DE3301102C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Biokatalysatoren für Biotransformationen auf der Basis immobilisierter prokaryonter und eukaryonter Zellen von Mikroorganismen und Pflanzen mit verschiedener Enzymaktivität sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung entsprechend dem Gattungsbegriff des Patentanspruchs 1.

Die erfindungsgemäßen Biokatalysatoren eignen sich für biotechnische Umwandlungen in industriellem Maßstab und ermöglichen bei diskontinuierlicher oder kontinuierlicher Verfahrensführung die Erzeugung insbesondere pharmazeutisch, landwirtschaftlich oder für die Lebensmittelherstellung bedeutender Produkte oder Zwischenprodukte.

Die bekannten Verfahren der Immobilisierung von Zellen können allgemein in physikalische, physikalisch- chemische und chemische Verfahren unterteilt werden, je nachdem ob die Bindung der Zellen mit dem Träger z. B. mechanisch, wie bei in ein Gel eingebrachten Zellen, durch Van-der-Waals-Kräfte, durch polare Wechselwirkung oder durch kovalente Bindung erfolgt.

Üblicherweise werden verschiedene in Wasser unlösliche synthetische oder natürliche, organische oder anorganische Träger verwendet, die vor allem die hydro- dynamischen und Sedimentations- und damit auch die Separations-Eigenschaften der immobilisierten Zellen verbessern und zur Stabilisierung der gewünschten Enzymaktivität beitragen.

Verschiedene bekannte Arten der Immobilisierung von Zellen, ihre Vorteile und Nachteile sowie wirtschaftliche Angaben hierzu sind in Form von Übersichtsartikeln veröffentlicht (vgl. beispielsweise Vandamme, Chem. Ind. 24 (1976), 1072; Abbot, Advances Appl. Microbiol. (Hrsg. D. Perlman) 20, 203, Acad. Press. New York, San Francisco, London 1976; Jack und Zajic, Advances Biochem. Eng. 5 (1977), 126; Durand und Navarro, Proc. Biochem. 13, Nr. 9 (1978), 14 und Vojtiek et al., Biologick´ listy 44 (1979), 192).

Die physikalische Immobilisierung von Zellen ist beispielsweise in der S-PS 1 13 908 (in Agar), der IT-PS 8 36 462 (mit Cellulosetriacetatfasern), der US-PS 37 91 926 und der SU-PS 6 59 611 (Einbau der Zellen in das bei der radikalischen Copolymerisation von Acrylamid mit Methylen- bis[acrylamid] entstehende Netzwerk) beschrieben.

Die chemische Immobilisierung von Zellen ist Gegenstand zahlreicher Patentschriften, die sich beispielsweise auf die kovalente Bindung von Zellen an verschiedene synthetische oder natürliche Polymere nach vorhergehender chemischer Modifizierung und Aktivierung durch verschiedene Reagentien beziehen. Als Träger dienen hierbei zahlreiche synthetische oder natürliche organische Materialien bzw. inerte oder chemisch aktive Polymere, beispielsweise auf der Basis von Methacrylaldehyd, Glycidylmethacrylat, Hydroxyalkylmethacrylaten, natürlichen Polymeren, wie etwa Cellulose und deren Derivaten, Collagen, Gelatine, anorganischen Materialien, wie Glas, sowie etwa Verbindungen von Titan, Zirkonium, Vanadium und dgl.

Abgesehen davon, daß Präparate von in dieser Weise immobilisierten Zellen nur eine geringe spezifische Aktivität besitzen und ihre Teilchen mechanisch wenig verschleißfest sind, sind hierfür verwendete Träger dieses Typs teuer, wobei der Preis von der Zugänglichkeit und der angewandten Technologie bei der vorhergehenden chemischen Modifizierung und Aktivierung durch oftmals sehr aggressive und toxische Reagentien abhängt; hierdurch wird die Herstellung und damit auch die industrielle Ausnutzung immobilisierter Zellen limitiert.

Ein gewisser Fortschritt bei der Zellimmobilisierung mit technischer Bedeutung geht aus dem Verfahren der S- PS 1 97 101 hervor. Das Prinzip dieser Verfahrensweise besteht in der Bindung nativer Produktionszellen mit Penicillinacylaseaktivität an Zellenträger verschiedener Organismenarten, wobei entweder ganze unverletzte und/oder physikalisch, chemisch oder biochemisch behandelte Zellen oder deren nichtlösliche Fragmente chemisch durch kovalente Bindung unter Verwendung polyfunktioneller Reagentien, vor allem Glutaraldehyd, nach vorangehender physikalisch- chemischer Flockung vorzugsweise mit Flockungsmitteln mit Verbindungen mit mindestens zwei primären und/ oder sekundären Aminogruppen im Molekül gebunden werden. Bei dieser Art der Immobilisierung der Zellen werden niedrigere Gestehungskosten des Trägers erzielt, da als Träger Abfallzellen oder desintegrierte Mischungen davon oder etwa celluläre Abfallbiomasse verschiedener Fermentationsprozesse verwendet werden, deren Kosten meistens sehr gering sind.

Eine weitere, noch vorteilhaftere Art der chemischen Bindung von Produktionszellen ohne Benutzung von Trägern ist im S-Urheberschein 2 03 607 beschrieben; diese Verfahrensweise eignet sich universell für die wechselseitige Immobilisierung von Zellen ohne Verwendung eines Trägers für prokaryotische und eukaryotische Zellen von Mikroorganismen mit verschiedener Enzymaktivität (vgl. auch den S-Urheberschein 2 09 265). Bei dieser Verfahrensweise werden sehr stabile Präparate von wechselseitig kovalent aneinander gebundenen Zellen verschiedener Mikroorganismen erhalten, die die angestrebte Enzymaktivität aufweisen und integrale Einheiten gut sedimentierender Teilchen aufweisen. Prinzipiell werden hierbei native Produktionszellen mit bifunktionellen vernetzenden Reagentien, vor allem Glutaraldehyd, chemisch umgesetzt, wodurch eine kovalente Bindung des Zellinhalts der individuellen Zellen und eine kovalente Fixierung der angestrebten Enzymaktivität der Produktionszellen sowie Beständigkeit dieser Zellen gegen natürliche oder künstliche Autolyse erzielt wird. In einer weiteren Stufe werden die vernetzten Zellen durch einzelne oder kombinierte Einwirkung von physikalischen, physikalisch- chemischen oder chemischen Einflüssen permeabilisiert, wodurch die Diffusionsbarriere der vernetzten Zellen durch Ausschwemmen makromolekularer Materialien beseitigt wird, die Bestandteile der Oberflächenstrukturen der Zellen sind und nicht mit Glutaraldehyd reagiert haben, beispielsweise von Lipiden. In der letzten Verfahrensstufe werden die vernetzten und permeabilisierten Zellen in Gegenwart eines freien Vernetzungsreagens, vor allem Glutaraldehyd, mit Gemisch mit damit reagierenden, wasserlöslichen Substanzen mit mindestens zwei primären und/oder sekundären Aminogruppen im Molekül, vor allem Polyethylenimin und Hexamethylendiamin, unter Bedingungen, die den gegenseitigen Kontakt der Zellen während der Reaktion begünstigen, beispielsweise Tiefkühlung, Einwirkung von Zentrifugalfedern, von Filtrationsdruck etc., kovalent aneinander gebunden.

Aufgrund der erläuterten Verfahrensschritte bei der Herstellung solcher immobilisierter Zellen könnte unterstellt werden, daß die Erzeugung von Biokatalysatoren auf der Basis von Zellmaterialien bereits in hinreichend wirtschaftlicher Form ausgearbeitet ist. Dies gilt jedoch keineswegs generell und vor allem deswegen nicht, weil bei einigen in den Zellen von Produktionsorganismen vorliegenden Enzymen bei der einfachen Penetration aggressiver, niedermolekularer Vernetzungsmittel, wie beispielsweise Glutaraldehyd, auch bei sehr niedrigen Konzentrationen im intracellulären Raum rasch eine irreversible Inaktivierung der Enzyme eintritt, wodurch bei einigen empfindlichen Enzymen eine erhebliche Verringerung des enzymatischen Wirkungsgrads, wahrscheinlich durch kovalente Bindungen und dadurch hervorgerufene Änderungen der Raumstruktur der aktiven Stelle der Enzyme, die nicht wieder in die ursprüngliche natürliche Konformation zurückgeführt werden kann, resultiert. Dieser Umstand wurde vor allem bei einigen Produktionszellen mit racemisierender oder lytischer Aktivität festgestellt.

Der Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, Biokatalysatoren auf der Basis von immobilisiertem enzymatisch aktivem Zellmaterial und ein Verfahren zu ihrer Herstellung anzugeben, bei denen die oben angegebenen Nachteile des Stands der Technik nicht auftreten. Die Biokatalysatoren sollen dabei gute Sedimentationseigenschaften sowie eine hohe spezifische Aktivität besitzen und auch in Fällen hochempfindlicher Enzyme mit hoher Immobilisierungsausbeute zugänglich sein.

Die Aufgabe wird gemäß dem kennzeichnenden Teil der Patentansprüche 1 bzw. 11 gelöst.

Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand der Unteransprüche 2 bis 10.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Biokatalysatoren beruht auf der Immobilisierung von enzymatisch aktivem Zellmaterial aus

• - ganzen, unbeschädigten nativen oder ggf. zuvor permeabilisierten Zellen oder Zellfragmenten und deren subcellulären Teilchen und/oder
• - Gemischen ganzer nativer Zellen mit ihren Zellfragmenten, subcellulären Teilchen und dem gesamten freigesetzten Zellinhalt und/oder
• - ganzen, individuell vernetzten und permeabilisierten Zellen, der Abtrennung der entstandenen Zellaggregate aus dem Reaktionsgemisch und Waschen mit Wasser oder einer Pufferlösung sowie ggf. weiterer Permeabilisierung und/oder mechanischer Verfestigung und ist gekennzeichnet durch Immobilisierung des enzymatisch aktiven Zellmaterials durch Inkontaktbringen mit einem wasserlöslichen, chemisch reaktiven Polymer, das durch Umsetzung einer wasserlöslichen Substanz mit mindestens zwei primären und/oder sekundären Aminogruppen im Molekül mit einem oder mehreren Dialdehyden bei 0 bis 60°C in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 4,0 bis 12,0 erhalten worden ist, bei -30 bis +50°C in einem wäßrigen Medium und bei einem pH-Wert von 5,0 bis 9,0.

Geeignete wasserlöslichen Substanzen mit mindestens zwei primären und/oder sekundären Aminogruppen im Molekül sind beispielsweise Hexamethylendiamin, Lysin und Polylysin und vorzugsweise Polyethylenimine. Bevorzugter Dialdehyd ist Glutaraldehyd.

Die erfindungsgemäßen Biokatalysatoren enthalten als Zellmaterial prokaryotische oder eukaryotische Zellen von Organismen und insbesondere grampositiven, gramnegativen und gramlabilen Bakterien, säureresistenten Bakterien, Actinomyceten, Hefen und anderen mikroskopischen Pilzen sowie höheren, vor allem parasitären Pilzen und Pflanzenzellen, ggf. auch deren Fragmente und subcelluläre Teilchen, die Enzymaktivität tragen, insbesondere Hydrolasen, Isomerasen, Lyasen, Decarboxylasen, Oxidoreductasen und andere Enzyme und/oder Teile von Enzymsequenzen oder gesamte Enzymsequenzen von biochemischen Reaktionsfolgen, insbesondere des degradativen Metabolismus, der Glycolyse, von Hormonbiotransformationen sowie Enzymen der Alkaloidproduktion, insbesondere von Solanum-Alkaloiden und Phytosterinen sowie Mutterkorn-Alkaloiden.

Es ist erfindungsgemäß vorteilhaft, zur Herstellung des wasserlöslichen Polymers sowie zur eventuellen vorhergehenden Ausflockung des Zellmaterials eine wäßrige Lösung eines Polyethylenimins mit einer Molekülmasse im Bereich von 100 000 bis 800 000 zu verwenden.

Die Umsetzung des Zellmaterials mit dem Polymer wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 0 bis 45°C, einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 1 bis 50 000 und/oder einem Filtrationsdruck von 0 bis 50 000 kPa unter Stehenlassen, langsamem Rühren oder Rühren mit Unterbrechungen und Stehenlassen des Reaktionsgemisches durchgeführt.

Die Permeabilisierung der nativen Zellen vor der Immobilisierung oder der erhaltenen Zellaggregate nach der Immobilisierung kann durch Rühren der entsprechenden Suspension des Zellmaterials in einem wäßrigen Medium bei Temperaturen von 0 bis 70°C und einem pH-Wert von 4,0 bis 9,0 in Gegenwart eines Tensids und/oder organischen, mit Wasser mischbaren und/oder nicht-mischbaren Lösungsmitteln durchgeführt werden, insbesondere mit Aceton, Ether, Isopropanol, Petrolether, Butylacetat, Chloroform, Dioxan, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid, wobei gleichzeitig oder anschließend die Ionenstärke der Suspension durch Zugabe von Salzen starker Säuren und/ oder Alkalien geändert wird.

Die Teilchen der immobilisierten Zellen werden ggf. durch teilweise Dehydratation durch Einwirkung organischer Lösungsmittel, vorzugsweise Aceton, sowie ggf. mit Lösungen von Klebemitteln in organischen Lösungsmitteln oder deren Gemischen mit Wasser bei Temperaturen von -25 bis +20°C weiter mechanisch verfestigt; die entstandenen Teilchen können ferner abgesaugt und in einem trockenen oder feuchten Medium teilweise getrocknet sowie ggf. in geeigneter Weise nachgeformt werden.

Die erfindungsgemäß erzielten Vorteile liegen wesentlich darin, daß mit Hilfe des chemisch reaktiven, wasserlöslichen Polymers Biokatalysatoren auf der Basis immobilisierter Zellen mit hoher spezifischer Aktivität, guten Sedimentationseigenschaften und hoher Immobilisierungsausbeute zugänglich sind, und zwar auch in Fällen hochempfindlicher Enzyme, in denen nicht gemäß den S- Urheberscheinen 1 97 101, 2 03 607 und 2 09 265 verfahren werden kann, da im Gegensatz zu diesen bekannten Verfahrensweisen, bei denen freie, niedermolekulare Vernetzungsmittel angewandt werden, das reaktive Polymer im erfindungsgemäßen Fall zwar in Wasser löslich ist, jedoch bereits eine so hohe Molekülmasse besitzt, daß es nicht mehr in die Zellen penetrieren kann, und eine kovalente Bindung zwischen der Zellenoberfläche und reaktiven Aldehydgruppen des aktivierten reaktiven Polymers unter Immobilisierung erzielt wird.

Der eigentliche Mechanismus der Bildung chemisch reaktiver und in Wasser löslicher Polymerer, beispielsweise unter Verwendung von Polyethylenimin und Dialdehyden, wie insbesondere Glutaraldehyd, beruht wahrscheinlich auf der internen Vernetzung des Polyethylenimins unter bevorzugter Bildung farbiger Schiff'scher Basen durch Reaktion der Aldehydgruppen des Glutaraldehyds mit primären oder sekundären Aminogruppen des Polyethylenimins (C=N-Bindungen), was zu einem Anstieg der Molekülmasse und zur gleichzeitigen chemischen Aktivierung einiger primärer oder sekundärer Aminogruppen führt, die in verzweigten und wahrscheinlich endständigen Ketten des Polyethylenimins vorhanden sind, ferner durch Kettenübertragung auf reaktive Aldehydgruppen, wobei das entstehende vernetzte, chemisch reaktive Polymer in einer wässerigen Lösung gelöst bleibt, und die resultierende Lösung des reaktiven Polymers eine klare, durchsichtige gelbbraune bis rotbraune Flüssigkeit darstellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt prinzipiell zwei Verfahrensschritte: In einem ersten Schritt wird das chemisch reaktive, wasserlösliche Polymer vorzugsweise durch Umsetzung handelsüblicher Flockungsmittel mit einem Gehalt einer Fraktion eines Polyethylenimins, wie sie zur Abwasserreinigung verwendet werden, beispielsweise Sedipur KA oder Sedipur CL-930, mit einem Dialdehyd als Vernetzungsmittel, insbesondere Glutaraldehyd, in einem wasserhaltigen Medium und vorzugsweise unter Rühren des Reaktionsgemischs hergestellt. Die Geschwindigkeit der Polyreaktion kann z. B. anhand der Kozentrationszunahme der farbigen Schiff'schen Basen im sichtbaren Spektralgebiet, beispielsweise bei 550 nm, durch die Änderung der Absorption ermittelt werden, wobei die Konzentration vor allem vom Verhältnis der beiden Reaktionskomponenten, also dem Vernetzungsmittel und der damit umgesetzten Verbindung, sowie der Reaktionsdauer und der Reaktionstemperatur abhängig ist. Die Reaktion kann hierbei kinetisch durch ein Zeitgesetz erster Ordnung beschrieben werden.

In der zweiten Reaktionsstufe werden in die teilweise oder quantitativ umgesetzte Lösung des reaktiven Polymers native, frische, vorher vom Kultivierungsmedium abgetrennte mikrobielle oder pflanzliche Zellen mit der gewünschten Enzymaktivität und/oder vernetzte und permeabilisierte Zellen in Fällen, wenn die Empfindlichkeit des betreffenden Enzyms die vorhergehende Anwendung einer freien Lösung des Vernetzungsmittels ermöglicht, und ggf. Gemische ganzer nativen Zellen und desintegrierter Zellen in Form einer Suspension mit den Zelldesintegrationsfragmenten eingemischt, wobei Größe, Form, Art, Porosität und spezifische Aktivität der immobilisierten Zellmaterialien durch das angewandte Immobilisationsverfahren, insbesondere Tiefkühlung, Stehenlassen, schwaches Rühren, Einwirkung eines Filtrationsdrucks, eines Zentrifugalfeldes, Auspressen der Suspension oder der entstandenen Teilchen durch geeignete Einrichtungen und anschließende partielle Trocknung der Teilchen in einem trockenen oder feuchten Millieu, eingestellt werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt ferner auch die Permeabilisation der Zellen vor der Immobilisierung bzw. der entstandenen Zellaggregate nach der Immobilisierung sowie ggf. angeschlossene weitere Verfahrensschritte, insbesondere in den Fällen, in denen als Ausgangsmaterial ganze native Zellen eingesetzt wurden, wobei ggf. die erhaltenen immobilisierten Teilchen zur Erhöhung ihrer mechanischen Stabilität und Festigkeit einer Nachbehandlung unterzogen werden können, insbesondere durch teilweise Dehydratation der Teilchen durch Behandlung mit Aceton oder anderen organischen Lösungsmitteln, die nach der teilweisen Eintrocknung eine schützende Mikroschicht eines wasserunlöslichen Films auf der Oberfläche der Teilchen bilden; hierbei werden die Nachbehandlungsbedingungen im Hinblick auf die Limitierung der enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeit durch Diffusion individuell gewählt.

Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Biokatalysatoren können prinzipiell nicht nur verschiedene Arten und Stämme prokaryotischer und eukaryotischer mikrobieller Zellen mit verschiedener Enzymaktivität, sondern auch Pflanzenzellen, und zwar mikrobielle wie auch eigentliche pflanzliche Zellen, verwendet werden ohne Rücksicht darauf, ob die Enzyme mit der gewünschten Enzymaktivität im periplasmatischen oder intracellulären Raum (im Cytoplasma der Zelle) lokalisiert sind.

Das Erfindungskonzept ist entsprechend in sehr breitem Rahmen anwendbar, wie aus den Ausführungsbeispielen hervorgeht, wobei die Art des Enzyms bzw. der Typ der angestrebten enzymkatalysierten biochemischen Reaktion nicht prinzipiell entscheidend ist. Für einen gegebenen Typ prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen ist es im Hinblick auf die Lokalisation des angestrebten Enzyms in der Zelle und die Qualität des Enzyms bzw. den Typ der enzymkatalysierten biochemischen Reaktion und die bekannte oder vorausgesetzte chemische Zusammensetzung der Zelloberfläche (Peptidoglucan, Lipoprotein, Lipopolysaccharid, Chitin, Chitosan und dgl.) erforderlich, die Verfahrensweise der Immobilisierung beispielsweise unter Tiefkühlung, Stehenlassen, Rühren etc. und vor allem die Verfahrensweise bei der Permeabilisation der Zellen vor und/oder nach ihrer Bildung in geeigneter Weise speziell zu wählen, insbesondere, wenn als Ausgangsmaterial für die Immobilisierung frische, unbeschädigte, native lebende Zellen eingesetzt werden.

Die eigentliche erfindungsgemäße Immobilisierung ist ferner auch im Hinblick auf die vorausgesetzte Häufigkeit und Zugänglichkeit reagierender Gruppen, die Bestandteile der Zelloberfläche sind und auch durch Art und physiologischen Zustand der immobilisierten Zellpopulation bestimmt sind, zu wählen. In Fällen, in denen bekannt oder vorausgesetzt ist, daß bei den eingesetzten Zellen die Häufigkeit und Zugänglichkeit der reagierenden Gruppen auf der Zelloberfläche nur gering ist, insbesondere bei pflanzlichen Zellen, kann die erfindungsgemäße Verfahrensweise vorteilhaft mit einer vorhergehenden Flokkulation der nativen Zellsuspension mit solchen Flockungsmitteln kombiniert werden, die Verbindungen mit mindestens zwei primären und/oder sekundären Aminogruppen enthalten; auf diese Weise werden zuvor physikalisch- chemisch gebildete Aggregate entweder nach Absaugen oder direkt in die Lösung des reaktiven Polymers eingemischt, womit einerseits der wechselseitige Kontakt der Zellen miteinander erleichtert und andererseits die Zelloberfläche an in die Reaktion eintretenden Gruppen angereichert wird.

Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Biokatalysatoren können Produktionszellen verwendet werden, die verschiedene Enzyme enthalten, und zwar verschiedene Arten und Stämme von Bakterien, Actinomyceten, Hefen, Fungi imperfecti, höheren parasitischen Pilzen und Pflanzenzellen. Dabei ist es ferner vorteilhaft, für die Immobilisierung solche Zellen zu verwenden, die durch Züchtung, Selektion, Konzentrierungsverfahren oder genetische Manipulation gewonnene mutante Organismen darstellen, da dann die gewonnenen immobilisierten Präparate eine hohe spezifische Aktivität aufweisen.

Die Größe der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Teilchen aus gebundenen Zellen wurde lichtmikroskopisch mit einem speziellen Meßokular ermittelt. Einige Präparate wurden ferner rasterelektronenmikroskopisch untersucht. Die Sedimentationseigenschaften wurden in der Weise ermittelt, daß 2,5 g nasse Präparatmasse in insgesamt 25 ml entmineralisiertem Wasser in einem Meßzylinder suspendiert wurden, und die zur quantitativen Sedimentation der Teilchen erforderliche Zeit ermittelt wurde. Zur Ermittlung der Teilchengröße wurden ferner metallische Prüfsiebe zur Siebanalyse herangezogen, wobei die gebundenen Zellen je nach Größe mit drei Sätzen dieser Prüfsiebe mit Maschenweiten von 0,03 bis 2,00 mm fraktioniert wurden.

Die enzymatische Aktivität der immobilisierten Materialien wurde unter Rühren und Temperierung einer definierten Menge der Teilchen der gebundenen Zellen in einer Substratlösung im Gebiet der Kinetik Nullter Ordnung der Enzymreaktion ermittelt, wobei die Enzymaktivität in Form der spezifischen Aktivität als Menge µmol Produkt(e) pro mg bzw. g nasse Präparatmasse in den Beispielen angegeben ist, sofern nichts anderes erwähnt ist. Die Erhaltung der gesamten Enzymreaktionssequenz in den immobilisierten Zellen wurde manometrisch anhand der Gesamtproduktion von CO₂, die während einer festgesetzten Zeit aus Saccharose gebildet wurde, bestimmt. Im Fall der Produktion verschiedener Alkaloide, insbesondere Solanum-Alkaloiden und Phytosterinen, wurden diese Stoffe durch HPLC-Chromatographie bestimmt.

Die erhaltenen Teilchen der erfindungsgemäßen Biokatalysatoren aus immobilisierten Zellen können nach ggf. erfolgter mechanischer Verfestigung durch teilweise Dehydratation durch Einwirkung organischer Lösungsmittel, vorzugsweise von Aceton, ggf. mit Lösungen handelsüblicher Klebstoffe in organischen Lösungsmitteln, nach Absaugen und partieller Trocknung unter trockenen oder feuchten Bedingungen in geeigneter Weise nachgeformt werden, wodurch Größe, Form, Art, Porosität, spezifische Aktivität und Sedimentationseigenschaften der immobilisierten Materialien eingestellt werden können.

In den nachfolgenden Ausführungsbeispielen sind als Substanzen mit mindestens zwei primären und/oder sekundären Aminogruppen im Molekül die handelsüblichen Flockungsmittel Sedipur CL-930 bzw. Sedipur-KA verwendet, die Polyethylenimine mit Molekülmassen von 200 000 bis 300 000 in einer Konzentration von etwa 30 Masse-% enthalten.

Die folgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Es wurden je 100 ml einer Lösung von Sedipur CL-930 in entmineralisiertem Wasser mit einer Konzentration von 1,0% (M/V) bzw. 2,0% (M/V) hergestellt. Die Lösungen wurden in 500-ml-Siedekolben umgegossen, die auf eine Rotationsschüttelmaschine (260 U/min) gebracht wurden. In diese Lösungen, deren pH 6,1 betrug, wurde eine 25%ige wässerige Lösung von Glutaraldehyd in der Weise zugegeben, daß seine Konzentration im Reaktionsgemisch im ersten Fall 0,5 Vol.-% und im zweiten Fall 1,0 Vol.-% betrug. Die Kolben mit den Reaktionsgemischen wurden mit einer Aluminiumfolie abgedeckt; nach Einschalten der Schüttelmaschine wurde in vorgegebenen Zeitabständen die Polymerisationsgeschwindigkeit spektrophotometrisch bei 550 nm verfolgt. Die Reaktion wurde unter ununterbrochenem Rühren bei einer Temperatur von 20°C durchgeführt. Die Absorptionswerte der einzelnen, zeitabhängig gezogenen Proben wurden gegen entmineralisiertes Wasser gemessen. Die Ergebnisse, die den Konzentrationsanstieg der Schiff'schen Basen für beide Reaktionsgemische zeigen, sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle  1

Nach 24 h Reaktionsdauer lagen rotbraun gefärbte Lösungen mit einem pH-Wert von 4,9 vor.

In die in der oben angegebenen Weise hergestellten umgesetzten Lösungen des reaktiven Polymers wurden unter intensivem Rühren jeweils 25 g (Feuchtmasse) ganze unbeschädigte Bakterienzellen von B. al caligenes metalcaligenes in Form einer nicht gewaschenen nassen Zellpaste mit Aspartatammoniak-Lyaseaktivität eingemischt, die durch Zentrifugieren nach der Kultivierung gewonnen war.

Die spezifische Aktivität der Zellen betrug 550 µmol L-Asparaginsäure/min · g, bezogen auf die Feuchtmasse, bei 37°C, pH 8,5 und Verwendung einer 1,35-M-Lösung von Ammoniumfumarat als Substrat.

Nach dem Einmischen der Zellen in jedes der Reaktionsgemische wurden die homogenen Suspensionen in zwei Aluminiumschalen mit einem Durchmesser von 20 cm umgegossen, wobei die Füllhöhe etwa 1,5 cm betrug, und danach 4 h bei -20°C in einer Tiefkühlbox gelagert. Danach wurde der gefrorene Schaleninhalt mit etwa 100 ml entmineralisiertem Wasser übergossen, worauf die Schalen 1 h bei Raumtemperatur langsam auftauen gelassen wurden. Im Anschluß daran wurden die erhaltenen Aggregate in Glasgefäße umgegossen, die 1 l entmineralisiertes Wasser enthielten; nach langsamem Durchmischen und quantitativer Sedimentation nach Stehenlassen wurde das Waschwasser abgegossen und das erhaltene Produkt noch dreimal mit 1 l Leitungswasser dekantiert. Die erhaltenen Teilchen wurden dann auf einer Fritte mit Textilauflage im Vakuum gut abgenutscht und gewonnen. Vom ersten Reaktionsgemisch wurden 16,0 g und vom zweiten Reaktionsgemisch 18,2 g immobilisierte Zellen (jeweils Feuchtmasse) erhalten.

Die biochemische und weitere Charakterisierung der beiden immobilisierten Materialien wurde wie oben erläutert durchgeführt; die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt:

Tabelle 2

Beispiel 2

Es wurde eine Lösung eines reaktiven Polymers wie in Beispiel 1 hergestellt (Anfangskonzentrationen 2,0% Sedipur CL-930 und 1,0% Glutaraldehyd).

In 100 ml der Lösung des reaktiven Polymers wurden 25 g Bakterienzellen wie in Beispiel 1 intensiv eingemischt; anschließend wurde wie in Beispiel 1 verfahren.

Es wurden 17,2 g (Feuchtmasse) gut abgesaugte Aggregate mit einer spezifischen Aktivität von 512 µmol L- Asparaginsäure/min · g gewonnen.

Das erhaltene Material wurde in 50 ml einer 5%igen Lösung von Kanagon in Aceton, die vorher auf -20°C abgekühlt wurde, suspendiert; nach 3 min Rühren bei Raumtemperatur wurde das Material in der oben angegebenen Weise im Vakuum scharf abgesaugt und noch etwa 15 min auf der Fritte weiter abgesaugt, um eine teilweise Trocknung des Klebemittels auf der Oberfläche der einzelnen Teilchen zu erzielen.

Danach wurden 10,5 g Material abgewogen und in 100 ml einer 1,35-M-Lösung von Ammoniumfumarat mit pH 8,5 suspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur bei +8°C gelagert. Nach erneutem Absaugen im Vakuum wurde das Material auf der Fritte mit 1 l Wasser gewaschen und nach gutem Absaugen gewogen (13,0 g).

Die spezifische Aktivität des Materials betrug 180 µmol L-Asparaginsäure/min · g (Feuchtmasse). Das Material bestand aus festen, rauhen, begrenzten Plättchen mit einer Teilchengröße im Bereich von 400 bis 600 µm. Nach 2 min Stehenlassen lag quantitative Sedimentation vor.

Beispiel 3

Es wurde eine Lösung eines reaktiven Polymers wie in Beispiel 1 und 2 hergestellt mit dem Unterschied, daß unter sonst identischen Bedingungen die Reaktionsdauer 3 h betrug.

In 100 ml dieser Lösung des reaktiven Polymers wurden 25 g Bakterienzellen wie in Beispiel 1 und 2 eingemischt; anschließend wurde zur Herstellung der immobilisierten Zellen wie in Beispiel 2 verfahren mit dem Unterschied, daß vor der Behandlung das Material mit der Lösung des Klebemittels in Aceton die Aggregate durch 3 h Rühren auf einer Rotationsschüttelmaschine mit 260 U/min bei 30°C in 100 ml einer 1,0 M wäßrigen Lösung von Ammoniumsulfat mit pH 8,5 und einem Gehalt von 0,1% eines Tensids permeabilisiert wurden. Anschließend wurde das Material in der oben angegebenen Weise im Vakuum gut abgesaugt, mit 1 l Wasser gewaschen, erneut abgesaugt, gewogen (16,0 g) und dann wie in Beispiel 2 weiterbehandelt.

Es wurden 10 g immobilisierte Zellen (Feuchtmasse) mit einer spezifischen Aktivität von 250 µmol L-Asparaginsäure/min · g (Feuchtmasse) gewonnen; das Material bestand aus festen, rauhen, begrenzten Plättchen mit einer mittleren Teilchengröße von 300 bis 550 µm; durch 3 min Stehenlassen trat quantitative Sedimentation ein.

Beispiel 4

300 g einer frischen nassen Paste aus nativen ganzen Bakterienzellen von Escherichia coli, die nach der Kultivierung durch Zentrifugieren abgetrennt worden waren und eine spezifische Aktivität an Penicillinacylase von 8,0 µmol 6-APK/h · mg (Feuchtmasse) (42°C, pH 7,6, Substrat Kaliumsalz von Benzylpenicillin) aufweisen, wurden in 1 l einer Lösung eines reaktiven Polymers, das durch Umsetzung einer 2%igen Lösung von Sedipur KA und einer 1%igen Lösung Glutaraldehyd bei 30°C während einer Reaktionsdauer von 24 h nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 hergestellt worden war, in Form einer homogenen Suspension durch intensives Rühren mit einem Stahlpropellermischer suspendiert. Die Suspension wurde anschließend in vier etwa gleiche Volumteile (zu 320 ml) aufgeteilt; jeder Teil wurde separat in Igelitsäcke eingebracht, die mehrfach umgefalzt und mit Metallklammern verschlossen wurden; die Säcke wurden in horizontaler Lage in einer Tiefkühlbox bei -20 bis -25°C etwa 5 h gelagert, wobei die Schichtdicke des Reaktionsgemischs bei der horizontalen Lagerung der Säcke etwa 1,5 bis 2 cm betrug.

Nach dieser Zeit wurden die Säcke aus der Tiefkühlbox entnommen; der gefrorene Inhalt wurde in den Säcken mechanisch zerkleinert; die Säcke wurden anschließend zerschnitten und ihr Inhalt in 10 l vorgelegtes, entmineralisiertes, 25°C warmes Wasser in einem Glasgefäß eingebracht. Das Material wurde dann während 1 bis 2 h durch mildes, unterbrochenes Rühren aufgetaut, nach quantitativer Sedimentation der gebildeten Teilchen vom Waschwasser abdekantiert und danach noch dreimal mit 5 l Leitungswasser dekantiert. Anschließend wurden die Aggregate auf einer Nutsche mit Textilbelag im Vakuum scharf abgesaugt, auf der Nutsche noch mit 5 l Leitungswasser gewaschen und danach in Form des nassen Filterkuchens nochmals gut abgesaugt.

215 g der nassen Präparatmasse des gut abgesaugten Materials wurden dann unter Rühren in 500 ml eines zuvor auf -15°C abgekühlten Aceton-Wasser-Gemisches (1 : 1) suspendiert und 3 min bei Raumtemperatur in verdünntem Aceton intensiv durchgemischt; danach wurde das Material scharf im Vakuum abgesaugt, noch 5 bis 10 min auf der Nutsche durchgesaugt und anschließend mit etwa 5 l Leitungswasser gewaschen, erneut gut abgesaugt, in 1 l 0,05-M-Phosphatpuffer mit pH 7,6 suspendiert und über Nacht bei +8°C quellen lassen.

Insgesamt wurden 180 g immobilisierte Zellen (Feuchtmasse) mit einer spezifischen Aktivität an Penicillinacylase von 6,5 µmol 6-APK/h · mg (Feuchtmasse) gewonnen; das Material bestand aus begrenzten Plättchen mit einer Teilchengröße im Bereich von 150 bis 450 µm; durch 5 min Stehenlassen wurde quantitative Sedimentation erzielt.

Beispiel 5

250 g (Feuchtmasse) vernetzte und permeabilisierte Bakterienzellen von Escherichia coli mit Penicillinacylaseaktivität (spezifische Aktivität 7,0 µmol 6-APK/h · mg (Feuchtmasse), die gemäß dem Verfahren des CS-Urheberscheins 2 03 607 vernetzt und permeabilisiert worden waren, wurden in 1 l einer Lösung eines reaktiven Polymers eingemischt, das wie in Beispiel 1 hergestellt worden war mit dem Unterschied, daß die Reaktionsdauer 5 h betrug. Nach dem Vermischen der Zellen in der Lösung des reaktiven Polymers zu einer homogenen Suspension wurde die Immobilisierung der Zellen gemäß Beispiel 4 einschließlich der Behandlung des Materials mit dem Aceton-Wasser-Gemisch vorgenommen.

Es wurden insgesamt 166 g (Feuchtmasse) immobilisierte Zellen mit Penicillinacylaseaktivität erhalten, deren spezifische Aktivität 6,0 µmol 6-APK/h · mg (Feuchtmasse) betrug; das Material bestand aus begrenzten braunschwarzen Plättchen mit einer Teilchengröße im Bereich von 180 bis 400µm; durch 3 min Stehenlassen wurde quantitative Sedimentation erzielt.

Beispiel 6

40,0 g (Feuchtmasse) frische native Zellen von Escherichia coli mit Penicillinacylaseaktivität gemäß Beispiel 4 wurden in 150 ml einer wie in Beispiel 4 hergestellten Lösung eines reaktiven Polymers homogen suspendiert; das Gemisch wurde auf 10-ml-Polyethylenküvetten verteilt. Die Bildung von Aggregatteilchen der immobilisierten Zellen wurde durch die Einwirkung unterschiedlicher relativer Zentrifugalbeschleunigungen beeinflußt. Die Reaktion wurde 3 h bei 20°C durchgeführt. Nach der Reaktion wurden die Präparate zweimal mit Wasser dekantiert, über Textilmaterial im Vakuum abgesaugt und wie in Beispiel 4 mit einem Aceton- Wasser-Gemisch behandelt und über Nacht quellen gelassen. Anschließend wurden die Präparate wieder im Vakuum abgesaugt, abgewogen und weiter charakterisiert.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3

Beispiel 7

28 g (Feuchtmasse) einer frischen Paste von nativen Zellen von Escherichia coli, die das Enzym Galactosidase enthielten, wurden in 100 ml einer Lösung eines reaktiven Polymers intensiv suspendiert, das durch 24 h Umsetzung gemäß Beispiel 1, jedoch mit dem Unterschied erhalten worden war, daß die anfängliche Konzentration der beiden Reaktionskomponenten 5% (M/V) Sedipur CL-930 bzw. 2,8 Vol.-% Glutaraldehyd betrug.

Die spezifische Aktivität der frischen nativen Zellen in der Paste betrug 0,42 µmol Glucose + Galactose/min · g (Feuchtmasse) der Nativzellen (37°C, pH 7,0, Lösung von Lactose als Substrat).

Die homogene Zellsuspension wurde durch 2 h Stehenlassen bei Raumtemperatur umgesetzt. Danach wurde das entstandene schwammige Präzipitat der Zellaggregate in der in den obigen Beispielen beschriebenen Weise im Vakuum abgesaugt und die erhaltene Masse in Form eines nassen Kuchens in einen Gewebebeutel eingebracht; die Öffnung des Beutels wurde umgefalzt und mit Metallklammern verschlossen; der Beutel wurde in horizontaler Lage zwischen Metallplatten eingebracht und mit einer hydraulischen Presse bei Raumtemperatur 2 h lang einem Filtrationsdruck von 1,25 · 10⁴ kPa ausgesetzt. Danach wurde die dunkle, feste Masse in Form einer Platte mechanisch durch Zerbrechen zu kleineren Stücken zerkleinert, die in 100 ml in einem Haushaltsmixer vorgelegtes Wasser eingetragen und darin bei der niedrigsten Drehzahl und unterbrochenem Einschalten zu kleineren Teilchen desintegriert wurden.

Nach der Desintegration und Homogenisation wurde das Material dreimal mit 0,5 l Wasser dekantiert, im Vakuum gut abgesaugt, gewogen (16,2 g) und in 100 ml einer 1-M-NaCl-Lösung eingebracht, die 0,2% Tensid und 1% Dimethylsulfoxid enthielt.

Die Suspension wurde auf 40°C temperiert und 3 h bei dieser Temperatur ununterbrochen gerührt. Nach der Permeabilisation wurden die Teilchen dreimal mi 1 l Leitungswasser dekantiert, in der oben angegebenen Weise im Vakuum gut abgesaugt, dann in 0,1-M-Phosphatpuffer pH 7,0 eingetragen und über Nacht quellen gelassen.

Nach Absaugen und Waschen der immobilisierten Zellen wurden insgesamt 30,2 g (Feuchtmasse) unregelmäßige, dunkle, amorphe Teilchen in Form sehr schnell sedimentierender Klumpen erhalten, deren spezifische Aktivität 0,12 µmol Glucose + Galactose/min · g (Feuchtmasse) betrug; die Teilchengröße lag im Bereich von 0,5 bis 2,6 mm.

Beispiel 8

30 g (Feuchtmasse) native ganze Zellen von Escherichia coli mit β -Galactosidaseaktivität wie in Beispiel 7 wurden in 100 ml 0,5-M-NaCl-Lösung eingebracht, die 0,5% Tensid enthielt; die Suspension wurde durch intensives Rühren gründlich homogenisiert und anschließend in einen 500-ml-Siedekolben umgegossen, der mit einer Aluminiumfolie abgedeckt und auf eine Rotationsschüttelmaschine mit 260 U/min gesetzt wurde. Die Suspension der nativen Zellen wurde 20 min unter ununterbrochenem Rühren bei einer Temperatur von 30°C permeabilisiert. Die Zellen wurden anschließend bei -20 000 10 min zentrifugiert; der Überstand wurde zusammengegossen; das Sediment der Zellpaste wurde gewogen.

26 g (Feuchtmasse) der in der angegebenen Art behandelten Zellen wurden in 100 ml einer Lösung eines reaktiven Polymers, die wie in Beispiel 2 hergestellt worden war, zu einer homogenen Suspension suspendiert; die Immobilisierung der Zellen wurde durch Tiefkühlung des Reaktionsgemischs sowie Behandlung der entstandenen Teilchen nach der Immobilisierung wie in Beispiel 2 vorgenommen mit dem Unterschied, daß 17 g (Feuchtmasse) der entstandenen Teilchen in 50 ml vorher auf -20°C abgekühltem reinem Aceton suspendiert wurden, und die Behandlung mit Aceton bei intensivem Rühren 3 min lang vorgenommen wurde, worauf das Material schnell und scharf auf einer Fritte im Vakuum abgesaugt, mit Wasser gewaschen und über Nacht in einem Medium von 0,1-M-Phosphatpuffer pH 7,0 bei +8°C quellen gelassen wurde.

Insgesamt wurden 12,6 g (Feuchtmasse) der immobilisierten Zellen mit einer spezifischen Aktivität an β -Galactosidase von 0,38 µmol Glucose + Galactose/min · g (Feuchtmasse) erhalten; die Teilchengröße betrug 85 bis 400 µm.

Das Material bestand aus Plättchen mit unregelmäßigen Rändern; durch 5 min Stehenlassen wurde quantitative Sedimentation erzielt.

Beispiel 9

2,5 kg (Feuchtmasse) frische native Zellen von Bacillus megatherium, die vor Beendigung der exponentiellen Wachstumsphase geerntet worden waren und eine proteolytische Aktivität von 38 Azocaseineinheiten/g (Feuchtmasse) (37°C, pH 7,5, Substrat Azocasein) aufwiesen, wurden in 10 l entmineralisiertem Wasser suspendiert; die Suspension wurde durch intensives Rühren homogenisiert und auf +5°C abgekühlt. Die Suspension wurde anschließend durch dreifachen Durchgang durch einen mechanischen Schlitzdesintegrator bei einem Druck von 253 bar desintegriert. Die Suspension wurde zwischen den einzelnen Desintegrationsschritten laufend so gekühlt, daß eine maximale Temperatur des desintegrierten Gemischs von 35°C nicht überschritten wurde.

Zu 1 l der desintegrierten Suspension der nativen Zellen, deren pH-Wert mit 20%iger NaOH-Lösung unter ununterbrochenem Rühren auf 7,5 geregelt wurde, wurde Sedipur KA als Flockungsmittel in einer solchen Menge zugegeben, daß die Konzentration in der desintegrierten Suspension 0,25 Vol.-% betrug. Die Suspension wurde nach gründlichem Mischen bei Raumtemperatur etwa 1 h ruhig stehengelassen, bis quantitative Ausflockung des desintegrierten Zellmaterials festgestellt wurde.

Anschließend wurden zu 1 l der Suspension 2 l einer Lösung eines reaktiven Polymers zugesetzt, die durch 24 h Umsetzung nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 mit dem Unterschied hergestellt worden war, daß die anfängliche Konzentration der beiden Reaktionskomponenten 4% (M/V) Sedipur KA und 2 Vol.-% Glutaraldehyd betrug. Das Einmischen der 2-l-Lösung des reaktiven Polymers wurde durch langsames Rühren mit der Hand mit einem Stab aus rostfreiem Stahl in der Weise durchgeführt, daß die vorher flokkulierten Teilchen nicht beschädigt wurden. Nach 2 h Stehenlassen wurde die stark viskose ausgeflockte und teilweise abreagierte Suspension langsam durchgemischt und auf 10 Polyethylensäcke von etwa 0,3 l Inhalt verteilt; anschließend wurde wie in Beispiel 4 weiter verfahren mit dem Unterschied, daß die immobilisierten Teilchen nach der Immobilisierung mit reinem, zuvor auf -20°C abgekühltem Aceton 3 min unter intensivem Rühren behandelt wurden, worauf sie im Vakuum scharf abgesaugt, einige Male mit Wasser dekantiert und in 1 l 0,1-M-Phosphatpuffer pH 7,5 eingebracht wurden, in dem sie über Nacht bei +8°C quellen gelassen wurden.

Insgesamt wurden durch die oben angegebene Verfahrensweise 1,28 kg immobilisierte Teilchen (Feuchtmasse) durch die stufenweise Bearbeitung der Ausgangssuspension erhalten, wobei die spezifische Aktivität des Materials 3,62 Azocaseineinheiten/g (Feuchtmasse) betrug; die Teilchengröße lag im Bereich von 0,4 bis 2,0 mm; durch 2 min Stehenlassen wurde quantitative Sedimentation erzielt.

Beispiel 10

In 100 ml einer 0,05 M wäßrigen NaCl-Lösung, deren pH-Wert mit 20%iger NaOH-Lösung auf 7,0 geregelt wurde, wurden 50 g (Feuchtmasse) frische, ganze native Zellen von Bacillus megatherium mit proteolytischer Aktivität wie in Beispiel 9 suspendiert. Nach der Homogenisierung der Suspension wurde der pH-Wert erneut in der oben angegebenen Weise auf den Wert 7,0 geregelt; anschließend wurde lyophilisiertes Ei-Lysozym in der Weise zugegeben, daß seine Konzentration in der Suspension 100 µm/100 ml betrug; nach 30 min Stehenlassen wurde der pH-Wert der Suspension vorsichtig mit der NaOH-Lösung unter Rühren auf 8,6 eingestellt und die Suspension einige min auf 50°C erwärmt, bis sich aufgrund der enzymatischen Lyse der Zellwände die Viskosität der Suspension plötzlich veränderte.

Im Anschluß daran wurden zu der Suspension ohne vorhergehende Flokkulation 100 ml der Lösung des reaktiven Polymers mit einer Konzentration der Reaktionskomponenten gemäß Beispiel 9 zugegeben, worauf die Suspension intensiv gemischt wurde. Danach wurde zur Immobilisierung einschließlich der Behandlung der Teilchen mit Aceton nach der Immobilisierung gemäß Beispiel 8 (Tiefkühlung des Reaktionsgemischs) verfahren.

Es wurden 30 g (Feuchtmasse) immobilisierte Teilchen gewonnen, deren spezifische Aktivität 2,4 Azocaseineinheiten/g (Feuchtmasse) betrug; die Teilchengröße lag im Bereich von 0,2 bis 1,0 mm; 3 min Stehenlassen führte zur quantitativen Sedimentation.

Beispiel 11

30 g (Feuchtmasse) einer frischen nativen Paste von Zellen der Hefe Kluyveromyces fragilis, die das Enzym β -Galactosidase mit einer spezifischen Aktivität von 0,017 µmol Glucose + Galactose/min · g (Feuchtmasse) (37°C, pH 6,0, Substrat Lactose) enthielten, wurden in 100 ml 0,1-M-Phosphatpuffer pH 7,0 suspendiert, der 0,1% Tensid und 1% Dimethylsulfoxid enthielt; nach Erwärmen auf 40°C wurde die Suspension bei dieser Temperatur ununterbrochen 30 min gerührt. Danach wurden die permeabilsierten Zellen zentrifugiert (50 g, 10 min); nach Abgießen des Überstands wurde das Sediment der Zellpaste gewogen.

25 g (Feuchtmasse) der in dieser Weise permeabilisierten Zellen wurden wie in Beispiel 8 immobilisiert und weiterbehandelt mit dem Unterschied, daß die Teilchen nach der Immobilsierung mit einer 1%igen Lösung von Kanagon in Aceton unter sonst identischen Bedingungen wie in Beispiel 8 behandelt und gequollen wurden.

Es wurden 15 g (Feuchtmasse) immobilisierte Zellen mit einer spezifischen Aktivität von 0,02 µmol Glucose + Galactose/min · mg (Feuchtmasse) der Teilchen gewonnen, die Teilchengröße lag im Bereich von 0,2 bis 1,5 mm; durch 2 min Stehenlassen sedimentierten die watteartigen Aggregate quantitativ zu einem relativ umfangreichen Sediment.

Beispiel 12

25 g (Feuchtmasse) frische ganze Zellen der Hefe Cryptococcus laurentii mit L-α-Amino-ε-aminocaprolactamhydrolaseaktivität mit einer spezifischen Aktivität von 5,9 µmol L-Lysin/h · mg (Feuchtmasse) (37°C, pH 7,5, Substrat wäßriges L-α-Amino-e- caprolactam) wurden unter intensivem Rühren in 100 ml einer Lösung eines reaktiven Polymers, die wie in Beispiel 2 hergestellt war, suspendiert; nach langsamem Rühren während 1 h wurde die stark viskose watteartige Suspension wie in Beispiel 2 durch Tiefkühlen einschließlich Behandlung der Aggregate nach der Immobilisierung durch Behandlung mit einem in Aceton gelösten Klebstoff verfestigt. Die erhaltenen abgesaugten Aggregate wurden über Nacht in Phosphatpuffer pH 7,0 bei +8°C quellen gelassen.

Es wurden 15 g (Feuchtmasse) immobilisierte Zellen mit einer spezifischen Aktivität von 3,2 µmol L-Lysin/h · mg (Feuchtmasse) mit einer Teilchengröße im Bereich von 0,125 bis 1,5 mm gewonnen; durch 2 min Stehenlassen wurde quantitative Sedimentation erzielt. Makroskopisch hatte das Material amorphes, watteartiges Aussehen; die mikroskopische Untersuchung ergab unregelmäßig geformte Teilchen mit unregelmäßigen Rändern.

Beispiel 13

30 g (Feuchtmasse) einer Paste aus frischen nativen Zellen von Mycobacterium sp., die das Enzym L-Asparaginsäure- decarboxylase mit einer spezifischen Aktivität von 7,1 E/g (Feuchtmasse) enthielten (1 Einheit E der Enzymwirksamkeit entspricht der Enzymmenge, die 100 µl CO₂ bei 30°C und pH 5,5 während 5 min aus L-Asparaginsäure freisetzt), wurden in 100 ml einer Lösung eines reaktiven Polymers wie in Beispiel 2 zu einer homogenen Suspension suspendiert; anschließend wurde durch Tiefkühlung des Reaktionsgemischs einschließlich Dekantation, Waschen und Absaugen wie in Beispiel 2 weiter verfahren.

Es wurden 19,6 g (Feuchtmasse) immobilisierte Zellen gewonnen.

Diese Teilchenmenge wurde in 100 ml 1-M-NaCl-Lösung mit pH 6,5 suspendiert, in der 0,5% Tensid gelöst war. In diese Suspension wurde Chloroform zu einer Konzentration von 5 Vol.-% zugegeben; die Suspension wurde dann unter Rühren auf 35°C erwärmt und bei dieser Temperatur 1 h intensiv gerührt. Anschließend wurde die Suspension mit 1 l Wasser verdünnt und dreimal mit 1 l Wasser dekantiert; die permeabilisierten Teilchen wurden auf die in den obigen Beispielen beschriebene Weise im Vakuum abgesaugt, nach dem Absaugen in 50 ml zuvor auf -25°C abgekühltem Aceton suspendiert und 3 min bei Raumtemperatur intensiv gerührt. Danach wurden die Teilchen erneut abgesaugt, auf der Fritte gründlich mit Wasser gewaschen, in 50 ml 0,05-M-Acetatpuffer mit pH 6,0 suspendiert und zur Quellung über Nacht bei +8°C stehengelassen.

Es wurden 14,2 g (Feuchtmasse) immobilisierte Zellen mit einer spezifischen Aktivität von 4,0 E/g (Feuchtmasse) gewonnen. Die Teilchengröße lag im Bereich von 75 bis 800 µm; bei makroskopischer Beurteilung bildeten die Teilchen graugelbe watteartige Gebilde mit schlecht benetzbarer Oberfläche. Die immobilisierten Zellen zeigten eine schlechte spontane Sedimentation, d. h. hielten sich im oberen Teil der Flüssigkeit im Auftrieb; sie konnten jedoch leicht filtriert und abgesaugt werden.

Beispiel 14

30 g (Feuchtmasse) frischer nativer Zellen von Bacterium cadaveris, die das Enzym L-Lysindecarboxylase mit einer spezifischen Aktivität von 16,4 E/g (Feuchtmasse) enthielten (1 Einheit E der Enzymaktivität entspricht derjenigen Enzymmenge, die 100 µl CO₂ bei 30°C und pH 5,5 aus L-Lysin freisetzt), wurden in 100-ml-Lösung eines reaktiven Polymers wie in Beispiel 2 zu einer homogenen Suspension suspendiert; danach wurde durch Tiefkühlung einschließlich Dekantation, Waschen und Absaugen wie in Beispiel 2 weiter verfahren.

Es wurden 24 g (Feuchtmasse) immobilisierte Zellen gewonnen.

Diese Menge der abgesaugten Teilchen wurde in 100 ml 1-M- NaCl-Lösung mit pH 6,5 suspendiert, die 0,1% Tensid enthielt; die Suspension wurde bei 37°C 1 h ununterbrochen gerührt.

Die weitere Behandlung der immobilisierten und permeabilisierten Zellen geschah wie in Beispiel 13.

Es wurden 19,1 g (Feuchtmasse) immobilisierte Zellen mit einer spezifischen Aktivität von 11,8 E/g (Feuchtmasse) mit einer Teilchengröße im Bereich von 180 bis 600 µm gewonnen; die Teilchen erschienen makroskopisch als amorphe, braune Partikel; die mikroskopische Untersuchung ergab Teilchen in Form begrenzter Plättchen; durch 3 min Stehenlassen wurde quantitative Sedimentation erzielt.

Beispiel 15

20 g (Feuchtmasse) einer Paste aus frischen nativen Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae, die das Enzym Invertase mit einer spezifischen Aktivität von 148 E/g (Feuchtmasse) (30°C, pH 4,75, Substrat Saccharose) enthielten, wurden in 100-ml-Lösung eines reaktiven Polymers wie in Beispiel 2 zu einer homogenen Suspension suspendiert; die weitere Immobilisierung mit Tiefkühlung einschließlich der weiteren Verfahrensschritte geschah wie in Beispiel 2. Die Behandlung der Zellen mit Aceton wurde wie in Beispiel 8 durchgeführt.

Es wurden 12,1 g (Feuchtmasse) immobilisierte Zellen mit einer spezifischen Aktivität von 90 E/g (Feuchtmasse) mit einer Teilchengröße im Bereich von 0,32 bis 2,0 mm gewonnen; die Teilchen bildeten makroskopisch hellbraune bis beige amorphe Partikel; die mikroskopische Untersuchung ergab unbegrenzte Formationen von Teilchen mit unregelmäßiger Morphologie und zerrissenen Rändern; durch 2 min Stehenlassen wurde quantitative Sedimentation erzielt.

Beispiel 16

1 l Nährboden, der submers kultiviert worden war und eine frische Kultur der Hefe Saccharomyces coreanus enthielt, wurde zentrifugiert relative Zentrifugalbeschleunigung 3000, 10 min); nach dem Abgießen des Überstands (Nährboden nach der Fermentation, der aufbewahrt worden war) wurden 28 g (Feuchtmasse) frische native Zellen gewonnen.

Diese Menge der frischen Hefen in Form der Zellpaste wurde in 100 ml einer Lösung eines reaktiven Polymers suspendiert, die gemäß Beispiel 2 hergestellt worden war; nach gründlicher Homogenisierung der Suspension durch intensives Rühren wurde das Reaktionsgemisch auf ein Laborschüttelgerät aufgesetzt und 1 h bei Raumtemperatur mit 50 Schwingungen/min geschüttelt. Danach wurde das Mischen eingestellt und die Suspension 3 h bei der angegebenen Temperatur in Ruhe belassen. Anschließend wurde der stark viskose, schwammige Brei aus den erzeugten Aggregaten in 500-ml-Polyethylenbehälter umgegossen und in der oben angegebenen Weise zentrifugiert; der Überstand wurde abgegossen und das Sediment in entmineralisiertem Wasser suspendiert und dreimal mit 250 ml Wasser unter mildem Rühren dekantiert. Nach der Dekantation und der quantitativen Sedimentation wurde das Material im Vakuum abgesaugt, mit etwa 100 ml Wasser gewaschen und gewogen (14 g).

Im Anschluß daran wurde das Material in 25 ml zuvor auf -25°C abgekühltem Aceton suspendiert und 2 min intensiv gerührt. Danach wurde das Material auf der Fritte scharf im Vakuum abgesaugt und gewogen (9 g). Die gewonnene feuchte Masse aus immobilisierten Zellen wurde in der oben angegebenen, zentrifugierten Überstandsflüssigkeit suspendiert (Nährboden für die Hefefermentation) und einige Stunden bei Raumtemperatur quellen gelassen.

Das Material wurde anschließend nochmals im Vakuum gut abgesaugt. 100 mg (Feuchtmasse) der Teilchen wurde in ein Warburggefäß eingewogen; danach wurden 2 ml zentrifugierte, klare Fermentationsflüssigkeit mit pH 4,6 zugegeben; in den Arm des Warburggefäßes wurden 0,5 ml 12,5%ige Saccharoselösung einpipettiert; in eines der Referenzgefäße wurden die nativen, nichtimmobilisierten Zellen (100 ml der nativen feuchten Paste) gegeben und mit 2 ml zentrifugierter Fermentationsflüssigkeit versetzt; in das zweite Referenzgefäß wurde der eigene Überstand (ohne Zellen) und in die Arme die Saccharoselösung zugegeben. Nach Einsetzen der Manometer wurde das Warburggefäß 15 min bei 30°C geschüttelt. Anschließend wurden die Manometer entlüftet; nach Übergießen der Saccharoselösung aus den Armen begann die eigentliche Messung der CO₂- Entwicklung.

Bei der ersten Kontrollmessung (nichtimmobilisierte separate native Zellen) wurden 3064 µl CO₂ entwickelt; bei der zweiten Kontrollmessung (Überstand ohne Zellen) trat keine CO₂- Entwicklung auf; bei der dritten Kontrollmessung (immobilisierte Zellen mit gleicher Konzentration an feuchter Masse wie bei der ersten Kontrollmessung) wurden 165 µl CO₂ bei einer Rate von 165 µl CO₂/h entwickelt, was etwa 5,4% der ursprünglichen (nichtimmobilisierten) gesamten metabolischen Zellaktivität entspricht.

Das Material der immobilisierten Hefezellen erschien bei der makroskopischen Beurteilung beige mit amorphen Teilchen; die mikroskopische Untersuchung ergab begrenzte Teilchen mit unregelmäßiger Form. Die Teilchengröße lag im Bereich von 300 bis 900 µm; 1 min Stehenlassen führte zur quantitativen Sedimentation.

Beispiel 17

35 g (Feuchtmasse) einer frischen Paste aus nativen Zellen von Bakterien Erwinia aridea, die das Enzym L-Asparaginamidohydrolase mit einer spezifischen Aktivität von 100 µmol L-Asparaginsäure/min · g (Feuchtmasse) (37°C, pH 5,0, Substrat L-Asparagin) enthielten, wurden in 100 ml einer Lösung eines reaktiven Polymers, die wie in Beispiel 7 hergestellt war, suspendiert. Anschließend wurde die Suspension durch intensives Rühren homogenisiert, 30 min wie in Beispiel 16 schwach gerührt und danach 1 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach dieser Zeit wurde die viskose, schwammartige Masse in 500-ml-Polyethylenbehälter umgegossen und bei 500 g 30 min zentrifugiert. Im Anschluß daran wurde der Überstand abgegossen und das Sediment mit einem Filtrationsdruck wie in Beispiel 7 beaufschlagt mit dem Unterschied, daß die Masse kurzfristig, etwa 5 min, zur Beseitigung des flüssigen Teils der Lösung des reaktiven Polymers auf einer hydraulischen Presse gepreßt wurde; das erhaltene brüchige Material wurde zerkleinert und durch einen Fleischwolf mit einem speziellen Stahleinsatz mit 1 mm großen Öffnungen gedreht, über die das Material in Form eines walzenförmigen Granulats herausgedrückt wurde, das dann etwa 3 h bei 25°C an Luft getrocknet, dann dreimal mit Wasser dekantiert und schließlich über Nacht in entmineralisiertem Wasser quellen gelassen wurde.

Insgesamt wurden 8 g granuliertes festes Material aus immobilisierten Zellen mit einer spezifischen Aktivität von 64 µmol L-Asparaginsäure/g (Feuchtmasse) und unregelmäßiger Größe der walzenförmigen Teilchen im Bereich von 1 bis 3 mm gewonnen. Das Material sedimentierte bereits während einiger Dutzend Sekunden quantitativ.

Beispiel 18

50 g (Feuchtmasse) einer Paste aus frischen nativen Zellen von Streptomyces phaechromogenes mit dem Enzym Glucoseisomerase mit einer spezifischen Aktivität von 0,21 µmol Fructose/min · g (Feuchtmasse) (60°C, pH 6,85, Substrat Glucose) wurden in 200 ml 0,1 M NaCl-Lösung mit pH 7,0 suspendiert; die Suspension wurde kurzfristig unter ununterbrochenem Rühren 10 min auf 70°C erwärmt. Anschließend wurde die Suspension abgekühlt und zentrifugiert relative Zentrifugalbeschleunigung (5000, 15 min). Danach wurde der Überstand abgegossen und das Sediment in 150 ml Lösung des reaktiven Polymers suspendiert, die wie in Beispiel 7 hergestellt war. Anschließend wurde zur Immobilisierung wie in Beispiel 17 einschließlich Zentrifugieren, kurzfristiger Pressung, Mahlen und Trocknung verfahren mit dem Unterschied, daß die entstandenen, nachgeformten Granuli aus immobilisierten Zellen mit 50 ml vorher auf -28°C abgekühlter 2%iger Klebstofflösung (Kanagon) in Aceton 3 min behandelt wurden. Anschließend wurden die Granuli scharf abgesaugt und auf der Fritte noch etwa 15 min weiter abgesaugt, danach mit etwa 1 l 0,05-M-Phosphatpuffer gewaschen, erneut abgesaugt, in 100 ml dieser Pufferlösung suspendiert und über Nacht bei +8°C stehengelassen.

Insgesamt wurden 20 g (Feuchtmasse) des granulierten festen Materials aus immobilisierten Zellen mit einer spezifischen Aktivität von 0,1 µmol Fructose/g (Feuchtmasse) mit Teilchen unregelmäßiger Größe im Bereich von 0,5 bis 3,0 mm gewonnen. Das Material sedimentierte nach einigen Dutzend Sekunden quantitativ.

Beispiel 19

45 g (Feuchtmasse) einer Paste aus frischen nativen Zellen von Aspergillus niger mit den Enzymen Glucoseoxidase und Katalase mit einer spezifischen Aktivität von 0,1 µmol H₂O₂/min · mg (Feuchtmasse) wurden in 150 ml einer wie in Beispiel 7 hergestellten Lösung des reaktiven Polymers eingebracht. Danach wurde zur Immobilisierung wie in Beispiel 7 verfahren mit dem Unterschied, daß die erhaltenen nachgeformten Granuli bei 40% relativer Feuchte (H₂SO₄) und Raumtemperatur 24 h trocknen gelassen wurden. Danach wurden die immobilisierten Zellen in entmineralisiertes Wasser eingebracht und 24 h bei +8°C quellen gelassen.

Insgesamt wurden 29 g (Feuchtmasse) immobilisierte Zellen mit einer spezifischen Aktivität von 0,045 µmol H₂O₂/ml (feucht) und unregelmäßiger Größe der Teilchen in Form von Walzen im Bereich von 0,5 bis 3,0 mm gewonnen. Das Material sedimentierte während einiger Dutzend Sekunden quantitativ.

Beispiel 20

20 g (Feuchtmasse) frische, gewaschene Pflanzenzellen von Solanum aviculare (Einzellenkultur), die in hypertonischem Milieu von Saccharose-Lösung Solanum-Alkaloide und Phytosterine synthetisieren, wurden in 100 ml einer wie in Beispiel 2 hergestellten Lösung eines reaktiven Polymers suspendiert; die nach intensivem Rühren erhaltene homogene Suspension wurde in eine Aluminiumschale mit einem Durchmesser von 15 cm umgegossen und 4 h bei -19°C in einer Tiefkühlbox gelagert. Danach wurde das gefrorene Reaktionsgemisch aus der Tiefkühlbox entnommen und mit etwa 50 ml 1-M-Phosphatpuffer mit pH 5,7 und 0,75 M KCl übergossen; nach 2 h Stehenlassen wurden die bei Raumtemperatur entstandenen Pflanzenzellaggregate in 1 l des obigen Puffers übertragen und einige Male mit diesem Puffer, jeweils nach qualitativer Sedimentation der Teilchen, dekantiert. Abschließend wurden die immobilisierten Zellen im Vakuum abgesaugt, auf der Fritte nochmals mit Pufferlösung gewaschen und erneut im Vakuum abgesaugt sowie gewogen (18 g).

Danach wurden die Teilchen in 100 ml einer 8%igen (M/V) sterilen wäßrigen Saccharose-Lösung eingebracht und die Suspension dreimal 24 h bei 20°C mit einem Magnetrührer gerührt, wobei in 24-h-Intervallen in der Saccharose-Lösung nach Abtrennen der Aggregate die extracelluläre Produktion von Solanum-Alkaloiden und Phytosterin durch HPLC-Chromatographie ermittelt wurde (vgl. Jirku et al., Biotechnol. Letters 3, Nr. 8 [1981] 447).

Dabei wurde festgestellt, daß in drei wiederholten 24 stündigen Intervallen die Produktion der obigen Komponenten bei gleichem Einsatz an immobilisierten Zellen erhalten bleibt. Die Teilchen wurden ferner rasterelektronenmikroskopisch untersucht, wobei die gegenseitige Bindung der Pflanzenzellen nachgewiesen wurde.

Beispiel 21

30 g (Feuchtmasse) frische, gewaschene Pflanzenzellen wie in Beispiel 20 wurden in 100 ml 0,05 M Phosphatpuffer mit pH 6,0 und 0,75 M KCl suspendiert. Zur homogenen Suspension der Zellen wurde unter Rühren ein Flockungsmittel (Sedipur KA) in einer Menge von 0,5 Vol.-% zugegeben. Nach Durchrühren wurde die Suspension 1 h bei Raumtemperatur ruhig stehengelassen, bis eine visuell feststellbare Ausflockung der Zellen vorlag. Anschließend wurde die Suspension vorsichtig, um die präformierten Zellaggregate nicht zu beschädigen, auf eine Fritte übergegossen und über Textilmaterial langsam aber gründlich im Vakuum abgesaugt. Nach Absaugen der überschüssigen Flüssigkeit wurde das Material ohne Waschen in 100 ml einer wie in Beispiel 10 hergestellten Lösung eines reaktiven Polymers eingebracht und die erhaltene Suspension durch vorsichtiges, langsames Rühren homogenisiert. Nach der Homogenisierung wurde die Suspension 1 h bei Raumtemperatur stehengelassen; die weitere Immobilisierung geschah wie in Beispiel 20 mit dem Unterschied, daß die Temperatur bei der Tiefkühlung -25°C betrug.

Nach 4 h Tiefkühlung wurde das Material aus der Tiefkühlbox entnommen und gemäß Beispiel 20 weiterverarbeitet mit dem Unterschied, daß die Auftauzeit bei Raumtemperatur 1 h betrug. Dabei wurden 20 g immobilisierte, gewaschene und gut abgesaugte Zellen gewonnen.

Im Anschluß daran wurden die Teilchen aus immobilisierten Zellen in das gleiche Medium wie in Beispiel 20 übertragen mit dem Unterschied, daß die Biosynthese der Solanum-Alkaloide und von Phytosterin unter Rezirkulation der Saccharose-Lösung in einem Fließbett des Biokatalysators 5 × 24 h durchgeführt wurde, wobei in 24-h-Intervallen in der Saccharose-Lösung die Produktion der Solanum-Alkaloide und von Phytosterin wie in Beispiel 20 ermittelt wurde.

Dabei wurde festgestellt, daß in fünf wiederholten 24-h- Intervallen die Produktion sowie der Produktionsrhythums der angegebenen Komponenten bei gleichem Einsatz an immobilisierten Zellen erhalten bleibt.

Beispiel 22

Es wurden zwei Lösungen von je 25 ml hergestellt, die 0,1% (M/V) Polylysin · HCl mit einer Molekülmasse von 40 000 bis 50 000 bzw. 1% (M/V) Polylysin mit einer Molekülmasse von 26 200 enthielten. Zur Auflösung des Polylysins mit der Molekülmasse von 40 000 bis 50 000 wurde destilliertes Wasser und zur Lösung des Polylysins mit der Molekülmasse 26 200 0,1 M Tris-Puffer mit pH 0,8 verwendet. In jede der beiden Polylysinlösungen wurde eine 25%ige Lösung von Glutaraldehyd in Wasser in der Weise zugegeben, daß ihre Konzentration im Reaktionsgemisch 0,3 Vol.-% im Fall des Polylysins mit der Molekülmasse von 40 000 bis 50 000 bzw. 0,5 Vol.-% im Fall des Polylysins mit der Molekülmasse 26 200 betrug.

Die Gefäße mit dem Reaktionsgemisch wurden dann auf eine Rotationsschüttelmaschine gebracht, mit der die Reaktionsgemische 10 h ununterbrochen bei 30°C gemischt wurden. Die Geschwindigkeit der Polymerisation bzw. der Bildung der gefärbten Schiff'schen Basen wurde wie in Beispiel 1 spektrophotometrisch verfolgt mit dem Unterschied, daß bei einer Wellenlänge von 430 nm gemessen wurde.

Nach der angegebenen Zeitdauer wurden in jede der Lösungen des reaktiven Polymers 6 g (Feuchtmasse) frische native Hefen Saccharomyces cerevisiae mit Invertaseaktivität und einer spezifischen Aktivität von 14 µmol Glucose/min · mg (Trockenmasse) der Zellen (30°C, pH 4,8, Substrat Saccharose) zu einer homogenen Suspension suspendiert. Die Suspensionen wurden 1 h auf einem Laborshaker gemischt und anschließend 2 h stehengelassen, worauf die Teilchen abzentrifugiert wurden relative Zentrifugalbeschleunigung (5000, 10 min); die Sedimente wurden getrennt in eine Injektionsspritze ohne Nadel eingebracht und die feste Paste in Walzenform auf eine Aluminiumfolie ausgepreßt. Die nicht gewaschenen nachgeformten Teilchen wurden bei Raumtemperatur 6 h trocknen gelassen und danach mechanisch zu Teilchen von ungefähr gleicher Größe homogenisiert und über Nacht in Wasser bei +5°C quellen gelassen. Die gequollenen Teilchen wurden dann im Vakuum foltriert, einige Male mit Wasser gewaschen, gründlich abgesaugt und gewogen.

Es wurden 5,6 g (Feuchtmasse) Teilchen mit einer spezifischen Aktivität von 276 µmol Glucose/min · g (Feuchtmasse) im ersten Fall bzw. 3,6 g (Feuchtmasse) Teilchen mit einer spezifischen Aktivität von 387,2 µmol Glucose/min · g (Feuchtmasse) im zweiten Fall gewonnen. Die Teilchen lagen in beiden Fällen in Form fester Walzen mit einem Durchmesser von 1,2 mm und einer Größe im gequollenen Zustand im Bereich von 1,45 bis 4 mm vor. Das Material sedimentierte während einiger Sekunden quantitativ.

5 g (Feuchtmasse) der immobilisierten Zellen mit der spezifischen Aktivität von 387,2 µmol Glucose/min · g wurden in 50 ml 0,5-M-Saccharose-Lösung in 0,05-M-Acetatpuffer mit pH 4,9 suspendiert, wobei unter ununterbrochenem Rühren mit einem langsam laufenden Ankerrührer bei einer Drehzahl von 100 U/min und einer Temperatur von 30°C die enzymatische Inversion der Saccharose zu einem Gemisch von Glucose und Fructose durchgeführt wurde. Die enzymatische Umwandlung war unter den angegebenen Reaktionsbedingungen in 3 h quantitativ. Dieser Vorgang wurde insgesamt zehnmal bei gleichem Einsatz an Biokatalysatoren wiederholt, wobei nach jedem beendeten Zyklus der wiederholten enzymatischen Inversion die Teilchen durch Seihen durch ein Polyamidsieb abgetrennt, mit dem angegebenen Puffer gewaschen und erneut in der angegebenen Art eingesetzt wurden. Der mittlere Grad der enzymatischen Inversion bei zehn Zyklen der wiederholten Verwendung des gleichen Ansatzes an immobilisierten Zellen betrug 92,6%.

Beispiel 23

Es wurden 50 ml einer 10%igen Lösung von technischem L-Lysin (Wirkstoffgehalt 88%) in 0,1-M-Tris-Puffer pH 8,2 hergestellt. In diese Lösung wurde eine 25%ige Lösung von Glutaraldehyd in Wasser in der Weise zugegeben, daß seine Konzentration im Reaktionsgemisch 5 Vol.-% betrug. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter den Bedingungen und in der Art von Beispiel 22 ununterbrochen gerührt, wobei die Reaktionsdauer jedoch 24 h betrug.

Nach dieser Zeit wurden in 50 ml der dunkelbraunen Lösung des reaktiven Polymers 12 g (Feuchtmasse) frische native Zellen des gleichen Mikroorganismus mit der gleichen enzymatischen Aktivität wie in Beispiel 22 suspendiert. Die Suspension wurde mit einem schnellaufenden Fibrationsmischer homogenisiert und dann in eine aus einer Aluminiumfolie hergestellte Schale gegossen und 24 h bei -20°C in einer Tiefkühlbox gelagert. Danach wurde die Schale aus der Tiefkühlbox herausgenommen und ihr Inhalt bei Raumtemperatur spontan auftauen gelassen. Anschließend wurde die stark viskose, schwammige Mischung zentrifugiert (relative Zentrifugalbeschleunigung) 10 000, 15 min; der Überstand wurde abgegossen und das Sediment in eine Injektionsspritze eingebracht und wie in Beispiel 22 weiterverarbeitet mit dem Unterschied, daß die Trocknung der nachgeformten Teilchen an Luft 10 h dauerte.

Nach Filtration, Waschen und Quellen des Materials wie in Beispiel 22 wurden 2,8 g (Feuchtmasse) Teilchen mit einer spezifischen Aktivität an Invertase von 180 µumol Glucose/min · g (Feuchtmasse) und einer Teilchengröße im Bereich von 1,2 bis 3,7 mm gewonnen. Das Material bestand nach dem Quellen aus schwammigen, halbweichen Walzen, die während einiger Sekunden quantitativ sedimentierten.

Claims (12)

1. Verfahren zur Herstellung von Biokatalysatoren durch Immobilisierung von enzymatisch aktivem Zellmaterial aus

• - ganzen, unbeschädigten nativen oder ggf. zuvor permeabilisierten Zellen oder Zellfragmenten und deren subcellulären Teilchen und/oder
• - Gemischen ganzer nativer Zellen mit ihren Zellfragmenten, subcellulären Teilchen und dem gesamten freigesetzten Zellinhalt und/oder
• - ganzen, individuell vernetzten und permeabilisierten Zellen,

Abtrennung der entstandenen Zellaggregate aus dem Reaktionsgemisch und
Waschen mit Wasser oder einer Pufferlösung
sowie ggf. weitere Permeabilisierung und/oder mechanische Verfestigung, gekennzeichnet durch Immobilisierung des enzymatisch aktiven Zellmaterials durch Inkontaktbringen mit einem wasserlöslichen, chemisch reaktiven Polymer, das durch Umsetzung einer wasserlöslichen Substanz mit mindestens zwei primären und/oder sekundären Aminogruppen im Molekül mit einem oder mehreren Dialdehyden bei 0 bis 60°C in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 4,0 bis 12,0 erhalten worden ist, bei -30 bis +50°C in einem wäßrigen Medium und bei einem pH-Wert von 5,0 bis 9,0.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Immobilisierung in Gegenwart eines handelsüblichen Flockungsmittels mit einem Gehalt einer Fraktion von Polyethylenimin, wie es zur Abwasserreinigung verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch Immobilisierung bei einer Temperatur von 0 bis 45°C, unter einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 1 bis 50 000 und einem Filtrationsdruck von 0 bis 50 000 kPa und/oder unter Stehenlassen oder langsamem Rühren oder ununterbrochenem Rühren.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch Immobilisierung mit einem aus Polyethylenimin, Hexamethylendiamin, Lysin und/oder Polylysin als wasserlöslicher Substanz hergestellten chemisch reaktiven Polymer.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch Immobilisierung mit einem mit Glutaraldehyd als Dialdehyd hergestellten chemisch reaktiven Polymer.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch Immobilisierung mit einem aus einem Polyethylenimin mit einer Molekülmasse von 100 000 bis 800 000 und Glutaraldehyd hergestellten chemisch reaktiven Polymer.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch Permeabilisierung des nativen Zellmaterials vor der Immobilisierung oder der nach der Immobilisierung erhaltenen Zellaggregate durch Rühren der entsprechenden Suspension der Zellen bzw. Zellaggregate in wäßrigem Medium bei einer Temperatur von 0 bis 70°C und einem pH-Wert von 4,0 bis 9,0 in Anwesenheit eines Tensids und/oder eines organischen, mit Wasser mischbaren und/oder nichtmischbaren Lösungsmittels.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch Permeabilisierung des nativen Zellmaterials vor der Immobilisierung oder der nach der Immobilisierung erhaltenen Zellaggregate unter gleichzeitiger oder anschließender Veränderung der Ionenstärke der Suspension durch Zugabe von Salzen starker Säuren und/oder Alkalien.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch weitere mechanische Verfestigung der Teilchen des immobilisierten Zellmaterials durch teilweise Dehydratation mit einem organischen Lösungsmittel.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch weitere mechanische Verfestigung der Teilchen des immobilisierten Zellmaterials mit Klebemittellösungen in organischen Lösungsmitteln oder deren Gemischen mit Wasser.

11. Biokatalysatoren, erhalten nach einem der Ansprüche 1 bis 10.