DE2127392C3

DE2127392C3 - Biochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrowellen proteinhaltigen Substanzen in Form von Hefezellen

Info

Publication number: DE2127392C3
Application number: DE2127392A
Authority: DE
Inventors: Yoshitugu Machida Tokio Harada; Tutomu Kawasaki Kanagawa Kudo; Taro Tokio Nagasawa; Joji Chiba Ono
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1970-07-03
Filing date: 1971-06-02
Publication date: 1978-03-02
Also published as: FR2100857B1; GB1312181A; FR2100857A1; NL155050B; NO135641B; DE2127392A1; CA982965A; DE2127392B2; FI48752B; BE767789A; NL7109065A; FI48752C; SE398513B; US3855063A; NO135641C

Description

Die Erfindung betrifft ein biochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen proteinhaltigen Substanzen in Form von Hefezellen, welche leichter extrahierbar sind und durch Mensch und Tier leichter verdaut werden können, wobei von einer fm Kohlenwasserstoff assimilierenden Hefe der Gattung Candida ausgegangen wird.

Hefezellen werden wegen ihres hohen Protein- und Nucleinsäuregehalts und erheblichen Anteils an Nährzusätzen, wie Vitaminen, für Nahrung, Futter und <>s Arzneimittel verwendet. Die Züchtung besonderer Hefestämme mit Anpassung an bestimmte Medien wurde lange Zeit versucht. Derartige Züchtungen wurden jedoch lediglich unter dem Gesichtspunkt einer möglichst wirtschaftlichen Herstellung von Hefezellen durch Steigerung der Wirksamkeit der Assimilation des Kohlenstoffs im Kulturmedium, einer hohen Zellausbeute, Vermehrungsrate usw. unternommen, jedoch wurde die Isolierung und Entwicklung von Stämmen ur.d Mutanten mit hohem Nährwert im Hinblick auf Verdaubarkeit und Verwendung für Nahrung oder Futter nicht durchgeführt

In der Tat haben Hefezellen um das Cytoplasma herum eine sehr feste Zellwand, deren Eigenart auf eine komplizierte im wesentlichen aus Polysacchariden, wie Mannan, Glucan usw., zusammengesetzte höhere Struktur zurückgeht (siehe D. H. Northcote, Biochemical Journal 51 [1952] 232 und P. A. Roe I fs e η, Siochimica et Biophysica Acta, 10 [1953] 477), wie aus Versuchen folgt, bei denen Hefezellen mit Polysaccharid hydroiysierenden Enzymen beispielsweise von der Schnecke oder irgendwelchen Mikroorganismen behandelt wurden, wobei das Gefüge der Zellwand aufgespalten wird bzw. zerfällt und in eine Protoplasmastruktur übergeht, bei der das Cytoplasma oder die Zellmembran freiliegen. (Siehe S. Sugawara, Nature. 212 [1966] 92; G. S. Kobayashi u.a. Journal of Bacteriology, 88 [1964] 795; R. E. Domanski, Journal of Bacteriology, % [1968] 270 und ). M ο η r e a I, journal of Bacteriology, 94 [1967] 241).

Wegen ihrer sehr geringen Verdaubarkeit bei Verabreichung an Mensch und Tier ist die Hefezelle im intakten Zustand jedoch als Nahrung oder Futter wenig wertvoll (siehe Journal of Japanese Society of Food and Nutrition 23, 62 von 1970), da sich im Verdauungssaft höherer Lebewesen kein Polysaccharid hydrolysierendes Enzym mit entsprechenden Fähigkeiten findet. Das ist der Hauptgrund für ein Zögern der Nahrungsmittel- und Futtermittelindustrie hinsichtlich der Anwendung von Hefezellen.

Es wurden bereits zahlreiche Anstrengungen unternommen, die Hefezellwand /u entfernen, um die Verdaubarkeit oder Extrahierbarkeit intrazellulärer Substanz der Hefezellen zu erhöhen. Zahlreiche Aufsätze und Patentanmeldungen belassen sich mit der Anwendung von Chemikalien oder biologischen Mitteln sowie einer mechanischen Zerstörung, wie mit Alkalioder Enzymbehandlungen, Autolyse, Plasmolyse, Schalleinwirkung, Homogenisierung usw. Diese Behandlungen und Mittel sind jedoch für die industrielle Anwendung hinsichtlich der Ausführung zu kompliziert und hinsichtlich der erforderlichen Ausrüstung zu teuer.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Hefezellen zu entwikkeln, die von Mensch und Tier leichter verdaut werden können und deren intrazelluläre Substanz besser isolierbar ist und die damit industriell besser ausnutzbar sind als herkömmliche Hefezellen.

Diese Hefezellen sollen für die industrielle Vermehrung und Züchtung geeignet und in Anbetracht einer guten Verdaubarkeit als Ausgangsmaterial für Nahrung und Futter für Mensch oder Tier anwendbar sein. Dabei ist ein besonderes Augenmerk auf eine wirksame und wirtschaftliche Herstellung unter milden Bedingungen in industriellem Maßstab gerichtet.

Diese Aufgabe wird nun durch ein biochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen proteinhaltigen Substanzen in Form von Hefezellen gelöst, die leichter extrahierbar sind und durch Mensch und Tier leichter verdaut werden können, wobei von einer Kohlenwasserstoff assimilierenden Hefe der Gattung

Candida ausgegangen wird. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Hefe durch chemische oder physikalische mutagene Mittel mutiert,

b) daß man eine die erhaltenen Mutanten enthaltende Suspension zur Bildung von Kolonien auf ein festes Kulturmedium überimpft,

c) daß man sodann entweder

Ci) von den in b) erhaltenen Kolonien Kolonien mit rauher Oberflächenschicht auswählt, daß man von den Zelien der Kolonien mit rauher Oberflächenschicht mit Hilfe eines lichtoptischen Mikroskops Zellen von Kugelform gewinnt, daß man aus den erhaltenen kugelförmigen Zellen nach Gram-Anfärbung gramnegative Zellen auswählt, daß man aus den erhaltenen gramnegativen Zellen Zellen mit praktisch vernachlässigbarem Mannan-Gehalt isoliert, oder

C_>) daß man die Zellen der in b) erhaltenen Kolonien einer Gram-Anfärbung unterwirft, daß man von den erhaltenen grampositiven Zellen auf elektronenmikroskopischem Wege solche auswählt, welche ein geringeres Elektronenstreuvermögen der äußeren Schicht der Zellwand besitzten, daß man von den erhaltenen grampositiven Zellen, welche ein geringeres Elektronenstreuvermögen der äußeren Schicht der Zellwand besitzen, solche Zellen isoliert, deren Mannan-Gehalt unter 7O¹Vb des Mannan-Gehaltes des unter gleichen Bedingungen gezüchteten Mutterstammes liegt,

d) daß man die nach C,) oder C_>) ausgewählten Mutanten in einem Kulturmedium aerob vermehrt und

e) daß man schließlich die vermehrte Zellmassc gewinnt.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu Hefezellen, die gut verdaubar sind, deren intrazelluläre Substanzen leicht isoliert werden können und die ihrer Zellwand-Integrität beraubt sind.

Der Grund für die Auswahl von Mutanten mit runder Form und weitere Isolierung eines gramnegativen Stamms beruht auf der Erwägung der Erfinder, daß eine ihrer Zellwand-Integrität beraubte Hefezelle die Kugelform annimmt, um ihre Oberfläche möglichst klein zu machen, da sie andernfalls den von außen wirkenden Druck nicht aushalten kann und auf der Feststellung, daß der Sitz der Fixierung der primären Anfärbung mit Kristall violett bei der Gram-Anfärbung die Zeilwand ist, was bedeutet, daß die Abgabe von an der Zellwandstruktur fixiertem Kristallviolett merklich verzögert ist, wenn angefärbte Zellen nach der Anfärbung mit einem organischen Lösungsmittel gespült werden (siehe Bacteriological Review, 16 [1952] 1, Stain Technology, 40 [1965] 79 und The Microbial World«, 2 Aufl., S. 169, Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs, N. J. USA).

Weiter kann eine Mutante mit veränderter Struktur der Zellwand, die ihrer Unangreifbarkeit partiell beraubt ist, auch bei Gram-positiver Färbung durch Beobachtung mit einem Elektronenmikroskop leicht erkannt werden. Die Zelle mit geringer »Elektronendichte« bzw. geringem Streuvermögen der äußeren Schicht der Zellwand bei elektronenmikroskopischer Beobachtung ist eine Zelle mit veränderter Wandstruktur, bei welcher der den Hauptbestandteil der Zellwand bildende Mannangehalt verringert und die Zellwand-Integrität teilweise verloren gegangen ist.

Das Grundprinzip der Erfindung besteht in der Entwicklung einer solchen Mutante, deren intrazelluläre Substanz wirksam ausgenutzt und leicht extrahiert werden kann unter Anwendung der oben beschriebenen Methode bei einer Kohlenwasserstoff assimilierenden Hefe der Genus Candida zur Erzielung einer Mutante, s die vollständig oder teilweise ihrer Zellwand-Integrität beraubt ist, sowie in der Züchtung solcher Mutanten und Ausnutzung der intrazellulären Bestandteile solcher Zellen.

Die erfindungsgemäßen Mutanten können in bzw. auf

ίο einem YM-Medium oder einem Sulfitpulpeablauge, Kohlenwasserstoff oder Abfallmelasse als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Kulturmedium gezüchtet werden, und die Abtrennung intrazellulärer Substanz aus den erhaltenen Zellen kann durch Behandlung mit

is chemischen oder physikalischen Mitteln, wie alkalische Behandlung oder Behandlung mit Schallwellen, erfolgen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren und Kurvenblätter näher erläutert. Auf diesen zeigt

ίο Fig. 1 mikroskopische Aufnahmen von gramangefärbten Zellen von M-7002, M-7005, M-7 und Candida albicans ATCC 10259,

Fig. 2 elektronenmikroskopische Aufnahmen von Zellen von M-7002, M-7OO7 und M-7,

i.s F i g. 3 die Verdauung von Zellprotein der Gruppen A und B sowie von Kontroll- und CA-Stämmen durch gastrisches Pepsin vom Rind als Funktion der Verdauungszeit und

F i g. 4 die Verdauung von Zellprotein der Gruppen A

»o und B sowie der Kontroll- und von CA-Sätmme durch proteolytisches Enzym, das vom Pankreas des GeIbschwanzfischs erhalten wurde, in Abhängigkeit von der Verdauungszeit.

Gemäß der Erfindung werden die Zellen von

is Kohlenwasserstoff assimilierender Hefe der Genus Candida zunächst chemischen oder physikalischen mutagenen Mitteln ausgesetzt. Als chemische mutagene Mittel können N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, salpetrige Säure, Acriflavin, 4-NitrochinoIin-N-oxid und

Äthylmethansulfonat angewandt werden. Als physikalische mutagene Mittel kommen Bestrahlung mit UV-Licht, Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder Bestrahlung mit ionisierenden Strahlen in Frage.
Das Verfahren zur Induzierung und Isolierung einer

-is Mutante gemäß der Erfindung kann an einem Beispiel wie folgt erläutert werden:

(1) Erzielung von Mutanten durch
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin

so Nach Lodder (J. Lodder und N. ). W. K reger-Va η Rij: »The Yeast« 2. Aufl., Seite 370, North-Holland Publishing Company, Amsterdamm, 1967) wurden Hefestämme der Genus Candida von japanischer Erde isoliert und Zellen von einem so

ss isolierten Candida-Stamm, dem Stamm M-7, wurden in YM-Medium von pH 6 (Zusammensetzung: 0,3% Malzextrakt; 0,3% Hefeextrakt; 0,5% Peptor und 1% Glucose) eingeimpft und bis zur exponentiellen Wachstumsphase inkubiert. Die Zellen wurden dann

(«) »geerntet« und erneut in YM-Medium auf eine Zelldichte von tO⁷/ml suspendiert. Nach 6 Stunden langer Behandlung der Zellsuspension mit N-Methyl-N'-ni'^ro-N-nitrosoguanidin in einer Konzentration von 40 μg/ml bei 30⁰C wurde sie mit sterilisierter Salzlösung

(>> auf das lOfache verdünnt. Die verdünnte Suspension wurde zur Bildung isolierter Kolonien auf YM-Agarplatten inkubiert, die durch Zusatz von 2% Agar zu dem oben angegebenen YM-Medium hergestellt worden

waren. Kolonien mit rauher Oberfläche wurden ausgewählt, die Zellen dieser Kolonien entnommen und mit einem optischen Mikroskop untersucht zur Isolierung von etwa 200 Stämmen mit kreisförmigen bzw. runden Zellen. Die einzelnen Stämme wurden *- gramangefärbt, und es wurden 3 gramnegative Stämme isoliert und mit Candida periphelosum M-7002, M-7OO3 und M-7004 bezeichnet.

Die restlichen Stämme wurden nach Behandlung der Zellen mit Glutaraldehyd nach dem herkömmlichen Verfahren mit Osmiumtetroxid fixiert oder gefärbt und mit Perimental fixiert (Cell Research, 20 [I960] 28), und sie wurden dann mit dem Elektronenmikroskop nach Moore (Journal of Biochemical Cytology 3 [1957] 225) untersucht. 1s

10 Stämme, deren Zellwände insbesondere in der äußeren Schicht eine geringe Elektronendichte bzw. ein geringes Streuvermögen besaßen, d. h. bei denen die Schwärzung der Fotoplatte gering war, wurden abgetrennt und jeweils einzeln 48 Stunden lang in dem oben angegebenen YM-Medium bei 37°C weiter vermehrt, und die Zellen wurden dann »geerntet« und nach Lyophilisierung wurden die darin enthaltenen Mengen an Mannan und Glucan nach W. E. Trevelyan (Biochemical Journal, 63 [1956] 23) 2s bestimmt.

Dabei wurden eine Mutante mit einem Mannangehalt unter 2 g pro 100 g trockene Zellen aufgefunden und 2 Stämme in Übereinstimmung mit diesem Kriterium isoliert und als Candida periphelosum M-7007 und y> M-7008 bezeichnet.

(2) Erzielung von Mutanten durch Bestrahlung
mit UV-Licht

Zellen von Candida lipolytica NRRL-Y-6795 wurden js aus der exponentiellen Wachstumsphase heraus gesammelt und in steriler Salzlösung mit einer Zelldichte von 10⁷prol ml suspendiert.

1 ml dieser Suspension wurde in eine Petrischale mit 9 cm Durchmesser gebracht und nach 3 Minuten langer Bestrahlung mit einer UV-Lampe von 15 Watt in einem Abstand von 30 cm mit steriler Salzlösung auf das lOOfache verdünnt.

Die verdünnte Suspension wurde auf der oben angegebenen YM-Agarplatte zur Bildung isolierter Kolonien inkubiert. Nach dem gleichen Verfahren wie unter (1) beschrieben wurden Kolonien mit rauher Oberfläche ausgewählt und davon weiter etwa 200 Stämme mit kreisförmigen bzw. runden Zellen, die sich als authentisch gramnegativ zeigten, isoliert. Die so einzelnen Stämme wurden nach dem oben angegebenen Verfahren von Trevelyan chemisch auf ihren Mannangehalt hin untersucht Ein Stamm mit praktisch vernachlässigbarem Mannangehalt wurde von diesen Stämmen isoliert und als Candida lipolytica M-7005 bezeichnet Dieses Verfahren der Auswahl von Stämmen mit Mannanmangel durch chemische Bestimmung ist im Falle der Isolierung von Mutanten von Candida lipolytica aus Sicherheitsgründen erforderlich, da deren Mutterstamm ursprünglich ein zwischen positiv und to negativ liegendes Verhalten hinsichtlich der Gram-Anfärbung zeigt, was die eindeutige Erkennung von brauchbaren Mutanten über gramnegatives Verhalten in Frage stellt Dieses (chemisch-analytische) Verfahren kann im Falle der Mutanten-Isolierung bei anderen Candida-Arten weggelassen werden, da diese authentisch grampositive Organismen sind.

Weiter wurde unter den verbliebenen Stämmen eine

Mutante mit vermindertem Mannangehalt von wenige als 70% des Mutterstamms durch das unter (1 beschriebene Verfahren aufgefunden.

Eine den oben angegebenen Kriterien entsprechend! Mutante wurde isoliert und mit Candida lipolytici M-7009 bezeichnet.

(3) Erzeugung von Mutanten durch
salpetrige Säure

Zellen von Candida guilliermondii IFO-1062, die irr oben beschriebenen VM-Medium bis zur exponentieller Wachstumsphase vermehrt worden waren, wurder gesammelt und in 0,1 m Acetatpuffer von pH 4,5 mi 0,05 m Natriumnitrit auf eine Zelldichte von 10' pro 1 m suspendiert.

Nach 40 Minuten Stehenlassen bei 30"C wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und nach derr Waschen in einer sterilisierten Lösung mit 1% Peptor und 5% NaCI (Gewicht pro Volumen mal 100 suspendiert und verdünnt.

Die verdünnte Suspension wurde auf YM-Agarplai ten zur Bildung ^on Kolonien inkubiert. Danach wurder nach dem gleichen Verfahren wie unter (1) beschrieben etwa 300 Stämme mit kreisförmigen Zellen von der Zellen mit rauher Oberfläche getrennt und ein Stamrr einer gramnegativen Mutante davon isoliert und mil Candida guilliermondii M-7006 bezeichnet.

(4) Gewinnung von Mutanten durch Acriflavin

Zellen von Candida guilliermondii IFO-1062 wurden in YM-Medium auf eine Zelldichte von 10' pro 1 ml suspendiert, die Suspension mit Acriflavin in einer Konzentration von 4 μg/ml versetzt und die Mischung 10 Stunden lang bei 30⁰C inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt und nach dem Waschen mit einer sterilen Salzlösung mit dem lOOfachen Volumen an Salzlösung verdünnt.

Die verdünnte Suspension wurde einer Koloniebildung auf YM-Agarplatten unterworfen. Nach dem gleichen Verfahren wie unter (1) beschrieben wurde einer der mutanten Stämme mit einem geringeren Mannangehalt als der Mutterstamm aufgefunden und mit Candida guilliermondii M-7010 bezeichnet.

Neun nach obigem Verfahren erhaltene Stämme von Hefemutanten der Genus Candida besitzen die Fähigkeit, normales Paraffin zu assimilieren; unter diesen haben die Stämme M-7002, M-7003, M-7004, M-7OO5 und M-7006 (die nachfolgend als Gruppe A bezeichnet werden) eine rauhe Kolonieoberfläche, kreisförmige bzw. runde Zellform und sind gramnegativ, während die Stämme M-7007, M-7008 und M-7010 (die nachfolgend als Gruppe B bezeichnet werden) ähnlich wie wilde Stämme hinsichtlich der Kolonieoberfläche glatt und grampositiv sind. Der Stamm M-7009 erweist sich hinsichtlich der Kolonieoberfläche ähnlich wie die Stämme M-7007, M-7008 und M-7010, er zeigt jedoch ein zwischen grampositiv und gramnegativ liegendes Verhalten.

Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Hefemutanten der Genus Candida sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Von diesen Stämmen sind die Stämme M-7002, M-7005, M-7006, M-7007 und M-7010 nachfolgend mit ihren entsprechenden ATCC-Registriernummern aufgeführt Von diesen Stämmen wurden Proben beim American Type Culture Collection in Washington, D.C. am 24. Februar 1971 hinterlegt

Name· dor Mikrooryanisnien

Λ T(C-Nummer

Candida pcriphclosiim M-7(X)2 20314

Candida lipolylica M-7OO5 20315

Candida guillicrmondii Μ-7(Χ)ίι 20316

Candida pcriphelosum M-7(X)7 20317

Candida guilliermondii M-7010 20¹UX

M-7OO2 als typisches Beispiel der obigen Gruppe A, M-7OO7 als typisches Beispiel für die Gruppe B und Candida albicans ATCC 10259 als typisches Beispiel für herkömmliche wilde Stämme wurden zur Erzielung isolierter Kolonien auf oben beschriebenen Y-Agarplalten 3 Tage lang bei 30°C inkubiert.

Es wurde gefunden, daß die Kolonieoberfläche von M-7002 rauh ist, während M-7OO7 und Candida albicans glatte Oberflächen zeigen.

Tabelle I Mikrobiologische liigenschallcn der Mutanten

Gruppe Λ
(M-7M2 bis
M-7(K)6)

Gruppe B

<M-7<X>7 bis
M-7010)

Assimilation von organischen
C-haltigcn Verbindungen

Gebrauch von Stickstoffverbindungen

Vitaminbedarf

Gram-Anlarbung

Zcllform

Zclldimcnsioncn

Kolonicobcrflächc

Wachslumstempcratur Protcingchalt

*) M-7IKW macht eine Ausnahme als Gram ±.

Andere Stämme der Gruppe A, andere Stämme der Gruppe B und andere herkömmliche wilde Stämme, zu denen Candida lipolytica, Candida guilliermondii und Candida utilis etc. gehören, waren hinsichtlich der Kolonieoberfläche ähnlich wie M-7002, M-7007 und Candida albicans.

Die Mutanten der Gruppe A unter diesen Gruppen der Genus Candida zeigen einen bemerkenswerten Unterschied gegenüber herkömmlichen wilden Stämmen, wie M-7 [Kontrolle (I)], Candida guilliermondii IFO 1062, einem authentischen Beispiel für Kohlenwasserstoff assimilierende Hefe [Kontrolle (U)] und Candida albicans ATCC 10259 [Kontrolle (IH)], der darin besteht, daß die Mutanten gramnegativ sind und kein Mannan enthalten.

Obgleich die Mutanten der Gruppe B einen geringeren Mannangehalt besitzen als die herkömmlichen wilden Stämme, sind sie trotzdem ähnlich wie die Kontrollstämme grampositiv. M-7009 fällt dabei aus dem Rahmen, indem er eine Zwischenstellung zwischen grampositiver und gramnegativer Anfärbung einnimmt.

Glucose	+	H
Galactose	+	Λ
Lactose	-	-
Maltose	+	Λ
Sucrose	+	Λ
Äthanol	+	Λ
n-1'arallln	+	Λ
l'cplon	+	Λ
Harnstoff	+	±
NII₄CI	+
KNO,	-	-
Biotin	+	+
Inosin	-	-
Nicotinsäure	-	-
Pantothensäure	-	-
Pyridoxin	-	-
Thiamin	-	-
p-Aminobcnzocsäurc	-	-
	negativ	positiv*)
	Kugel	Stäbchen
	5 bis 6 μ	3 μ
	rauh	glatt
	0 bis 37 C	0 bis 37 (
	59%	59%

Beweise für obige Schlußfolgerung werden nachfolgend angeführt: Die oben beschriebenen 12 Stämme

so und Candida lipolytica NRRL-6795 und Candida tropicalis IAM-4147 (diese beiden Stämme werden nachfolgend abgekürzt als CA-Stämme bezeichnet), d. h. insgesamt 14 Stämme wurden durch Schütleln in einem Kulturmedium von pH 6,8 folgender Zusammen- Setzung: 1% normales Paraffin mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen; 03% NH₄Cl; 0,7% KH₂PO₄; 0,02% FeSO₄-7 H₂O; 0,001% MnSO₃ · 7 H₂O; 0,01% CaCl₂ · 2 H₂O und 0,05% Hefeextrakt 48 Stunden lang bei30°Cinkubieru

fio Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und ein Teil derselben gramangefärbt und unter dem Mikroskop untersucht

Mikroskopische Aufnahmen (Vergrößerung: 2000fach) der Mutanten M-7002 und M-7005 als

f>5 typische Beispiele und der Kontrolle (I) und Kontrolle (IH) nach Gram-Anfärbung sind in Fig. 1 wiedergegeben. Violett gefärbte Zellen sind solche, an deren Zellwand das Kristallviolett nach primärer Anfärbung

809 609/1»

fixiert war; diese werden als gramposiliv bezeichnet, während grüngefärbte Zellen solche Zellen sind, bei denen das Kristallviolett nicht fixiert sondern durch Behandlung mit organischem Lösungsmittel eluiert wurde und die bei der zweiten Anfärbung mit Methylgrün reagierten; diese wurden als gramnegativ identifiziert.

Nach Fig. I ist es klar, daß M-7002 und M-7005 gramnegativ sind, während die Kontrollen (I) und (III) grampositiv sind. Das Verhalten von M-7OO3, M-7004 und M-7005 gegenüber der Gram-Anfärbung war mit demjenigen von M-7002 völlig identisch, und diese Mutanten wurden daher als gramnegativ klassifiziert. M-7007, M-7008 und M-7010 sprachen dagegen auf die Anfärbung auf gleiche Weise an wie der herkömmliche wilde Stamm und wurden daher als gramposiiiv definiert. M-7OO9 zeigte ein Zwischenverhalten zwischen grampositiv und gramnegativ.

Nachfolgend wurden Zellen der 9 Mutanten, 3 Kontrollstämme und 2 CA-Stämme gesammelt und nach Waschen lyophilisiert und auf ihren Mannan- und Clucangehalt nach der oben beschriebenen Methode von Trevelyan geprüft (Angabe in Prozent).

Daneben wurde auch der relative Mannangehalt der Mutanten bezogen auf einen Gehalt von 100% im Kontrollstamm berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die Mutanten M-7002, M-7003, M-7004, M-7005 und M-7006, d.h. Stämme der Gruppe A, bemerkenswerte Unterschiede gegenüber den Kontrollstämmen zeigen, indem sie gramnegativ sind und praktisch keinen Mannangehalt besitzen, während M-7007, M-7008 und M-7010, d. h. Stämme der Gruppe Ii, grampositiv wie die Konirollstämme sind, aber bezogen auf die Kontrollstämmme einen verminderten Mannangehalt von 71,4 bis 10,7% besitzen.

Candida lipolytica und M-7009 waren die einzigen Ausnahmen, die ein intermediäres Verhalten gegenüber der Gram-Anfärbung zeigten; der Mannangehalt der Mulante lag jedoch innerhalb des Bereiches der Gruppe B.

Nach den Untersuchungen der Erfinder waren die Mannangehaitc von 3 anderen herkömmlichen Stämmen, nämlich Candida parapsilosis, Candida intermedia und Candida robusta, die unter den oben angegebenen Bedingungen inkubiert wurden, relativ hoch (Wert: 3,0+0,2 g/100 g trockene Zellen).

Cinuii- l'ol\sacchahil-

Tabelle 2	Ciram- Polysaccharid-	trockene	Relativer
	Anlar- gehalt		Mannan
	hung (g/IOOg	Mannan	gchalt
	Zellen)	2,81
	Glucan	2,8
	+ 7,2	3,Ol
Kontrolle (I)	+ 7,0	0	(100)
Kontrolle (II)	+ 6,7	0
Kontrolle (III)	6,2	0	0
M-7002	6,6	0	0
M-7003	6,6	0	0
M-7004	6,3	0,3	0
M-7005	6,4	IJ	0
M-7006	+ 6,2	2,0	10,7
M-7007	+ 6,6		39,3
M-7008	+ 6,6	71,4
M-7009

	Anlar-	[ichalt .	trockene	Mannan
	Ιιιιημ	(μ/KK) μ		gehalt
		/eilen)	M.Hinan
		(ilucan	I,S
M-7010	t	6,4	2,1	ί)4,.ί
Candida	J_	⁽>,ι		7\2
lipoiyiiea
NRRL-6795			2,3
Candida	H-			X2,2
tropical is
ΙΛΜ-1147

Aus der Tabelle 2 ist ebenfalls ersichtlich, daß der auf die Kontrollstämme bezogene relative Mannangehalt der beiden CA-Stämme, der am Ende der Tubelle angegeben wird, bei 75,0 und 82,2% liegt, obwohl die CA-Stämme herkömmliche wilde Stämme sind. Diese Werte liegen in dem Bereich, der bei einigen Mutanten gemäß der Erfindung gefunden wird. Die experimentellen Ergebnisse, aus denen ersichtlich ist, daß diese CA-Stämme einen geringeren Mannangehalt als andere herkömmliche wilde Stämme haben, wurden von Nabeshimga u.a. (Journal of Technology 48 [1970] 556) angegeben. Bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung dieser CA-Stämme zeigt sich jedoch, daß ihre Zellwand ein hohes Streuvermögen besitzt und schwer angreifbar ist. Das heißt die günstigen Eigenschaften der Mutanten gemäß der Erfindung, wie sie nachfolgend angegeben werden, sind den CA-Stämmen nicht eigen.

Nachfolgend wurden Zellen von den Stämmen M-7002, M-7007 und M-7 als Vertreter für die Mutanten der oben beschriebenen Gruppen A und B sowie die Kontrollstämme nach dem unter (1) beschriebenen Verfahren el'iktronenmikroskopisch untersucht (Vergrößerung 20 OOOfach). Die Ergebnisse sind in F i g. 2 wiedergegeben.

Beim Kontrollstamm und dem Stamm M-7007 wird eine deutliche Zellwand im Umfangsbereich der Zelle beobachtet, während die Dicke des Zellwandbereichs beim Stamm M-7002 gering und das Elektronenstreuvermögen schwach ist. Daraus wird deutlich, daß der Stamm M-7002 seiner Zellwand-Integrität beraubt und im Vergleich zum Kontrollstamm etwa doppelte Zellbreite besitzt. Aus elektronenmikroskopischen Beobachtungen folgt ebenfalls, daß die Stämme M-7003, M-7004, M-7005 und M-7006 in ähnlicher Weise ihrer Zellwand-Integrität beraubt sind.

Wie bereits den obigen Ausführungen z.T. zu entnehmen ist, wurde aus den Tatsachen, daß der Sitz der primären Anfärbung durch Kristallviolett die Zellwand ist und M-7002, M-7003, M-7004, M-7005 und M-7006 gramnegativ sind und daß die Hauptkomponen te der Zeilwand Mannan ist und die Mutanten gemäß der Erfindung kein Mannan oder weniger als die natürlichen Stämme enthalten und daß M-7002, M-7003, M-7004, M-7005 und M-7006 bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung eine mangelhafte Zellwandstruktur zeigen, geschlossen, daß M-7C02, M-7003, M-7004, M-7005 und M-7006, d. h. die Mutanten der Gruppe A, ihrer Zellwand-Integrität beraubt sind, während M-7007, M-7008, M-7009 und M-7010, d. h. die Mutanten der Gruppe B, der Zellwand-Integrität nur partiell beraubt sind.

Aus der Tatsache, daß die Verdaiibarkeil und Ausnutzbarkeit der intrazellulären Substanzen der Hefezelle durch die (üblicherweise schwer angreifbare) Zellwand vermindert wird, kann wiederum geschlossen werden, daß die oben beschriebenen Mutanten gemäß der Erfindung sowohl hinsichtlich der Verdaubarkeit als auch der Ausnutzbarkeit von intrazellulärem Protein im Vergleich zu dem herkömmlichen Stamm deutlich ausgezeichnet sind.

Nachfolgend wurde die Verdaubarkeit und Extrahierbarkeit von Protein aus den Zellen bei den erfindungsgemäßen Mutanten untersucht. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:

Zunächst wurde das Zellprotein von 9 Stämmen der oben beschriebenen Mutanten der Genus Candida, 'J Koiurolisiäninien und 2 Ca-Siämmen auf seine Verdaubarkeit durch gastrisches Pepsin vom Rind und durch ein aus der Bauchspeicheldrüse des Gelbschwanzfisches präpariertes proteolytisches Enzym untersucht. Da/i wurden die 14 Hefestämme durch Schütteln in dem oben beschriebenen normal-Paraffinmediuni 48 Stunden lang bei JO⁰C inkubiert und die durch Vermehrung entsandenen Zellen durch Zentrifugieren gesammelt. Nach Waschen und Trocknen wurde die Zellmasse jeweils in Salzsäure von pH 1,8 auf 1% Zelldichte suspendiert. Zu den einzelnen Suspensionen wurden 0,5% (Gewicht pro Volumen) gastrisches Pepsin vom Rind (2x kristallisiert und lyophilisert; 153-1370-1) hinzugegeben und die Mischungen bei 37°C aufbewahrt.

Zu verschiedenen Zeiten (siehe Fig. 3) wurden Anteile der Reaktionsmischung abpipettiert, und nach Zentrifugieren wurde der Stickstoffgehalt in der überstehenden Flüssigkeit nach Kjeldahl bestimmt. Die Protein-Verdauungsgeschwindigkeil (obiger Stickstoffgehalt zum Gesamtstickstoff der Zellmasse vor der Verdauung; ausgedrückt in °/o) wurde ebenfalls bestimmt. Die Ergebnisse werden in F i g. 3 gezeigt.

In Fig. 3 ist längs der Ordinate die Verdauung des intrazellulären Proteins der Hefe durch gastrisches Pepsin vom Rind in % und längs der Abszisse die zugehörige Verdauungszeit in Stunden aufgetragen. Die erhaltenen Kurven A, B, CA und »Kontrolle« zeigen die mittleren Verdaubarkeiten der Mutanten der Gruppe A, der Mutanten der Gruppe 3, der CA-Stämme und der Kontrollstämme.

Wie F i g. 3 zeigt, ist die Verdaubarkeit der Mutanten der Gruppe A im Mittel etwa 2,7mal höher als die des bekannten wilden Stamms, wenn man die entsprechenden Werte 24 Stunden nach Beginn der Verdauung miteinander vergleicht und die mittlere Verdaubarkeit der Mutanten Jer Gruppe B ist etwa l,6mal höher als diejenige des herkömmlichen wilden Stamms.

Darüber hinaus nimmt die Verdauung der Mutanten gemäß der Erfindung sogar 20 Stunden nach Beginn der Verdauung noch zu, während diejenige des herkömmlichen Stamms 10 Stunden nach Beginn der Verdauung einen konstanten Wert erreicht. Die gemäß der Erfindung isolierten Hefemutanten erwiesen sich mithin als sehr leicht verdaubar.

Nachfolgend wurde die Verdaubarkeit der Mutantenzellen durch proteolytisches Enzym vom Fisch geprüft, um die Verdaubarkeit der erfindungsgemäßen Produkte für den Fall der Verwendung als Futter für Fischkulturen nachzuweisen. Dazu wurden die Zellen in 0,1 M Borat-Puffer (pH 8,0) auf 1 % Zelldichte suspendiert und die Suspension mit von der Bauchspeicheldrüse eines Gclbschwanzfisches nach dem Laskowski-Verfahren (»Methods of Enzymology«, Bd. II, Seite 8, 1. Aufl.; herausg. von S. P. Co Io wick und N. O. Kaplan, Academic Press Inc., New York, 1955) hergestelltem proteolytischen Enzym sowie 0,005 M CaC^ bis zu einur Konzentration von 0,5% (Gewicht pro Volumen) versetzt. Die Mischung wurde bei 37"C der Verdauung überlassen und die Verdai'barkeit nach dem gleichen Verfahren wie bei der Untersuchung mit gastrischem Pepsin vom Rind bestimmt. Die Ergebnisse sind in F i g. 4 wiedergegeben.

in Fig. 4 ist längs der Ordinate die Verdauung des Hefezellproteins durch proteolytisches Enzym von der Bauchspeicheldrüse eines Gelbschwanzfisches und längs der Abszisse die Verdauungszeit aufgetragen. Die Verdaubarkeit der Mutanten der Gruppe A, der Mutanten der Gruppe B, der Kontrollstämme und der CA-Stämme wird durch die Kurven A, B, Kontrolle und CA veranschaulicht. Wie man sieht, zeigen die Mutanten der Gruppen A und B eine 2,2 bzw. l,8mal höhere Verdaubarkeit als die Kontrollstämme bei der Verdauung durch Bauchspeicheldrüsenenzym voiv GcIbschwanzfisch. Das heißt die Verdaubarkeit der Mutanten gemäß der Erfindung und insbesondere der Mutanten der Gruppe A ist im Vergleich zu derjenigen der Kontrollstämme merklich verbessert.

Die CA-Stämme erweisen sich bei diesen Prüfungen hinsichtlich der Verdaubarkeil jeweils als den Kontrollstämmen vergleichbar. Obgleich also die CA-Stämme, wie Tabelle 2 zeigt, einen etwas geringeren Mannangehait als die Kontrollstämme haben, sind sie doch den Mutanten gemäß der Erfindung hinsichtlich der Verdaubarkeit des Zellproteins merklich unterlegen. Diese CA-Stämme wurden keiner mutationsinduzierenden Behandlung gemäß der Erfindung unterworfen und zeigten ein hohes Streuvermögen der peripheren Bereiche der Zelle bei Beobachtung im Elektronenmikroskop.

Danach kann angenommen werden, daß die geringe Angreifbarkeit der Zellwand bei diesen CA-Stämmen nicht verlorengegangen ist. Bei den Mutanten gemäß der Erfindung ist dagegen abweichend von den Kontroll- und CA-Stämmen das Zellprotein in leicht verdaubarem Zustand, da diese Mutanten gernäß der Erfindung nicht nur keinen oder einen verminderten Mannangehalt besitzen, sonderen ihr Cytoplasma oder ihre Zellmembran dem umgebenden Medium direkt ausgesetzt ist, während die Zellwand-Integrität vollständig oder teilweise verlorengegangen ist.

Anschließend wurde die Extrahierbarkeit der intrazellulären Substanzen dieser Mutanten, der Kontrollstämme und der CA-Stämme durch chemische Reagenzien oder physikalische Mittel bestimmt, um Vorrichtungen zur Extraktion und Isolierung intrazellulärer Substanz festlegen zu können.

^5:1 Tabelle 3	to	Prolein aus den Zellen	durch
Extraktion von			Schalloszil-
Hefestämme			lationcn
fts M-7002	% extrahiertes Protein	79,3
M-7003	durch	72,5
M-7004	Alkali	69,9
M-7005	lösung	73.2
	49,5
51,2
50,0
49.5

I^-OrI sut/unu

llcl'cstiimmc

In extrahiertes Protein

durch
Alkalilös ling

durch

Schallos/il-

hilioncn

M-7006	49,9	75,2
M-7007	49 5	69,3
M-7008	3j,2	60,0
M-7009	28.6	45,5
M-7010	34,0	52,2
Kontrolle (I)	23,6	22,6
Kontrolle (11)	25,2	27,2
Kontrolle (III)	24,8	25,4
Candida lipolylica	25,6	29,3
NRRL-6795
Candida lropicalis	23,5	25,9
ΙΛΜ-4147

In gleicher Weise wie für die Untersuchungen gemäß F i g. 3 und 4 wurden 9 Stämme der oben beschriebenen Mutanten, 3 Kontrollstämme und 2 CA-Stämme in normal-Paraffinmedium gezüchtet bzw. vermehrt. Die Zellen wurden dann gesammelt und in 0,05 n-Natronlauge auf 1% Zelldichte suspendiert und 2 Stunden lang auf 50⁰C erwärmt; nach dem Zentrifugieren wurde der Stickstoffgehalt im überstehenden Anteil nach K j e 1 d a h 1 bestimmt und die F.xtraktionsrate (%) über das Verhältnis der durch Natronlauge extrahierten Stickstoffmengen zum Gesamtstickstoff der Zelle vor der Behandlung berechnet. Die Ergebnisse sind in Spalte 2 der Tabelle 3 wiedergegeben.

Zellen der oben beschriebenen 3 Gruppen wurden weiter in einer sterilisierten Salzlösung auf 5% Zelldichte suspendiert und es wurden dann 5 ml Portionen dieser Suspensionen mit einem 1OkHz (10 KC) Schall-Disintegrator 5 Minuten lang behandelt bzw. zerrissen und anschließend zentrifugiert, wonach der Stickstoffgehalt in der überstehenden Fraktion bestimmt wurde. Die Extraktionsrate (%) wurde in gleicher Weise wie oben angegeben berechnet. Die Ergebnisse sind in Spalte 3 der Tabelle 3 wiedergegeben.

Aus Tabelle 3 ist klar ersichtlich, daß die gemäß der Erfindung erzielten Mutanten im Vergleich zu den Kontrollstämmen eine merklich höhere Proteinextraktionsrate sowohl bei Verwendung von Alkalilösung als auch bei Schalleinwirkung aufweisen und daß die Proteinextraktionsrate ähnlich wie bei der Verdaubarkeitsprüfung mit Enzymen in Abhängigkeit von der Abnahme des Mannangehalts zunimmt. Die CA-Stämme bleiben dagegen trotz ihres geringeren Mannangehalts hinsichtlich der Proteinextraktionsrate in ähnlichen Bereichen wie die herkömmlichen Stimme.

Wie anhand der zu F i g. 3 und 4 führenden Untersuchungen bereits beschrieben wurde, ist es ebenfalls klar, daß die gemäß der Erfindung erhaltenen Mutanten nicht nur durch einen mangelnden Mannangehalt hervorstechen, sondern auch durch genetisch fehlerhafte Zellwandstrukturen, was im Vergleich zu den Kontroll· und CA-Stämmen zu einer bemerkenswerten Verbesserung der Proteinextraktion durch Alkalibehandlung oder Schalleinwirkung führt.

Darüber hinaus sind die Mutanten gemäß der Erfindung den herkömmlichen wilden Stämmen hinsichtlich der Extrahierbarkeit intrazellulärer Substanzen

bei Harnstoffbehandlung, Autolyse, mechanischem Mahlvorgang oder Gefrier- und Auftaubehandlungen überlegen.

Aus der Tatsache, daß die Stämme M-7002, M-7OO3. M-7OO4, M-7005 und M-7006 unter den erfindungsgemäß isolierten Hefemutanten der Genus Candida gramnegativ sind, während sich alle herkömmlichen Hefestämme unabhängig von Wachstumsbedingungen und Wachstumsphase als grampositiv erweisen (unter der berechtigten Annahme, daß die Gram-Anfärbu'·.^ ein Mittel zur Unterscheidung der Beschaffenheit von Zellwänden ist), sowie aus der elektronenmikroskopischen Beobachtung und den experimentellen Ergebnissen bei der Prüfung der Verdaubarkeit durch Enzyme und aus der hohen Proteinextraktionsrate kann geschlossen werden, daß sich diese erfindungsgemäßen Hefemutanten der Genus Candida von herkömmlichen Arten in positiver Weise unterscheiden und durch mangelnde Zellwand-Integrität auszeichnen, wobei Cytoplasma oder Zellmembran frei liegen.

Von den 4 übrigen Mutanten sind die Stämme M-7007, M-7008 und M-7010 ähnlich wie die herkömmlichen Hefestämme bei Inkubation unter gleichen Bedingungen grampositiv, und der Stamm M-7009 nimmt eine Zwische..stellung zwischen grampositiv und gramnegativ ein, jedoch ist ihr Mannangehalt im Vergleich zu den Kontrollstämmen der Genus Candida auf 70—10% vermindert. Aus der Tatsache, daß die Werte von Proteinverdauungs- oder Extraktionsratc bei diesen Mutanten in einem mittleren Bereich zwischen derjenigen der ihrer Zellwand-Integrität beraubten Mutanten und derjenigen der Kontrollstämme liegen, kann geschlossen werden, daß diese 4 Mutanten ihrer Zellwand-Integrität partiell beraubt sind.

Unter den herkömmlichen Hefestämmen der Genus Candida haben die CA-Stämme, Candida lipolytica und Candida tropicalis einen etwas geringeren Mannangchalt als die Kontrollstämme, und Candida lipolytica nimmt eine Zwischenstcllung zwischen grampositiv und gramnegativ ein. Diese CA-Stämme haben jedoch eine bemerkenswert geringere Proteinverdaubarkeit und -extrahierbarkeit als die Mutanten gemäß der Erfindung und unterscheiden sich mithin recht deutlich von diesen.

Die wie oben beschrieben isolierten Hefemutanten der Genus Candida gemäß der Erfindung sind mithin Mutanten, die der Zellwand-Integrität beraubt, gramnegativ und praktisch mannanfrei oder aber grampositiv sind und einen partiell verringerten Mannangchalt besitzen und im Gegensatz zu den üblichen bekannten wilden Hefestämmen durch abbauendes Enzym gut verdaubar sind und deren intrazelluläres Protein durch unterschiedliche Behandlungen sehr leicht extrahiert werden kann.

Bei Verwendung von Hefezellen für menschliche Nahrung und Futter für Haustiere oder Fische bilden die Hefemutanten der Genus Candida gemäß der Erfindung mithin sehr gut verdaubare Produkte, und es ist damit möglich, Nährmittel von hohem Nährwert und nährende Medikamente zu erzeugen. Im Falle einer industriellen Isolierung und Abtrennung intrazellulärer Substanzen von der Hefe können daher die Kosten für die Anlage und die Betriebskosten vermindert werden wenn Hefemutanten gemäß der Erfindung zum Einsat7 kommen, und es kann weiter ein Abbau und eine Denaturierung des Produktes weitgehend gehemmi werden, da die Isolierung und Abtrennung det intrazellulären Substanzen und Autolyse unter milder Bedingungen durchgeführt werden kann. Auch irr

Hinblick auf die Extraktion und Ausnutzung biologisch wirksamer Substanzen, wie Enzyme, kann das erfindungsgemäße Verfahren im Vergleich zu den üblichen Methoden mit bemerkenswertem Vorteil angewandt werden.

Beispiel 1

201 Kulturmedium (pH 53) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung: 1% normal Paraffin mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen; 0,5% NH₄CI; 0.7% KH₂PO₄; 0,001 % FeSO₄ · 7 H₂O; 0,02% MgSO₄ - 7 H₂O; 0,001 % MnSO₄ ■ 7 H₂O; 0,01% CaCI₂ 2 H₂O und 0,05% Hefeextrakt wurden sterilisiert. Nach Einimpfen der Mutante M-7OO2 ( = ATCC 20314) wurde die Mischung 24 Stunden lang unter Belüftung bei 30° C inkubiert Danach wurde dieses Kulturmedium zu 5001 sterilisiertem Kulturmedium der oben beschriebenen Art hinzugegeben mit weiterer 48stündiger Inkubation bei 30° C unter Belüftung und Einstellung des pH-Wertes. Danach wurden die Zellen mit einem Zentrifugiertrockner gesammelt und 23 kg trockene Hefezellen von hoher Verdaubarkeit erzielt 2 kg der trockenen Zellmasse wurden abgenommen und mit 12 kg Weizenmehl versetzt Nach dem Durchkneten wurde die Mischung mit 6 kg weißem Fischmehl gemischt zur Erzielung von Fischfutter.

Beispiel 2

201 Kulturmedium (pH 6,0) mit 5% (als Kohlehydratkonzentration) Gärmelasse, 0,25% (NH₄J₂SO₄; 03% KH₂PO₄; 0,02% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,04% Hefeextrakt (gewichtsmäßige Zusammensetzung) wurden nach dem Aufkochen nitriert und sterilisiert. Danach wurde die Mutante M -7005 (= ATCC 20315) eingeimpft und 24 Stunden lang bei 30° C präinkubiert Diese Mischung wurde dann zu 5001 des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugegeben, und es folgte eine Inkubation unter Belüftung, die 36 Stunden bei 30° C und 12 Stunden bei 40° C durchgeführt wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser in einem Trommeltrockner getrocknet zur Erzielung von 3 kg trockener Hefezellen.

Eine 2 kg Portion wurde davon entnommen und mit 20 kg 0,1 n-NaOH versetzt und nach 2 Stunden langem Stehenlassen bei 50⁰C zentrifugiert Die überstehende Fraktion wurde zur Ausfällung von Protein mit HCI versetzt wobei der pH-Wert auf 4,8 eingestellt wurde. Das ausgefällte Protein wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und mit einem kleinen Sprühtrockner getrocknet zur Erzielung von 500 g trockenem Zellprotein. 50 kg Wasser und 1 kg Glucose wurden zu den 500 g Protein hinzugegeben. Die Mischung wurde mit Lactobacillus acidophilus geimpft und 30 Stunden lang bei 37° C zur Bildung von Milchsäure vergoren. Abschließend wurden Zucker und Geschmacksstoffe in geeigneter Menge hinzugegeben und ein schmackhaftes und nährendes hochproteinhaltiges Getränk erhalten.

Beispiel 3

Die Mutante M-7006 (-ATCC 20316) wurde in 201 Kulturmedium (pH 6,0) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung: 4% (als Kohlehydratkonzentration) von Sulfit befreiter Sulfitpülpeliquor; 0,2% (NH₄J₂SO₄; 0,1% KH₂PO₄; 0,25% MgSO₄ 7 H₂O und 0,3% Hefeextrakt eingeimpft Nach 48stündiger Inkubation bei 30° C wurde die Flüssigkeit zu 5001 des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugefügt und unter Belüftung 48 Stunden lang bei 30⁰C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser in einem Trommeltrockner getrocknet zur Erzielung von 23 kg trockener Hefezel-S len, die dann mit einem Mahlwerk pulverisiert wurden zur Erzielung eines Nährmedikaments mit hohem Protein- und Vitamingehalt sowie guter Verdaubarkeit

Beispiel 4

ίο 201 Kulturmedium (pH 6,0) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung: 1% normal Paraffin mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen; 03% NH₄Cl; 0,7% KH₂PO₄; 0,001% FeSO₄ · 7 H₂O; 0,02% MgSO₄ · 7 H₂O; O₁OTl % MnSO₄ -7 H₂O; 0.01% CaQ₂ · 2 H₂O und 0,05% Hefeextrakt wurden sterilisiert Diese Flüssigkeit wurde mit der Mutante M-7010 («ATCC 20318) geimpft und 24 Stunden lang unter Belüftung bei 30°C inkubiert Anschließend wurde die Mischung zu 5001 des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugege ben, und es folgte eine weitere 48stQndige Inkubation bei 30°C unter Belüftung, wobei der pH-Wert kontrolliert wurde. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser bei 50° C getrocknet zur Erzielung von 2,8 kg trockener Hefezellen hoher Verdaubarkeit 1 kg wurde davon entnommen und mit 3 kg Getreide-Schrotmehl; 43 kg Reiskleie; 1 kg Sojamehl; 50 g Salz und 50 g Calciumcarbonat gemischt zur Erzielung einer Futtermischung für Rindvieh.

Beispiel 5

201 Kulturmedium (pH 6,0) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung: 5% (als Kohlehydratkonzentration) Gärmelassen; 0,25% (NH₄J₂SO₄; 03% KH₂PO₄; 0,02% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,04% Hefeextrakt wurden nach Aufkochen filtriert und sterilisiert. Die Mutante M-7OO7 (-ATCC 20317) wurde darin eingeimpft und unter Belüftung 24 Stunden lang bei 30° C inkubiert Die erhaltene Mischung wurde zu 5001 des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugegeben, und es folgte eine Inkubation unter Belüftung bei 30° C (36 Stunden) und dann bei 40⁰C (12 Stunden). Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser in einem Trommeltrockner getrocknet zur Erzielung von 3 kg trockner Hefezellen.

2 kg wurden davon entnommen und mit 20 kg 0,1 n-NaOH versetzt und 2 Stunden lang bei 50° C stehengelassen und dann zentrifugiert Die überstehen de Flüssigkeit wurde zur Ausfällung von Protein mit

1 n-HCl versetzt, wobei der pH-Wert auf 4,8 eingestellt wurde; das Protein wurde .dann durch Zentrifugieren abgetrennt und mit einem kleinen Sprühtrockner getrocknet zur Erzielung von 500 g trockenem intrazel lulärem Hefeprotein.

50 kg Wasser und 1 kg Glucose wurden zu den 500 g Protein hinzugefügt Die Flüssigkeit wurde durch 30 Stunden langes Inkubieren mit Lactobacillus acidophilus bei 37° C einer Milchsäuregärung unterworfen und dann mit Zucker und Geschmacksstoffen versetzt zur Erzielung eines schmackhaften nährenden proteinreichen Getränks.

Beispiel 6

1 kg der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Hefezellen wurden mit 5 kg Weizenmehl, 40 g Salz, 20 g Honig und

2 kg Wasser und weiter mit 3,5 kg Gluten, 300 g eßbarem öl und Geschmacksstoffen versetzt. Die

Mischung wurde in einem Ofen 30 Minuten lang bei 120° C gebacken zur Erzielung einer knusprigen Imbiß-Diät mit einer abgeglichenen Aminosäurezusammensetzung.

Beispiel 7

4 kg nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellte trockene Hefezellen wurden zu 20 kg 0^n-NaOH hinzugegeben, 2 Stunden lang bei 50° C stehengelassen und dann zur Abtrennung der intrazellu-

lären Substanzen enthaltenden überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert Zwei kg CaCl₂ · 2 H₂O und 0,2 kg Ca(OH)₂ wurden in 15 kg Wasser von 90° C suspendiert und dann mit der obigen übersiehenden Flüssigkeit unter Rühren versetzt Nach 30 Minuten Stehenlassen wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann in Wasser suspendiert und der pH-Wert mit 6 n-HCl auf etwa 7 eingesteUt Der Niederschlag wurde zentrifugiert zur Erzielung eines flockenähnlichen und fleischähnlich texturierten Nahrungsmittels.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Biochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrowellen proteinhaltigen Substanzen in Form von Hefezellen, welche leichter extrahierbar sind und durch Mensch und Tier leichter verdaut werden können, ausgehend von einer Kohlenwasserstoff assimilierenden Hefe der Gattung Candida, dadurch gekennzeichne t, daß man

a) die Hefe durch chemische oder physikalische mutagene Mittel mutiert,

b) daß man eine die erhaltenen Mutanten enthaltende Suspension zur Bildung von Kolonien auf ein festes Kulturmedium überimpft, ι s

c) daß man sodann entweder

Ci) von den in b) erhaltenen Kolonien, Kolonien mit rauher Oberflächenschicht auswählt, daß man von den Zellen der Kolonien mit rauher Oberflächenschicht mit Hilfe eines lichtopti- m sehen Mikroskops Zellen von Kugelform gewinnt, daß man aus den erhaltenen kugelförmigen Zellen nach Gram-Anfärbung gramnegative Zellen auswählt, daß man aus den erhaltenen gramnegativen Zellen Zellen mit praktisch vernachlässigbarem Mannan-Gehalt isoliert, oder

C;) daß man die Zellen der in b) erhaltenen Kolonien einer Gram-Anfärbung unterwirft, daß man von den erhaltenen grampositiven Zellen auf elektronenmikroskopischem Wege solche auswählt, welche ein geringeres Elektronenstreuvermögen der äußeren Schicht der Zellwand besitzen, daß man von den erhaltenen grampositiven Zellen, welche ein geringeres .»5 Elektronenstreuvermögen der äußeren Schicht der Zellwand besitzen, solche Zellen isoliert, deren Mannan-Gehalt unter 70% des Mannan-Gehaltes des unter gleichen Bedingungen gezüchteten Mutterstammes liegt, 4c

d) daß man die nach Ci) oder C>) ausgewählten Mutanten in einem Kulturmedium aerob vermehrt und

e) daß man schließlich die vermehrte Zellmasse gewinnt.

2. Verwendung der nach Anspruch 1 erhaltenen mikrobiellen proteinhaltigen Substanzen in Form von Hefezellen bei der Herstellung von Fischkulturfutter, von proteinreichem Getränk, von Nährmedikamenten, von Tierfutter, von Nähr-lmbiß und von fleischähnlichen Nahrungsmitteln.