. Es ist von den Gesundheitsämtern anerkannt und auch herstellungsmässig und von wirtschaftlicher Seite her gesehen heute das beste und bekannteste Vernetzungsmittel.
Die vorliegende Erfindung hingegen betrifft die Immobilisierung von intrazellulären Enzymen, die sensitiv gegenüber Glutaraldehyd sind. Bis anhin war es sehr schwierig, derartige Enzyme zu immobilisieren, ohne eine nachteilige hohe Verdünnung derselben hinzunehmen. Die oben angegebenen Glutaraldehydmethode konnte dazu nicht verwendet werden, da dabei eine beinahe vollständige Vernichtung der Enzymaktivitäten eintritt. Die Immobilisierung von glutaraldehydsensitiven Enzymen muss daher von Voraussetzungen ausgehen, die völlig verschieden sind von denjenigen für die Immobilisierung von Enzymen, die nicht sensitiv gegenüber Glutaraldehyd sind. In diesem Text bedeutet der Ausdruck «gluta-raldehydsensitive Enzyme» solche Enzyme, welche mindestens 75% ihrer ursprünglichen Aktivität verlieren, wenn sie mit Glutaraldehyd direkt - d.h. gemäss den Methoden der U.S.-Patentschrift Nr. 3980521 und der DE-Offenlegungs-schrift Nr. 2223340 - behandelt werden, um ein teilchenför-miges Produkt einer annehmbaren, physikalischen Festigkeit für industrielle Anwendungen zu erhalten. Beispielsweise soll das Produkt in einer kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Herstellungsart verarbeitet werden können.
Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren für die Immobilisierung von intrazellulären, glutaraldehydsensitiven Enzymen zù schaffen, in dem Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel eingesetzt wird und mittels dem immobilisierten Enzyme mit sehr hoher Ausbeute hergestellt werden können. Die Herstellung soll zudem wirtschaftlich günstig sein und
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eine relativ kleine Verdünnung der enzymatischen Aktivität erfordern. Das so erhaltene Produkt wird also das immobilisierte Enzym in einer Form erhalten, die gut geeignet ist für weitere, industrielle Verwendungen desselben.
Gemäss einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Immobilisierung eines intrazellulären, glutaraldehydsensitiven Enzymes geschaffen, bei dem mikro-bielle Zellen, die das intrazelluläre, glutaraldehydsensitive Enzym enthalten, in einem wässrigen Medium mit Glutaraldehyd in Anwesenheit eines Polyamins mit einem signifikanten Gehalt an primären Aminogruppen umgesetzt werden, und das so immobilisierte, mikrobielle Enzym isoliert wird.
In diesem Text steht «mikrobielle Zellen» für ganze mikrobielle Zellen, ein Homogenat aus solchen ganzen, mikrobiellen Zellen wie auch den Erscheinungsformen dieses Materials zwischen den beiden genannten Zuständen, d.h. teilweise zerstörten, mikrobiellen Zellen.
Der Ausdruck «signifikanter Gehalt an primären Aminogruppen» wird verwendet, um einen signifikanten Anteil an primären Aminogruppen in Relation zum Gesamtgehalt an primären, sekundären und tertiären Aminogruppen auszudrücken. Vorteilhafterweise liegt der Gehalt an primären Aminogruppen mindestens 5, vorteilhafterweise 20% höher als der Gesamtgehalt an primären, sekundären und tertiären Aminogruppen. In einem typischen Fall liegen die Proportionen zwischen primären, sekundären und tertiären Aminogruppen bei 1:2:1, wenn ein verzweigtes Polyäthylenimin als Polyamin eingesetzt wird. Es wird angenommen, dass die primären Aminogruppen mit dem Glutaraldehyd reagieren, wobei stabile Vernetzungsverbindungen gebildet werden. Daher ist die Anwesenheit von primären Aminogruppen so wichtig. Versuche, die mit Polyäthyleniminen, in denen die primären (und sekundären) Aminogruppen mit Epoxyverbin-dungen reagiert wurden, haben gezeigt, dass derart modifizierte Polyäthylenimine im beschriebenen Verfahren inoperativ sind.
Da, gemäss Erfindungsdefinition, die Umsetzung in einem wässrigen Medium erfolgt, ist jetzt klar, das eingesetzte Polyamin wasserlöslich sein muss.
Überraschenderweise hat die Anwesenheit von Polyamin dazu geführt, dass ein sehr hoher Anteil der Enzymaktivitäten immobilisiert werden kann. Ohne das Polyamin beträgt die Ausbeute an Enzymaktivität lediglich ungefähr 0 bis 15%. Bei Einsetzen von Polyamin kann dieselbe Ausbeute zwischen 30 bis 70% betragen. Kein spezielles, teilchenförmiges Substrat ist nötig und die Verdünnung der enzymatischen Aktivität ist dadurch klein.
Beim Ausführen der Immobilisierungsreaktion wird das Polyamin zu der Lösung mit den mikrobiellen Zellen gegeben, und zwar entweder vor oder gleichzeitig mit dem Glutaraldehyd. Wenn das Glutaraldehyd zuerst zu den mikrobiellen Zellen gegeben wird, sinkt die Ausbeute an immobilisierter enzymatischer Aktivität. Diese Verringerung der Ausbeute kann dadurch verkleinert werden, dass das Polyamin sofort nach dem Glutaraldehyd zugegeben wird. Die Ausbeute ist auch abhängig vom pH, von der Temperatur, von den Konzentrationen und von ähnlichen Reaktionsparametern.
Es ist klar, dass die relativen Mengen von mikrobiellen Zellen, Glutaraldehyd und Polyamin in einem solchen Verhältnis eingesetzt werden sollen, dass das Produkt mit dem immobilisierten Enzym für anschliessende industrielle Zwecke geeignet ist. Das Produkt sollte unter anderem eine hohe enzymatische Aktivität aufweisen, eine hohe Ausbeute an Aktivität (im Vergleich mit der totalen Enzymaktivität vor der Immobilisierung), eine hohe Enzymstabilität und gute mechanische Festigkeit.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Umsetzung von ganzen mikrobiellen Zellen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Immobilisierung von glutaraldehydsensiti-ver Penicillin-V-acylase aus dem bakteriellen Stamm NRRL 11240 oder aus im wesentlichen ähnlichen Stämmen inkl. Mutanten und Varianten davon. Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen die Immobilisierung von Urease aus einem Stamm der Spezies Bacillus pasteurii, von Lactase aus einem Stamm der Spezies Kluyveromyces fragilis oder aus dem Stamm NRRL B-l 1229 und auch von malolaktischem Enzym aus einem Stamm der Spezies Leuco-nostoc oenos.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst den Einsatz des wässrigen Teils der Fermentationsbrühe als wässriges Medium. Diese Ausführungsform stellt die direkte Vernetzung der Fermentationsbrühe mit Glutaraldehyd dar; ist also eine extrem einfache und sehr wirtschaftliche Immobilisierungsmethode. Die Zellen können aber auch von der Fermentationsbrühe abgetrennt werden, beispielsweise mittels Zentrifugieren. Dann können sie auch in Wasser wieder suspendiert werden. Statt dem Wasser kann auch eine Pufferlösung mit einem pH zwischen 5 und 10 eingesetzt werden. Der wässrige Teil dieser Suspension stellt nun das wässrige Medium für die folgende Umsetzung mit Glutaraldehyd dar. Ebenso kann der wässrige Teil des Zellschlammes von den Zellbestandteilen aus der Fermentationsbrühe abgetrennt werden, beispielsweise mittels Zentrifugierung. Dieser wässrige Anteil kann nachher als wässriges Medium für die obengenannte Umsetzung mit Glutaraldehyd eingesetzt werden. Die abgetrennten Zellbestandteile weisen dabei die Konsistenz etwa einer Zahnpasta auf.
Als einzusetzendes Polyamin werden Polyalkylenimine bevorzugt. Speziell bevorzugt werden verzweigte Polyalkylenimine, in denen der Alkylenrest 2 bis 4 C-Atome hat.
Bevorzugterweise werden auch verzweigte Polyäthylenimine oder ein Polyalkylen-Polyamin als Polyamine eingesetzt.
Speziell bevorzugt werden verzweigte Polyäthylenimine mit Molekulargewichten zwischen 500 und 100000 Daltons als einzusetzende Polyamine.
Das bevorzugte Verhältnis zwischen primären Aminäqui-valenten/Aldehydäquivalenten liegt im Bereich von 0,01:1 bis 10:1, vorteilhafterweise zwischen 0,1:1 bis 1:1.
Bevorzugterweise wird bei der Ausführung der erfin-dungsgemässen Methode zuerst das Polyamin zum wässrigen Medium mit den mikrobiellen Zellen gegeben und dann erst das Glutaraldehyd zugefügt.
Bevorzugterweise wird im erfindungsgemässen Verfahren ein Verhältnis zwischen Glutaraldehyd und mikrobiellen Zellen (Gewicht/Gewicht) zwischen 0,01:1 bis 100:1, speziell bevorzugterweise von 0,1:1 bis 10:1 verwendet.
Die bevorzugte Weiterverarbeitung der immobilisierten Enzyme geschieht mittels Verformung des isolierten Produktes. Die Verformung geschieht vorteilhafterweise mittels Granulieren oder Extrudieren. In einer anderen Ausführungsform werden die immobilisierten und isolierten Enzyme getrocknet, gemahlen und gesiebt, wobei ein Formgrössenbe-reich von 100 bis 1000 um, vorteilhafterweise von 200 bis 700 [im, angestrebt wird.
Gemäss dem zweiten Aspekt der vorliegend beschriebenen Erfindung wird ein immobilisiertes enzymatisches Produkt beansprucht, welches nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wird.
Der dritte Aspekt dieser Erfindung umfasst die Verwendung des Produktes mit dem immobilisierten Enzym. Dieses kann dabei in kontinuierlichen wie auch in diskontinuierlichen Verfahren eingesetzt werden. Im ersten Fall geschieht dies vorteilhafterweise in einer Austauschkolonne.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Verwendung der
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35
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erfindungsgemäss immobilisierten Enzyme umfasst der Einsatz von immobilisierter Penicillin-V-acylase aus dem Stamm NRRL 11240 oder aus im wesentlich ähnlichen Stämmen inkl. Mutanten und Varianten davon, wobei das immobilisierte Penicillin-V-acylase kontinuierlich eingesetzt wird.
Zur Demonstration der erstaunlichen Ausbeute an enzy-matischer Aktivität von Produkten, die gemäss der erfin-dungsgemässen Methode erhalten werden, werden im folgenden einige vergleichende Experimente beschrieben.
a) 2 g sprühgetrocknete, Urease enthaltende Zellen vom Bacillus pasteurii ATCC 11859 (6200 IU/g bei pH 7) wurden in 98 ml Wasser suspendiert. Dazu wurden 10 (im ß-Mercap-toäthanol gegeben. Der pH der Zellsuspension betrug 7,7, als 1,6 ml 25%iges Glutaraldehyd unter Rühren zugegeben wurden. 20 Minuten nach Rühren bei Raumtemperatur war der pH-Wert auf 6,9 gesunken. Die immobilisierten Zellen wurden abfiltriert und zweimal mit 0,5 1 1 mM ß-Mercaptoätha-nollösung in Wasser gewaschen. Nach Trocknung des Rückstandes im Vakuum (90 Minuten bei ungefähr 50 °C) wurden 0,7 g immobilisiertes Produkt erhalten mit einer Aktivität von 64 IU/g. Die Messung der Aktivität geschah unter optimalen Verbindungen für Teilchen in der Grösse von 125 bis 300 p.m. Dies entspricht einer Ausbeute an Aktivität von 0,3%.
b) Eine dem Experiment a) identische Zellsuspension wurde vorerst mit 4 ml 10%igem Polyäthylenimin (Molekulargewicht etwa 60000, Dow Chemical's PEI 600) versetzt. Der pH der Lösung wurde auf pH 7 eingestellt und dann erst 2,75 ml 25%iger Glutaraldehydlösung zugegeben. Nach 60minüti-gem Rühren bei Raumtemperatur wurde abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Die dem Experiment a) analogen Messungen ergaben 0,75 g immobilisiertes Produkt mit einer Aktivität von 5600 IU/g von Teilchen mit Korngrössen zwischen 125 und 300 p.m. Die Ausbeute an Enzymaktivität beträgt also in diesem Fall 34%.
Die Definitionen der Einheiten von enzymatischen Anfangsaktivitäten der Enzyme, die in den folgenden Beispielen hergestellt werden, sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.
Tabelle I 40
Enzym
Bestimmung der enzymatischen Anfangsaktivitäten
Enzym
Bestimmung der enzymatischen Anfangsaktivitäten
Urease
Penicillin-V-acylase
25
pH-statische Titration mit 1 N HCl bei pH 7 und 30 °C. 3% (0,5 mol) Harnstoff in 0,2 M Phosphatpuffer wurden als Substrat verwendet. 1 Einheit beträgt 1 umol hydrolisierter Harnstoff/Minute. Die Inkubation geschah bei 40 °C mit 3% Penicillin-V in 0,2 M Phosphatpuffer bei pH 7,5. Nach dem Entfernen der Zellen wurde das erhaltene 6-APA mittels p-Aminobenzaldehyd bestimmt, gemäss Balasingham et al. (1972), Biochem. Biophys. Acta 276,250-256. Eine Einheit entspricht .
1 (im produziertem 6-APA pro Minute.
Nicht immobilisierte Zellen wurden vorerst mittels einer Behandlung bei Raumtemperatur mit etwa 8%igem 1-Butanol in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7 zerstört. Der Vorgang dauerte 20 Minuten lang. Die Inkubation (für Kluyveromyces fragilis-lactase bei 37 °C und für NRRL B-l 1229 Lactase bei 60 °C) geschah mit einer Lösung von 4,75% (Gewicht/Volumen) Lactose in einem Milchpuffer bei pH 6,5. Literatur dazu: «Das grosse Molkerei Lexikon, Schultz 1965, Vol. 2, M-Z, Seite
45
740). Nach der Entfernung der Zellbestandteile wurde die produzierte Glukose gemäss Boehringer Mannheim Blood Sugar Reagent (GOD-Perid Methode) bestimmt. 1 Einheit entspricht 1 p,mol produzierter Glukose/Minute.
Inkubation geschah bei 30 ° C mit 33 mM L-Maleat, 1,67 mM NAD+ und 0,7 mM MnCh in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 5. Nach dem Entfernen der Zellen wurde das io Malolakti-sches Enzym
15
produzierte Lactat mit LDH + NAD+ gemäss Gutmann, I. und Wahlefeld, A.W. (1974) in «Methods of Enzymatic Analysis, 2nd ed. Vol. 3 (H.U. Bergmeyer, ed.), Academic Press, Seiten 1463-1467 bestimmt. Eine Einheit entspricht 1 umol produziertem Lactat pro Minute.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung weiter. Die in den Beispielen behandelten Verfahren bzw. Verwendungen sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Enzym
Herstellung von immobilisiertem Enzym
Verwendung von Beispiele immobilisiertem
Enzym
30
Penicillin- x V-acylase Lactase x
Urease x
Malo-lakti- x sches
Enzym x x x x
1- 7 8-10 11-13 13 14-15 16 17-18 19-20
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Das Beispiel 12 umfasst ein Vergleichsexperiment ohne Polyäthylenimin.
In all den folgenden Beispielen wurde der pH der Poly-äthyleniminlösung vor der Zugabe auf ungefähr 7 eingestellt. Es muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass auch bei andern pH-Werten, beispielsweise im pH-Intervall zwischen 4 und 9, zufriedenstellende Immobilisierungsgrade mit dem gleichen Polyäthylenimin erhalten werden.
Beispiel 1
Zu 11 Fermentationsbrühe des Stammes NRRL 11240, der ungefähr 1% trockene Zellen und 1,5 Einheiten Penicillin-V-acylase/ml enthielt, wurden unter Rühren 30 ml 10%iges Polyäthylenimin (verzweigtkettig, Molekulargewicht etwa 60000, PEI 600 der Dow Chemical) und anschliessend - nach 5 Minuten - 25 ml 25%iges Glutaraldehyd gegeben. Das Rühren wurde 60 Minuten lang bei Raumtemperatur fortgesetzt und die immobilisierten Zellen anschliessend abfiltriert.
Nach Waschen derselben mit einer Phosphatpufferlösung (50 mM, pH 7) und nach Trocknen an der Luft wurden 14,2 g getrocknete, immobilisierte Zellen erhalten, die eine Aktivität von 71 Einheiten/g für Partikelgrössen zwischen 180 und 420 lim aufwiesen. Dies bedeutet eine Aktivitätsausbeute von 65%.
Beispiel 2
Zu 1,5 1 einer Fermentationsbrühe mit dem Stamm NRRL 11240 (0,68 Penicillin-V-acylase-Einheiten/ml) wurden unter
5
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Rühren vorerst 45 ml 10%iges Polyäthylenimin (verzweigtket-tig, Molekulargewicht 600, PEI 6 von Dow Chemical) und anschliessend bei 4°C 30 ml 25%iges Glutaraldehyd gegeben. Das Rühren wurde unter reduzierter Geschwindigkeit 60 Minuten lang fortgesetzt und die gebildeten vielzelligen Parti- 5 kel abfiltriert. Nach Waschen mit der Phosphatpufferlösung bei pH 7 und nach Lufttrocknen des Rückstandes wurden 21g Produkt erhalten. Dieses wies eine Penicillin-V-acylase-Aktivität von 14,5 Einheiten/g auf für Partikel der Grösse 200 bis 700 um. Die Aktivitätsausbeute betrug also 30%. io
Beispiel 3
3801 einer Fermentationsbrühe vom Stamm NRRL 11240 (2,5 Penicillin-V-acylase-Einheiten/ml) wurden auf ungefähr 15 °C abgekühlt und mit 40110%igem Polyäthylenimin (Poly- ts imin P, BASF) unter Rühren versetzt. Anschliessend wurden 9,4125%iges Glutaraldehyd (Union Carbide) zugegeben. Mit verringerter Rührgeschwindigkeit wurde die Mischung 45 Minuten lang weiter bewegt. Anschliessend wurde beta-Mercaptoäthanol zugegeben bis zu einer Endkonzentration 20 von 25 mM. Die immobilisierten Zellen wurden nun auf einer Filterpresse abgetrennt. Der feuchte Filterkuchen wurde granuliert und das Granulat in einer Fliessbettanlage bei 50 bis 55 °C getrocknet. Erhalten wurden 7,1 kg trockenes Präparat mit 55 Aktivitätseinheiten/g (nicht aufgetrennte Teilchen). 25 Die Ausbeute an Aktivität betrug somit 41%.
Beispiel 4
Eine Serie von immobilisierten Präparaten aus derselben Fermentationsbrühe des Stammes NRRL 11240 wie im Bei- 30 spiel 3 wurde untersucht zum Nachweis des Einflusses der Variation der Konzentration von Polyäthylenimin bei einer konstanten Menge Glutaraldehyd. Die entsprechenden Resultate sind in Tabelle II zusammengestellt.
Tabelle II
Polyäthylenimin (Polymin P)
% in Gewicht/Volumen
Penicillin-V-acylase-Aktivität Einheiten/g trockenes Produkt (200 bis 400 um)
0,2
7
0,5
36
0,8
58
1,0
71
1,2
70
bilisierten Zellen wurden hierauf abfiltriert und mit 25 mM beta-Mercaptoäthanol und 50 mM Phosphatpufferlösung bei pH 7,5 auf einem Glasfilter gewaschen. Nach Lufttrocknung bei Raumtemperatur wurden 20 g Präparat mit 65 Aktivitätseinheiten/g bei Teilchengrössen von 200 bis 400 |xm erhalten. Dies entspricht einer Aktivitätsausbeute von ungefähr 33%.
Eine Serie von immobilisierten Präparaten wurde in ähnlichen Methoden wie oben beschrieben hergestellt. Variiert wurde die Menge an zugesetztem Glutaraldehyd nach einer konstanten Zugabe von Polyäthyleniminmengen. Jedesmal wurde konzentriert. Die entsprechenden Resultate sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.
Tabelle III
Glutaraldehyd Penicillin-V-acylase-Aktivität
% Gewicht/Volumen Einheiten/g
Trockene Präparate bei 200 bis 400
Jim
0,5 106
0,75 65
1,0 56
1,5 37
5,0 3
Von den jeweiligen Trockenpräparaten wurden Mengen zwischen 9 und 11g pro 1 Fermentationsbrühe erhalten.
Beispiel 6
3501 einer Fermentationsbrühe des Stammes NRRL 11240 (2,4 Penicillin-V-acylase-Einheiten/ml) wurden auf ungefähr 15 °C abgekühlt und mit 24,5 110%igem Polyäthylenimin (verzweigtkettig, Molekulargewicht ungefähr 700, PEI 15 T von Taihei Sangyo Kaisha) unter Rühren versetzt. Anschliessend wurden 3,5 1 50%iges Glutaraldehyd (Union Carbide) zugegeben. Das Rühren wurde mit reduzierter Geschwindigkeit 45 Minuten lang fortgesetzt, worauf beta-Mercaptoäthanol zugegeben wurde zu einer Endkonzentration von 25 mM. Die immobilisierten Zellen wurden auf einer Membranpresse abgetrennt. Der Filterkuchen wurde extru-diert durch eine 500 um Düse und die erhaltenen Partikel in einer Fliessbettanlage bei 50 bis 55 °C getrocknet. Die Ausbeute war 6,2 kg trockenes Präparat mit 85 Penicillin-V-acyla-se-Einheiten/g (Partikelgrösse: unter 500 (xm). Diese Ausbeute an Aktivität betrug also 63%.
In jedem Fall war die angegebene Menge an Polymin P (BASF) als 10%ige Lösung unter Rühren zu 0,51 Fermentationsbrühe des obengenannten Stammes zugegeben worden. Die Aktivität in der Lösung betrug 2,5 Penicillin-V-acylase-Einheiten/g. Anschliessend wurden je 10 ml 25% Glutaraldehyd zugegeben. Das Rühren wurde nachher bei verringerter Geschwindigkeit 60 Minuten lang fortgesetzt, wonach die Zellen abfiltriert, mit 25 mM beta-Mercaptoäthanol und 50 mM Phosphatpufferlösung bei pH 7,5 gewaschen. Nach Lufttrocknung wurden jeweils ungefähr 9 g Trockenmaterial bei jeder Präparation gewonnen.
Beispiel 5
Zu 21 der Fermentationsbrühe des Stammes NRRL 11240 (2,0 Penicillin-V-acylase-Einheiten/ml) wurden 200 ml 10%iges Polyäthylenimin (Polymin P, BASF) zugegeben und die Zellen anschliessend auf ungefähr Vio des ursprünglichen Volumens konzentriert. Zum Konzentrat wurden 6 ml 25%iges Glutaraldehyd gegeben, wobei der Zellschlamm gerührt wurde. Anschliessend wurde mit verringerter Geschwindigkeit 60 Minuten lang weiter gerührt. Die immo-
Beispiel 7
Eine Serie von immobilisierten Präparaten desselben Fermentationsstammes wie in den Beispielen 3 und 4 zeigt den Einfluss von verschiedenen Typen von Polyäthyleniminen:
Polyäthylenimin Molekular- % Penicillin- Ausbeute an
55 gewicht PEI V-acylase- trockenem x 10~3 Aktivität Präparat
Einheiten/g g
PEI 600, Dow 60 0,3 103 60 Chemicals
Polymin HS, - 0,8 50 BASF
Polymin P, BASF - 1,0 70
Sedipur CL 930, (100) 1,0 50 »5 BASF
PEI 15 T, Taihei 0,7 0,7 134
Sangyo Kaisha
Ltd.
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Polyäthylenimin Molekular- % Penicillin- Ausbeute an gewicht PEI V-acylase- trockenem x 10-3 Aktivität Präparat Einheiten/g g
PEI 210 T, Taihei 40-60 0,0 80 10
Sangyo Kaisha
Ltd.
Epomin P-1000, 60-80 0,9 65 14 Shokubai Kagaku Kogyo Co.
Epomin P-500, 30-40 0,9 120 7 Shokubai Kagaku Kogyo Co.
In jedem Fall wurde die angegebene Menge an Polyäthylenimin unter Rühren als 10%ige Lösung zu 0,5 1 Fermentationsbrühe des Stammes NRRL 11240 mit 2,5 Penicillin-V-acylase-Einheiten/ml gegeben. Anschliessend wurde, ebenfalls unter Rühren, 10 ml 25%iges Glutaraldehyd zugegeben. Das Rühren wurde dann mit reduzierter Geschwindigkeit 45 Minuten fortgesetzt, worauf die Zellen abflltriert wurden. Das Waschen geschah mit Lösungen von 25 mM beta-Mercaptoäthanol und 50 mM Phosphatpufferlösung bei pH 7,5. Das Endprodukt wurde luftgetrocknet.
Beispiel 8
10 g der gemäss Beispiel 1 immobilisierten und dort gewonnenen Zellen wurden zu 200 ml einer 3%igen (Gewicht/Volumen) rohen K-Penicillin-V-Löosung in 50 mM Phosphatpufferlösung bei pH-Wert 7,5 gegeben. Die Deacy-lation wurde 40 °C ausgeführt mit einer Rührgeschwindigkeit von 150 RPM und einem konstanten pH von 7,5. Der pH wurde mittels Titration mit 4 N NaOH konstant gehalten. 95% des Penicillins wurden in 6-APA umgewandelt, und dies innerhalb von 2Vi Stunden. Das Verfahren konnte mit frischem Penicillin-V mindestens 20mal wiederholt werden, ohne dass sich eine wesentliche Abnahme in der Konversionsgeschwindigkeit zeigte. Der Grad an Konversion wurde mittels Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie nachgewiesen. Die Trennung der Reaktionsmischer geschah auf Warters' Jim Bondapak C-18 Kolonnen, eluiert wurde mittels eines Gradienten von 20%igem Methylalkohol in Wasser zu 50%igem Methylalkohol in Wasser. Das ionale Gleichgewicht wurde mit Pic-A-Reagenz hergestellt. Nach der Hochdruck-flüssig-Chromatographie wurde noch eine UV-Bestimmung durchgeführt. Es wird hier hingewiesen auf die Waters Associates Information Booklet Paired-Ion Chromatography, D 61, Mai 1967, aus den USA (Maple Street, Milford, Mass.). Die Resultate der Konversion von 3%iger (Gewicht/ Volumen) K-Penicillin-V-Lösung zu 6-APA bei 40 °C ist in der Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IV
Ansatznummer Umsetzungsgrad (%)
1 96
2 97
3 98
4 98
5 98
6 98
7 97
8 97
9 98
10 97
11 96
Ansatznummer
Umsetzungsgrad (%)
12
97
13
97
14
97
15
96
Beispiel 9
9,7 g der immobilisierten Zellen aus dem Beispiel 2 wurden zu 100 ml einer 3%igen (Gewicht/Volumen) K-Penicillin-V-Lösung in 50 mM Phosphatpufferlösung bei pH 7,5 gegeben. Die Deacylation wurde bei 40°C ausgeführt; dabei wurde gerührt mit einer Geschwindigkeit von 150 rpm. Das pH wurde bei 7,5 konstant gehalten mittels eines pH-Stats. Über 90% des Penicillins wurden innerhalb von 3 Stunden in 6-APA konvertiert. Nach 10 aufeinanderfolgenden Ansätzen war die Umsetzungszeit auf ungefähr 3,5 Stunden umgestiegen, nach 20 Ansätzen auf 4 Stunden.
Beispiel 10
Immobilisierte Zellen entsprechend einer Menge mit dem Trockengewicht von 100 g und hergestellt gemäss dem Verfahren des Beispiels 6 wurden mit 50 mM Phosphatpufferlösung von pH 7,5, die 5 mM beta-Mercaptoäthanol enthielt, angefeuchtet und in eine Kolonne mit einem Durchmesser von 10 cm gegeben. Das Bettvolumen betrug dabei 400 ml. Über die Kolonne wurden 65 g rohes K-Penicillin-V in 1,51 derselben Pufferlösung mit demselben Mercaptoäthanolge-halt gegeben. Die Lösung wurde jeweils übereinen Vorerwär-mer mehrere Male über die bei 35 °C gehaltene Kolonne gegeben. Anschliessend wurde die Lösung in ein Reservoir bei 12° C gegeben, wo der pH kontinuierlich auf 7,5 mittels Titration mit 4 M NaOH eingestellt wurde. Mit einer Zirkulationsgeschwindigkeit entsprechend 14 Bettvolumen pro Stunde erhielt man nach 4 Stunden eine 98%ige Umsetzung von Penicillin-V zu 6-APA. Nach 10 aufeinanderfolgenden solchen Ansätzen musste die Umsetzungszeit auf 6 Stunden verlängert werden.
Beispiel 11
Zu 500 ml Fermentationsbrühe von Kluyveromyces fragi-lis NRRL Y 1109 (mit pH auf 7,5 eingestellt) wurden unter Rühren 40 ml 10%iges Polyäthylenimin (verzweigtkettig, Molekulargewicht 700, PEI 15 T, von der Taihei Sangyo Kaisha) und anschliessend 16 ml 25%iges Glutaraldehyd gegeben. Nach 60minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurden die gebildeten Partikel abfiltriert, granuliert und luftgetrocknet. Erhalten wurden 6,5 g trockenes Material, welches eine Lactase-Aktivität von ungefähr 500 Einheiten/g aufwies. Dies entspricht einer Ausbeute an ursprünglicher Aktivität von 30%.
Beispiel 12
Zu 500 ml einer Fermentationsbrühe von NRRL B-l 1229 mit 5,1 Lactase-Einheiten/ml wurden vorerst 25 ml 10%iges Polyäthylenimin (PEI 15 T von Taihei Sangyo Kaisha Co.) und anschliessend 10 ml 25%iges Glutaraldehyd, beides unter Rühren, zugegeben. Das Rühren wurde dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur fortgesetzt, worauf die immobilisierten Zellen abfiltriert wurden. Nach Lufttrocknung derselben wurden 4,0 g trockenes Präparat erhalten, das eine Aktivität von 209 Lactase-Einheiten/g aufwies. Dies entspricht einer Aktivitätsausbeute von 33%.
Um den Einfluss des Polyäthylenimins zu demonstrieren, wurde hier ein Vergleichsexperiment ohne Polyäthylenimin ausgeführt.
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Zu 500 ml einer Fermentationsbrühe von NRRL B-11229 mit 5,1 Lactase-Einheiten/ml wurden 10 ml 25%iges Glutaraldehyd unter Rühren gegeben. Das Rühren wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang fortgesetzt. Die behandelten Zellen wurden mit 0,5% Superfloc (12,5 ml 20%iges Superfloc C 521, ein kationisches Flockulierungsmittel) ausgeflockt, filtriert und luftgetrocknet. Die 3,7 g getrockneten Produkte enthielten 105 Lactase-Einheiten/g; dies entspricht einer Ausbeute von 15%.
Beispiel 13
Zu 500 ml einer Fermentationsbrühe von NRRL B-11229 mit intrazellulären Lactase, wurden 50 ml 10%iges Polyäthylenimin (T 15, Taihei Sangyo Kaisha) und anschliessend 14 ml 25%iges Glutaraldehyd gegeben. Das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt und die Präparation anschliessend abfiltriert und luftgetrocknet. Die trockenen Partikel enthielten ungefähr 30% der ursprünglichen Lactase-Aktivität. Sie konnten in verschiedenen, einander nachfolgenden Ansätzen für die Umsetzung von 4%iger Lactose bei 60 °C eingesetzt werden.
Beispiel 14
Zu 300 ml von sechsmal konzentrierter Fermentationsbrühe vom Bacillus pasteurii ATCC 11859 (6,3 g Trockenzellen, 9300 Urease-Einheiten/g) wurden vorerst unter Rühren 18 ml 10%iges Polyäthylenimin (verzweigtkettig, Molekulargewicht ungefähr 60000, PEI 600 von Dow Chemicals) und anschliessend 20 ml 25%iges Glutaraldehyd gegeben. Nach nochmaligem 60minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurden die immobilisierten Zellen abfiltriert und luftgetrocknet. Die 13,8 g trockenen, immobilisierten Zellen zeigten eine Urease-Aktivität von 1900 Einheiten/g für Partikel von 300 bis 700 jo.m. Dies entspricht einer Aktivitätsausbeute von ungefähr 45%.
Beispiel 15
Zu 100 ml einer 4%igen (Gewicht/Volumen) wässrigen Suspension von Bacillus pasteurii ATCC 11859 mit 230 Urea-se-Einheiten/ml wurden vorerst 32 ml 10%iges Polyäthylenimin (Polymin HS, BASF) und anschliessend - ebenfalls unter Rühren - 5 ml 25%iges Glutaraldehyd gegeben. Das Rühren wurde bei 4°C anschliessend 1 Stunde lang fortgesetzt, worauf die Zellen abfiltriert und luftgetrocknet wurden. Die 2,3 g trockenes Präparat enthielten Urease-Aktivitäten von 3100 Einheiten/g (Partikelgrösse 300 bis 700 um). Dies entspricht einer Aktivitätsausbeute von 31%.
Beispiel 16
0,5 g der immobilisierten Zellen, wie sie im Beispiel 14 beschrieben sind, wurden in eine Kolonne (10 cm Höhe, 1 cm 0) gepackt und ein Substrat, enthaltend 1% Harnstoff (0,01%
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MgCh, 10 mM beta-Mercaptoäthanol) mit pH 9 wurde bei 40 °C durch das Bett gegeben. 98% des Harnstoffes konnten bei einer Fliessgeschwindigkeit von 50 ml/h hydrolysiert werden und die Halbwertszeit der Enzymaktivität betrug ungefähr 1000 Stunden.
Beispiel 17
Zu 0,25 1 Fermentationsbrühe von Leuconostoc oenos DSM 20252 mit pH 6,5, eingestellt mit NaOH, und 14 malo-laktischen Aktivitätseinheiten pro Liter, wurden unter Rühren vorerst 3 ml 10%iges Polyäthylenimin (Polymin P, BASF) und anschliessend 1 ml 25%iges Glutaraldehyd gegeben. Das Rühren wurde anschliessend bei 4°C 30 Minuten lang fortgesetzt, worauf die immobilisierten Zellen abfiltriert, mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 6 und dann mit Wasser gewaschen und anschliessend gefriergetrocknet wurden. Die so getrockneten Zellen wiesen eine malo-laktische Aktivität von 3,4 Einheiten/g auf, was einer Aktivitätsausbeute von ungefähr 40% entspricht.
Beispiel 18
1,6 g der feuchten Zellen von Leuconostoc oenos DSM 20252 mit 96 Einheiten malo-laktischer Aktivität/g wurden in 16 ml Wasser suspendiert und das pH der Suspension auf 7,0 eingestellt. Dazu wurden nun 1,7 ml 10%iges Polyäthylenimin (Polymin P, BASF) unter Rühren und anschliessend 1,5 ml 25%iges Glutaraldehyd, ebenfalls unter Rühren, zugegeben. Gerührt wurde anschliessend 1 Stunde lang bei Raumtemperatur, worauf die immobilisierten Zellen abfiltriert, mit Wasser gewaschen und luftgetrocknet wurden. 0,5 g des trockenen Produktes wurden erhalten. Das Produkt wies eine malo-laktische Aktivität von 53 Einheiten/g auf, was einer Aktivitätsausbeute von 28% entspricht.
Beispiel 19
4 g der trockenen Zellen, wie sie im Beispiel 17 immobilisiert worden waren, wurden zu 50 ml 25 mM L-Maleat in 0,1 M Phosphat bei pH 5,0 zusammen mit 85 p,mol NAD+ und 35 [imol MnCh gegeben. Totale Umsetzung von Maleat zu Lactat wurde damit innerhalb 3 Stunden erhalten. Die Umsetzung konnte mindestens 5mal wiederholt werden, ohne Erhöhung der entsprechenden Reaktionszeit.
Beispiel 20
0,35 g der Präparation aus Beispiel 18 wurden zu 10 ml 33 mM L-Maleat in 0,1 M Phosphat bei pH 4,0 zusammen mit 17 ji,mol NAD+ und 7 umol MnCh gegeben. Eine totale Umsetzung von Maleat zu Lactat wurde innerhalb von 6 Stunden erhalten. Das Vorgehen konnte mit frischem Maleat, NAD+ und MnCh mindestens 5mal wiederholt werden, ohne dass eine Erhöhung der Reaktionszeit festgestellt wurde.
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25
30
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G
Claims (21)
- 640 8822PATENTANSPRÜCHE1. Verfahren zur Immobilisierung eines intrazellulären, glutaraldehydsensitiven Enzyms, gekennzeichnet durch Umsetzung von mikrobiellen Zellen, die intrazelluläres, gluta-raldehydsensitives Enzym enthalten, mit Glutaraldehyd, in wässrigem Medium und in Anwesenheit eines Polyamins, mit einem signifikanten Gehalt an primären Aminogruppen und Isolierung des derart erhaltenen, immobilisierten Enzymes.
- 2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, in dem die mikrobiellen Zellen ganze mikrobielle Zellen sind.
- 3. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 oder 2, in dem die mikrobiellen Zellen solche vom Stamm NRRL 11240,sind und Penicillin-V-acylase enthalten.
- 4. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 oder 2, in dem die mikrobiellen Zellen solche eines Stammes der Spezies Bazillus pasteurii sind und Urease enthalten.
- 5. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 oder 2, in dem die mikrobiellen Zellen solche eines Stammes der Spezies Kluyveromyces fragilis oder des Stammes NRRL B-ll 229 sind und Lactase enthalten.
- 6. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 oder 2, in dem die mikrobiellen Zellen solche eines Stammes der Spezies Leuconostoc oenos sind und malolaktisches Enzym enthalten.
- 7. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 6, in dem das wässrige Medium der wässrige Anteil der Fermentationsbrühe ist.
- 8. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 6, in dem das wässrige Medium der wässrige Teil des Zellschlammes ist, wobei der genannte Zellschlamm verschieden und abgetrennt ist von der Fermentationsbrühe.
- 9. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 8, in dem der Gehalt an primären Aminogruppen im Polyamin mehr als 5% - vorteilhafterweise mehr als 20% - des Gesamtgehaltes an primären, sekundären und tertiären Aminogruppen beträgt.
- 10. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 9, in dem das Polyamin mit einem hohen Gehalt an primären Aminogruppen ein Polyalkylenimin - vorteilhafterweise ein verzweigtes Polyalkylenimin - ist, in dem der Alkylenrest 2 bis 4 C-Atome enthält.
- 11. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 10, in dem das Polyamin ein verzweigtes Polyäthylenimin ist.
- 12. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 10, in dem das Polyamin ein Polyalkylen-Polyamin ist.
- 13. Verfahren gemäss Patentanspruch 11, in dem das verzweigte Polyäthylenimin ein Molekulargewicht zwischen 500 und 1000 Daltons hat.
- 14. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 13, in dem das Verhältnis primäre Aminäquivalente/Aldehydäquivalente im Bereich von 0,01:1 bis 10:1, vorteilhafterweise im Bereich von 0,1:1 bis 1:1 liegt.
- 15. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 14, in dem zur Umsetzung die Reaktionsteilnehmer in der folgenden Reihe eingesetzt werden: Zugabe des Polyamins zum wässri-gen Medium, das die mikrobiellen Zellen enthält und anschliessende Zugabe des Glutaraldehyds.
- 16. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 15, in dem ein Verhältnis Glutaraldehyd/mikrobiellen Zellen (Gewicht/ Gewicht) im Bereich von 0,01:1 bis 100:1, vorteilhafterweise im Bereich von 0,1:1 bis 10:1, verwendet wird.
- 17. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 16, in dem das isolierte, immobilisierte Enzym geformt wird, vorteilhafterweise mittels Granulation oder Extrudieren.
- 18. Verfahren gemäss Patentansprüchen 1 bis 16, in dem das gewaschene und isolierte, immobilisierte Enzym mittels Trocknen, Malen und Sieben, in einen Korngrössenbereich von 100 bis 1000 |i.m, vorteilhafterweise von 200 bis 700 (im gebracht wird.
- 19. Immobilisiertes Enzym, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.
- 20. Verwendung des immobilisierten Enzyms gemäss Patentanspruch 19 zur Kontaktierung mit einem Substrat.
- 21. Verwendung gemäss Patentanspruch 20, in der das gemäss Patentanspruch 3 hergestellte, immobilisierte Penicillin-V-acylase mit Penicillin-V in einem kontinuierlichen Pro-zess kontaktiert wird.
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