DE2127392B2

DE2127392B2 - Biochemisches verfahren zur herstellung von mikrobiellen proteinhaltigen substanzen in form von hefezellen

Info

Publication number: DE2127392B2
Application number: DE19712127392
Authority: DE
Inventors: Taro Tokio Ono Joji Chiba Kudo Tutomu Kawasaki Kanagawa Harada Yoshitugu Machida Tokio Nagasawa, (Japan)
Original assignee: Monnaga Milk Industry Co Ltd, Tokio
Priority date: 1970-07-03
Filing date: 1971-06-02
Publication date: 1977-07-14
Also published as: NO135641C; US3855063A; DE2127392C3; SE398513B; NL155050B; DE2127392A1; FI48752C; NL7109065A; NO135641B; FR2100857B1; GB1312181A; CA982965A; FR2100857A1; BE767789A; FI48752B

Description

Die Erfindung betrifft ein biochemisches Verfahren ir Herstellung von mikrobiellen proteinhaltigen jbstanzen in Form von Hefezellen, welche leichter (trahierbar sind und durch Mensch und Tier leichter :rdaut werden können, wobei von einer ohlenwasserstoff assimilierenden Hefe der Gattung andida ausgegangen wird.

Hefezellen werden wegen ihres hohen Protein- und ucleinsäuregehalts und erheblichen Anteils an Nährjsätzen, wie Vitaminen, für Nahrung, Futter und rzneimittel verwendet. Die Züchtung besonderer efestämme mit Anpassung an bestimmte Medien urde lange Zeit versucht. Derartige Züchtungen wurden jedoch lediglich unter dem Gesichtspunkt einer möglichst wirtschaftlichen Herstellung von Hefezellen durch Steigerung der Wirksamkeit der Assimilation des Kohlenstoffs im Kulturmedium, einer hohen Zellausbeu te, Vermehrungsrate usw. unternommen, jedoch wurde die Isolierung und Entwicklung von Stämmen und Mutanten mit hohem Nährwert im Hinblick auf Verdaubarkeit und Verwendung für Nahrung oder Futter nicht durchgeführt.

In der Tat haben Hefezellen um das Cytoplasma herum eine sehr feste Zellwand, deren Eigenart auf eine komplizierte im wesentlichen aus Polysacchariden, wie Mannan, Glucan usw., zusammengesetzte höhere Struktur zurückgeht {siehe D. H. Northcote, Biochemical Journal 51 [1952] 232 und P. A. Rod f- sen, Biochimica et Biophysica Acta, 10 [1953] 477), wie aus Versuchen folg!, bei denen Hefezellen mit Polysaccharid hydrolysierenden Enzymen beispielsweise von der Schnecke oder irgendwelchen Mikroorganismen behandelt wurden, wobei das Gefüge der Zellwand aufgespalten wird bzw. zerfällt und in eine Protoplasma struktur übergeht, bei der das Cytoplasma oder diu Zellmembran freiliegen. (Siehe S. Sugawara, Nature, 212 [1966] 92; G. S. Kobayashi u.a. lournul of Bacteriology,88[1964]795; R. E. Domanski, Journal of Bacteriology, 96 [1968] 270 und J. M ο η r e a I. Journal of Bacteriology. 94 [ i 967] 241).

Wegen ihrer sehr geringen Verdaubarkeit bei Verabreichung an Mensch und Tier ist die Hefezelle im intakten Zustand jedoch als Nahrung oder Futter wenig wertvoll (siehe Journal of Japanese Society of Food and Nutrition 23, 62 von 1970), da sich im Verdauungssaft höherer Lebewesen kein Polysaccharid hydrolysierendes Enzym mit entsprechenden Fähigkeiten findet. Das ist der Hauptgrund für ein Zögern der Nahrungsmittel- und Futtermittelindustrie hinsichtlich der Anwendung von Hefezellen.

Es wurden bereits zahlreiche Anstrengungen unternommen, die Hefezellwand zu entfernen, um die Verdaubarkeit oder Extrahierbarkeit intrazellulärer Substanz der Hefezellen zu erhöhen. Zahlreiche Aufsätze und Patentanmeldungen befassen sich mit der Anwendung von Chemikalien oder biologischen Mitteln sowie einer mechanischen Zerstörung, wie mit Alkali- oder Enzymbehandlungen. Autolyse. Plasmolyse, Schalleinwirkung, Homogenisierung usw. Diese Behandlungen und Mittel sind jedoch für die industrielle Anwendung hinsichtlich der Ausführung zu kompliziert und hinsichtlich der erforderlichen Ausrüstung zu teuer.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Hefezellen zu entwikkeln, die von Mensch und Tier leichter verdaut werden können und deren intrazelluläre Substanz besser isolierbar ist und die damit industriell besser ausnutzbar sind als herkömmliche Hefezellen.

Diese Hefezellen sollen für die industrielle Vermehrung und Züchtung geeignet und in Anbetracht einer guten Verdaubarkeit als Ausgangsmaterial für Nahrung und Futter für Mensch oder Tier anwendbar sein. Dabei ist ein besonderes Augenmerk auf eine wirksame und wirtschaftliche Herstellung unter milden Bedingungen in industriellem Maßstab gerichtet.

Diese Aufgabe wird nun durch ein oiochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen proteinhaltigen Substanzen in Form von Hefezellen gelöst, die leichter extrahierbar sind und durch Mensch und Tier leichter verdaut werden können, wobei von einer Kohlenwasserstoff assimilierenden Hefe der Gattung

Candida ausgegangen wird. Dieses Verfahren ist ladurch gekennzeichnet, daß man

a) die Hefe durch chemische oder physikalische mutagene Mittel mutiert,

b) daß man eine die erhaltenen Mutanten enthaltende Suspension zur Bildung von Kolonien auf ein festes Kulturmedium überiimpft.

c) daß man sodann entweder

Ci) von den in b) erhaltenen Kolonien Kolonien mit rauher Oberflächenschicht auswählt, daß man von den Zellen der Kolonien mit rauher Oberflächenschicht mit Hilfe eines lichtoptischen Mikroskops Zellen von Kugelform gewinnt, daß man aus den erhaltenen kugelförmigen Zellen nach Gram-Anfärbung gramnegative Zellen auswählt, daß man aus den erhaltenen gramnegativen Zellen Zellen mit praktisch vernachlässigbarem Mannan-Gehalt isoliert, oder

Cj) daß man die Zellen der in b) erhaltenen Kolonien einer Gram-Anfärbung unterwirft, daß man von den erhaltenen grampositiven Zellen auf elektronenmikroskopischem Wege solche auswählt, welche ein geringeres Elektronenstreuvermögen der äußeren Schicht der Zellwand besitzten, daß man von den erhaltenen grampositiven Zellen, welche ein geringeres Elektronenstreuvermögen der äußeren Schicht der Zellwand besitzen, solche Zellen isoliert, deren Mannan-Gehalt unter 70% des Mannan-Gehaites des unici gleichen Bedingungen gezüchteten Mutterstammes liegt,

d) daß man die nach Ci) oder C₂) ausgewählten Mutanten in einem Kulturmedium aerob vermehrt und

e) daß man schließlich die vermehrte Zellmasse gewinnt.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu Hefe/.ellen, die gut verdaubar sind, deren intrazelluläre Substanzen leicht isoliert werden können und die ihrer Zellwand-Integrität beraubt sind

Der Grund für die Auswahl von Mutanten mit runder Form und weitere Isolierung eines gramnegativen Stamms beruht auf der Erwägung der Erfinder, daß eine ihrer Zellwand-Integrität beruhte Hefezelle die Kugelform annimmt, um ihre Oberfläche möglichst klein zu machen, da sie andernfalls den von außen wirkenden Druck nicht aushalten kann und auf der Feststellung, daß der Sitz der Fixierung der primären Anfärbung mit Kristallviolett bei der Gram-Anfärbung die Zeüwand ist, was bedeutet, daß die Abgabe von an der Zellwandstruktur fixiertem Kristallviolett merklich verzögert ist, wenn angefärbte Zellen nach der Anfärbung mit einem organischen Lösungsmittel gespült werden (siehe Bacteriological Review, 16 [1952] 1, Stain Technology, 40 [1965] 79 und The Microbial World«, 2 Aufl., S. 169, Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs, N. J. I 'SA).

Weiter kann eine Mutante mit veränderter Struktur der Zellwand, die ihrer Unangreifbarkeit partiell beraubt ist, auch bei Gram-positiver Färbung durch Beobachtung mit einem Elektronenmikroskop leicht erkannt werden. Die Zelle mit geringer »Elektronendichte« bzw. geringem Streuvermögen der äußeren Schicht der Zellwand bei elektronenmikroskopischer Beobachtung ist eine Zelle mit veränderter Wandstruk tür, bei welcher der den Hauptbestandteil der Zeilwand bildende Mannangehalt verringert und die Zel!wand-Integrität teilweise verloren gegangen ist.

Das Grundprinzip der Erfindung besteht in der Entwicklung einer solchen Mutante. deren intrazelluläre

Substanz wirksam ausgenutzt und leicht extrahiert werden kann unter Anwendung der oben beschriebenen Methode bei einer Kohlenwasserstoff assimilierenden Hefe der Genus Candida zur Erzielung einer Mutante, die vollständig oder teilweise ihrer Zellwand-Integrität beraubt ist, sowie in der Züchtung solcher Mutanten und Ausnutzung der intrazellulären Bestandteile solcher Zellen.

Die erfindungsgemäßen Mutanten können in bzw. auf einem YM-Medium oder einem Sulfitpulpeablauge, Kohlenwasserstoff oder Abfallmelasse als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Kulturmedium gezüchtet werden, und die Abtrennung intrazellulärer Substanz aus den erhaltenen Zellen kann durch Behandlung mit chemischen oder physikalischen Mitteln, wie alkalische Behandlung oder Behandlung mit Schallwellen, erfolgen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren und Kurvenblätter näher erläutert. Auf diesen zeigt

Fig. 1 mikroskopische Aufnahmen von gramangefärbten Zellen von M-7OO2, M-7OO5, M-7 und Candida albicans ATCC 10259,

Fig. 2 eleKtronenmikroskopische Aufnahmen von Zellen von M-7OO2, M-7OO7 und M-7,

F i g. 3 die Verdauung von Zellprotein der Gruppen A und B sowie von Kontroll- und CA-Stämmen durch gastrisches Pepsin vom Rind als Funktion der Verdauungszeit und

F i g. 4 die Verdauung von Zellprotein der Gruppen A und B sowie der Kontroll- und von CA-Sätmme durch proteolytisches Enzym, das vom Pankreas des GeIbschwanzfischs erhalten wurde, in Abhängigkeit von der Verdauungszeit.

Gemäß der Erfindung werden die Zellen von Kohlenwasserstoff assimilierender Hefe der Genus Candida zunächst chemischen oder physikalischen mutagenen Mitteln ausgesetzt. Als chemische mutagene Mittel können N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, salpetrige Säure, Acriflavin, 4-Nitrochinolin-N-oxid und Äthylmethansulfonat angewandt werden. Als physikalische mutagene Mittel kommen Bestrahlung mit UV-Licht, Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder Bestrahlung mit ionisierenden Strahlen in Frage.

Das Verfahren zur Induzierung und Isolierung einer Mutante gemäß der Erfindung kann an einem Beispiel wie folgt erläutert werden:

(1) Erzielung von Mutanten durch
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin

Nach Lodder (J. Lodder und N. ]. W. Kreger-Van Rij: »The Yeast« 2. Aufl., Seite 370. North-Holland Publishing Company, Amsterdamm, 1967) wurden Hefestämme der Genus Candida von japanischer Erde isoliert und Zellen von einem so isolierten Candida-Stamm, dem Stamm M-7, wurden in YM-Medium von pH 6 (Zusammensetzung: 0,3% Malzextrakt; 0,3% Hefeextrakt; 0,5% Pepton und 1% Glucose) eingeimpft und bis zur exponenticllen Wachstumsphase inkubiert. Die Zellen wurden dann »geerntet« und erneut in YM-Medium auf eine Zelldichte von lOVml suspendiert. Nach 6 Stunden langer Behandlung der Zellsuspension mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in einer Konzentration von 40 ng/ml bei 30⁰C wurde sie mit sterilisierter Salzlösung auf das 1Ofache verdünnt. Die verdünnte Suspension wurde zur Bildung isolierter Kolonien auf YM-Agarplatten inkubiert, die durch Zusatz von 2% Agar zu dem oben angegebenen YM-Medium hergestellt worden

waren. Kolonien mil rauher Oberfläche wurden ausgewählt, die Zellen dieser Kolonien entnommen und mit einem optischen Mikroskop untersucht zur Isolierung von etwa 200 Stämmen mit kreisförmigen bzw. runden Zellen. Die einzelnen Stämme wurden gramangcfärbl. und es wurden 3 gramnegative Stämme isoliert und mit Candida pcriphelosum M7002, M-7OO3 und M-7004 bezeichnet.

Die restlichen Stämme wurden nach Behandlung der Zellen mit Glutaraldehyd nach dem herkömmlichen Verfahren mit Osmiumletroxid fixiert oder gefärbt und mit Pcrimcntal fixiert (Cell Research, 20 [I960] 28), und sie wurden dann mit dem Elektronenmikroskop nach Moore (journal of Biochemical Cytology 3 [1957] 225) untersucht.

10 Stämme, deren Zellwände insbesondere in der äußeren Schicht eine geringe Elcktroncndichlc bzw. ein geringes Streuvermögen besaßen, d. h. bei denen die Schwärzung der Fotoplatte gering war, wurden abgetrennt und jeweils einzeln 48 Stunden lang in dem oben angegebenen YM-Mcdium bei 37' C weiter vermehrt, und die Zellen wurden dann »geerntet« und nach l.yophilisicrung wurden die dann enthaltenen Mengen an Mannan und Glucan nach VV. Iv Trevelyan (Biochemical lournal, b3 [195b] 23) bestimmt.

Dabei wurden eine Mulante mit einem Mannangehall unter 2 g pro 100 g trockene Zellen aufgefunden und 2 Stämme in Übereinstimmung mil diesem Kriterium isoliert und als Candida periphelostim M-7007 und M-7008 bezeichnet.

(2) !-!melting von Mutanten durch Bestrahlung
mit UV-Licht

/eilen von Candida lipolytica NRKLY 6795 wurden aus der exponentiellen Wachstumsphase heraus gesammelt und in steriler Salzlösung mit einer /elldiehte von 10' pro 1 ml suspendiert.

I ml dieser Suspension wurde in eine Petrischale mit 9 cm Durchmesser gebracht und nach J Minuten langer Bestrahlung mit einer UV-l.ampc von 15 Walt in einem Abstand von 30 cm mit steriler Salzlösung auf das lOOfache verdünnt.

Die verdünnte Suspension wurde auf der oben angegebenen YM-Agarplal(e zur Bildung isolierter Kolonien inkubiert. Nach dem gleichen Verfahren wie unter (I) beschriebet) wurden Kolonien mit rauher Oberfläche ausgewählt und davon weiter eiwa 200 Stumme mit kreisförmigen bzw. runden Zellen, die sich ah uulhentisch gramnegativ zeigten, isoliert Die einzelnen Stamme wurden nach dem oben ungegebenen Verfahren von Trevelyan chemisch auf ihren Mannangehalt hin untersucht. Ein Stamm mit praktisch vcrnachlassigbarcm Mannangchalt wurde vnn diesen Stämmen isoliert und als Candida lipolytica M-7005 bezeichnet. Dieses Verfahren der Auswahl von Stämmen mit Mnnnnnmangcl durch chemische Bestimmung ist im Falte der Isolierung von Mutanten von Candida lipolytica aus Sicherheitsgründen erforderlich, da deren Muitcrsiamm ursprünglich ein zwischen positiv und negativ liegendes Verhalten hinsichtlich der Grum-Anfärbung zeigt, was die eindeutige Erkennung von brauchbaren Mutanten über gramnegatives Verhalten in Präge stellt. Dieses (chemisch-analytische) Verfahren kann im Falle der Mutanten-Isolierung bei linderen Candida-Artcn weggelassen werden, da diese uuthcn· tisch grampositive Organismen sind.

Weiter wurde unter den verbliebenen Stämmen eine

Mutante mit vermindertem Mannangehalt von weniger als 70% des Mutterstamms durch das unter (1) beschriebene Verfahren aufgefunden.

Eine den oben angegebenen Kriterien entsprechende ■> Mutante wurde isoliert und mit Candida lipolytica M-7OO9 bezeichnet.

(J) !Urzeugung von Mutanten durch
salpetrige Säure

i" Zellen von Candida guilliermondii IIO-10b2, die im oben beschriebenen YM-Mcdium bis zur exponentiellen Wachstumsphasc vermehrt worden waren, wurden gesammelt und in 0,1 m Acetatpuffer von pll 4,5 mit 0,05 m Natriumnilrit auf eine Zelldichte von 10'" pro 1 ml

in suspendiert.

Nach 40 Minuten Stehenlassen bei 30"C wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und nach dem Waschen in einer sterilisierten Lösung mit 1% Pepton und 5% NaCi (Gewicht pro Volumen mal 100)

■'(■ suspendiert und verdünnt.

Die verdünnte Suspension wurde auf YM-Agaiplatten zur Bildung von Kolonien inkubiert. Danach wurden nach dem gleichen Verfahren wie unter (1) beschrieben, etwa 300 Stämme mit kreisförmigen Zellen von den

-■■> Zellen mit rauher Oberfläche getrennt und ein Stamm einer gramnegativen Mutantc davon isoliert und mn Candida guilliermondii M700b bezeichnet.

(4) Gewinnung von Mutanten durch Acriflavin

Zellen von Candida guilliermondii II"C>-1062 wurden in YM Medium auf eine Zelldichte von 10' pro I ml suspendiert, die Suspension mit Acriflavin in einer

^ Konzentralion von 4 ng/ml versetzt und die Mischung 10 Stunden lang bei 30"C inkubiert. Die Zellen wiiri.|i.-n gesammelt und nach dem Waschen mit einer sterilen Salzlösung mit dem lOOfachen Volumen an Salzlösung verdünnt

•I' Die verdünnte Suspension wurde einer Kolonichil· dung auf YM-Agarplatteii unterworfen. Nach dem gleichen Verfahren wie unter (I) beschrieben wurde einer der mutanten Stamme mit einem geringeren Mannangehall aK der Mutterstamm aufgefunden und

ι · mit Candida guilliermondii M-7010 bezeichnet.

Neun nach obigem Verfahren erhaltene Stumme von llefemtitanien der Genus Candida besitzen die lähig keil, normales Paraffin zu assimilieren; unter diesen haben die Stamme M-7OO2. M-700J, M 7004, M-7OO5

su und M 7006 (die nachfolgend als Gruppe Λ bezeichnet werden) cmc rauhe Kolonieoberflächc. kreisförmige bzw. runde Zellform und sind gramnegativ, während die Stamme M-7OO7, M-7008 und M-7010 (die nachfolgend als Gruppe B bezeichnet werden) ähnlich wie wilde

<< Stämme hinsichtlich der Kolonicobcrflächc glatt und grampositiv sind. Der Stamm M-7009 erweist sich hinsichtlich dc^r Kolonicobcrflächc ähnlich wie die Stämme M 7007, M-7008 und M-7010, er zeigt jedoch ein zwischen grampositiv und gramnegativ liegendes

<>o Verholten.

Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Hefemu· tanicn der Genus Candida sind in Tabelle t wiedergegeben. Von diesen Stämmen sind die Stämme M-7002, M7005, M 7006. M7007 und M-7010 nachfolgend mit

<«, ihren entsprechenden ATCC-Registriernummern aufgeführt. Von diesen Stämmen wurden Proben beim American Type Culture Collection in Washington, DC. am 24. Februar 1971 hintcrlisgt.

Name der Mikroorganismen

Candida pcriphclosuni M-7002

Candida lipolytica M-7005

Candida guillicrmondii M-7006

Candida pcriphclosum M-7007

Candida guillicrmondii M-7010

Λ. TC. C-

Nummcr

20314
20315
20316
20317
20318

M-7002 als typisches Beispiel der obigen Gruppe A, M-7OO7 als typisches Beispiel für die Gruppe B und Candida albicans ATCC 10259 als typisches Beispiel für herkömmliche wilde Stämme wurden zur Erzielung isolierter Kolonien auf oben beschriebenen Y-Agarplatten 3 Tage lang bei 30°C inkubiert.

Es wurde gefunden, daß die Kolonieoberfläche von M-7002 rauh ist, während M-7OO7 und Candida albicans glatte Oberflächen zeigen.

Tabelle 1

Mikrobiologische liigcnschaflen der Mutanien

	Glucose	(jruppe Λ	Gruppe B
	Galactose	(M-7002 bis	(M-7007 his
	Lactose	M-7006)	M-7010)
Assimilation von organischen	Maltose	+	+
C-haltigcn Verbindungen	Sucrose	+	+
	Äthanol	-	-
	n-l'aral'fin	+	+
	l'epton	+	+
	Harnstoff	+	+
	NII₄Cl		+
Gebrauch von Stickstoff	KNO,	+	+
verbindungen	Biotin		+
	Inosin	-f	-t-
	Nicotinsäure		-
Vitaminbedarf	Pantothensäure	+	+
	Pyridoxin	-	-
	Thiamin	-	-
	p-Aminoben/oesiiure	-
		-
		-	-
		-
Gram-Anfärbung		negativ	positiv*)
Z el I Io rin		Kugel	Stäbchen
Zclldimensionen		5 bis (> μ	3 μ
Kolonieoberfläehe	als (irain '.	rauh	glatt
WaehsUimstemperaUir	0 bis 37 (	0 bis 3? C
I'roteingehalt	5^l)%	5^l)"„
') M-71XW macht ι·ίικ· Ausnahme

Andere Stumme der Gruppe A, andere Stumme der Gruppe B und andere herkömmliche wilde Stamme, zu denen Candida lipolytica, Candida guillicrmondii und Candida utilis etc. gehören, waren hinsichtlich der Kolonicoberflächc Ähnlich wie M-7002. M-7007 und Candida albicans.

Die Mutanten der Gruppe A unter diesen Gruppen der Genus Candida zeigen einen bemerkenswerten Unterschied gegenüber herkömmlichen wilden Stammen, wie M-7 [Kontrolle (I)], Candida guillicrmondii IFO 1062. einem authentischen Beispiel fur Kohlenwasserstoff assimilierende Hefe [Kontrolle (H)] und Candida albicans ATCC 10259 [Kontrolle (III)], der darin besteht, dal) die Mutanten gramnegativ sind und kein Mannen enthalten.

Obgleich die Mutanten der Gruppe B einen geringeren Mannangchalt besitzen als die herkömmh chen wilden Stamme, sind sie trotzdem ähnlich wie die Kontrollstämmc grampositiv. M-7009 fallt dabei aus dem Rahmen, indem er eine Zwischenstellung zwischen grampositiver und gramnegativer Anfärbung einnimmt.

Beweise für obige Schlußfolgerung weiden nachfolgend angeführt: Die oben beschriebenen 12 Stumme

<o und Candida lipolytica NRRL-6793 und Candida tropiculis IAM-4147 (diese beidisn Stumme werden nachfolgend abgekürzt als CA-iitämmc bezeichnet), d. h. insgesamt 14 Stamme wurden durch Schütteln in einem Kulturmedium von pH 6,8 folgender Zusummen·

«.«, Setzung: 1% normales Paraffin mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen; 0.5% NH₄CI; 0.7% KH₂PO₄; 0.02% FeSO₄ 7 H;O; 0.001% MnSOj · 711,0; 0.01% CuCIi 2 H,O und 0.05% Hefeextrakt 48 Stunden lang bei 30° C inkubiert.

do Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und ein Teil derselben gramungefärbt und unter dem Mikroskop untersucht.

Mikroskopische Aufnahmen (Vergrößerung: 2000fach) der Mutanten M-7002 und M-7005 als

(K typische Beispiele und der Kontrolle (I) und Kontrolle (III) nach Grom-Anfarbung sind in Fig. I wiedergegeben. Violett geffirbte Zellen sind solche, an deren Zellwand das Krlstallviolctt nach primärer Anfärbung

709 628/481

ίο

fixiert war; diese werden als grampositiv bezeichnet, wahrend grüngefärbte Zellen solche Zellen sind, bei denen das Kristallviolett nicht fixiert sondern durch Behandlung mit organischem Lösungsmittel eluiert wurde und die bei der zweiten Anfärbung mit Methylgrün reagierten; diese wurden als gramnegativ identifiziert.

Nach Fig. 1 ist es klar, daß M-7OO2 und M-7OO5 gramnegativ sind, während die Kontrollen (1) und (111) grampositiv sind. Das Verhalten von M-7003, M-7004 und M-7005 gegenüber der Gram-Anfärbung war mit demjenigen von M-7002 völlig identisch, und diese Mutanten wurden daher als gramnegativ klassifiziert. M-7OO7, M-7008 und M-7010 sprachen dagegen auf die Anfärbung auf gleiche Weise an wie der herkömmliche wilde Stamm und wurden daher als grampositiv definiert. M-7009 zeigte ein Zwischenverhalten zwischen grampositiv und gramnegativ.

Nachfolgend wurden Zellen der 9 Mutanten, 3 Kontrollstämme und 2 CA-Stämme gesammelt und nach Waschen lyophilisiert und auf ihren Mannan- und Clucangehalt nach der oben beschriebenen Methode von Trevelyan geprüft (Angabe in Prozent).

Daneben wurde auch der relative Mannangehalt der Mutanten bezogen auf einen Gehalt von 100% im Kontrollstamm berechnet. Die Ergebnisse sir.J in Tabelle 2 wiedergegeben. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die Mutanten M-7002. M-7003, M-7004, M-7005 und M-7006, d.h. Stämme der Gruppe A, bemerkenswerte Unterschiede gegenüber den Kontrollstämmen zeigen, indem sie gramnegativ sind und praktisch keinen Mannangehalt besitzen, wahrend M-7OO7, M-7008 und M-7010, d. h. Stämme der Gruppe B, grampositiv wie die Konirollslämme sind, aber bezogen auf die Kontrollstiimmme einen verminderten Mannangehalt von 71,4 bis 10.7% besitzen.

Candida lipolytica und M-7009 waren die ein/igen Ausnahmen, die ein intermediäres Verhalten gegenüber der Gram-Anfärbung zeigten; der Mannangehalt der Mutante lug jedoch innerhalb des Bereiches der Gruppe

Nach den Untersuchungen der Erfinder waren die Mannangehalte von 3 anderen herkömmlichen Sum inen, nämlich Candida parapsilosis, Candida intermedia und Candida robiisia, die unter den oben angegebenen Bedingungen inkubiert wurden, relativ hoch (Wert: 3,0 ±0,2 g/100 g trockene Zellen).

Tabelle 1	Gram-	Polysacchurid·	trockene	Relutivcr
	Anfiir-	ge hull		M Ii η nun·
	bung	(g/100 g	Mnnnun	gehalt
		Zellen)	2.8 1
		Glucan	2.8
	+	7.2	3,0 J
Kontrolle (I)	+	7.0	0	(100)
Kontrolle (II)	+	6.7	0
Kontrolle (Ul)		6.2	0	0
M-7002	_	6,6	0	0
M-7003	-	6,6	0	0
M-7004	-	6.3	0.3	0
M-7005		6,4	1,1	0
M-7006	+	6.2	2.0	10.7
M-7OO7	+	6,6		39.3
M-7008	+	6,6	71.4
M-7009

	Ciram-	rolxsaccharul-	trockene	Kel.iliser
	Anlar-	goliall		Mann.iii-
	ηιιημ	Ig/ KXI μ	M; inn. in	μοίι.ιΐι
		/dien)	l.s
		(iIiic.iη	2.1
M-7010	f	0.4		(vU
Candida	t-			75,2
lipolvtica
NRRL-67U5
Candida				82.2
tropicalis
ΙΛΜ-4Ι47

Aus der Tabelle 2 ist ebenfalls ersichtlich, dall der aiii die Kontrollstämme bezogene relative Mannangehall der beiden CA-Siämme, der am finde der Tabelk angegeben wird, bei 75,0 und 82,2% liegt, obwohl du CA-Stämme herkömmliche wilde Stämme sind. Diese Werte liegen in dem Bereich, der bei einigen Mutanter gemäß der Erfindung gefunden wird. Die experimentellen Ergebnisse, aus denen ersichtlich ist. daß diese CA-Stämme einen geringeren Mannangchalt .ils ander«, herkömmliche wilde Stämme haben, wurden vor N a be s h i m g a u. a. (Journal of Technology 48 f l^v>70 556) angegeben. Bei der elektronenmikroskopischer Untersuchung dieser CA-Stämme zeigt sich jedoch, dal: ihre Zellwand ein hohes Streuvermögen besitzt line schwer angreifbar ist. Das heißt die günstiger Eigenschaften der Mutanten gemäß der Erfindung, wie sie nachfolgend angegeben werden, sind den CA-Stäm men nicht eigen.

Nachfolgend wurden Zellen von den Stammer M-7002, M-7OO7 und M-7 als Vertreter für die Mutantci der oben beschriebenen Gruppen A und B sowie dii Kontrollstänime nach dem unter (1) beschriebener Verfahren elektronenmikroskopisch untersucht (Ver größerung 20 OOOfach). Die Ergebnisse sind in I' i g. ü wiedergegeben.

Beim Kontrollstamm und dem Stamm M-7007 wire eine deutliche Zellwand im Unifangsbereich der ZeIk beobachtet, während die Dicke des Zcllwandbereidr beim Stamm M-7002 gering und das Elektroiiensireii vermögen schwach ist. Daraus wird deutlich, daß dei Stamm M-7002 seiner Zellwand-Integritat beraubt um im Vergleich zum Kontrollstamm etwa doppeln Zellbreite besitzt. Aus elektronenmikroskopischei Beobachtungen folgt ebenfalls, daß die Stamme M-7003 M-7004. M-7005 und M-7006 in ahnlicher Weise ihrci Zellwand·Integrität beraubt sind.

Wie bereits den obigen Ausführungen z.T. /ι entnehmen ist. wurde aus den Tatsachen, daß der Sit< der primären Anfärbung durch Kristallviolett di< Zellwand ist und M-7002. M-7003, M-7004, M-7005 unc M-7006 gramnegativ sind und daß die Hauptkomponcn te der Zellwand Mannan Ist und die Mutanten gemäC der Erfindung kein Mannan oder weniger als di< natürlichen Stämme enthalten und daß M-7002. M-7003 M-7004. M-7005 und M-7006 bei der elektroncntnikro skopischen Untersuchung eine mangelhafte Zellwand struktur zeigen, geschlossen, daß M-7002, M-7003 M-7004. M-7005 und M-7006, d. h. die Mutanten dci Gruppe A, ihrer Zellwand-Integrität beraubt sind während M-7OO7, M-7008, M-7009 und M-7010, d. h. die Mutanten der Gruppe B₁ der Zellwand-Intogrität nui partiell beraubt sind.

Aus der Tatsache, daß die Verdaubarkeil und Ausnuizbarkeit der intrazellularen Substanzen der Hefezelle durch die (üblicherweise schwer angreifbare) /eilwand vermindert wird, kann wiederum geschlossen werden, daß die oben beschriebenen Mutanten gemäß der Erfindung sowohl hinsichtlich der Verdaubarkeit als auch der Ausnut/barkeit von intrazellularem Proiein im Vergleich zu dem herkömmlichen Stamm deutlich ausgezeichnet sind.

Nachfolgend wurde die Verdaubarkeit und Extrahierbarkeit von Protein aus den Zellen bei den erfindungsgemäßen Mutanten untersucht. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:

Zunächst wurde das Zellprotem von 4 Stammen der oben beschriebenen Mutanten der Genus Candida, i Kontrollstammen und 2Ca-Stammen auf seine Verdaubarken durch gastrisches Pepsin vom Rind und durch ein aus der Bauchspeicheldrüse des Gelbsehwanzlisches präpariertes proteolytisches Enzym untersucht. Dazu wurden die 14 Hefestämme durch Schütteln in dem oben beschriebenen normal-Paraffinmedium 48 Stunden lang bei JO¹C inkubiert und die durch Vermehrung entsandenen Zellen durch Zentrifugieren gesammelt. Nach Waschen und Trocknen wurde die Zellmasse jeweils in Salzsäure von pH 1.8 auf 1% Zelldichte suspendiert. Zu den einzelnen Suspensionen wurden 0,5% (Gewicht pro Volumen) gastrisches Pepsin vom Rind (2 χ kristallisiert und lyophilisert; 15J-1 570-1) hinzugegeben und die Mischungen bei 37 "C aufbewahrt.

Zu verschiedenen Zeiten (siehe F i g. J) wurden Anteile der Reaktionsmischung abpipeltiert. und nach Zentrifugieren wurde der Stickstoffgehalt in der überstehenden Flüssigkeit nach Kjcldahl bestimmt. Die Protein-Verdauungsgeschwindigkeii (obiger Stickstoffgehalt zum Gesamtstickstoff der Zellmasse vor der Verdauung; ausgedrückt in %) wurde ebenfalls bestimmt. Die Ergebnisse werden in F i g. J gezeigt.

In I'ig. J ist längs der Ordinaie die Verdauung des intrazellulären Proteins der Hefe durch gastrisches Pepsin vom Rind in % und längs der Abszisse die zugehörige Verdauungszeit in Stunden aufgetragen. Die erhaltenen Kurven A, B₁CA und »Kontrolle« zeigen die mittleren Verdaubarkeiten der Mutanten der Gruppe A. der Mutanten der Gruppe B, der CAStämme und der Kontrollstämme.

Wie I' i μ. J zeigt, ist die Verdaubarkeit der Mutanten der Gruppe A im Mittel etwa 2,7mal höher als die des bekannten wilden Stamms, wenn man die entsprechenden Werte 24 Stunden nach Beginn der Verdauung miteinander vergleicht und die mittlere Verdaubarkeit der Mutanten der Gruppe B ist etwa l,6mal höher als diejenige des herkömmlichen wilden Stamms.

Darüber hinaus nimmt die Verdauung der Mutanten gemäß der Erfindung sogar 20 Stunden nach Beginn der Verdauung noch zu, während diejenige de lierkömmli· chen Stamms IO Stunden nach Beginn der Verdauung einen konstanten Wert erreicht. Die gemüO der Erfindung isolierten Hefemutanten erwiesen sich mithin als sehr leicht verdaubar.

Nachfolgend wurde die Verdaubarkeit der Mummenzellen durch proteolytisches Enzym vom Fisch geprüft, um die Verdaubarkeit der crfindungsgcmttücn Produkte für den Fall der Verwendung als Futter für Fischkulturcn nachzuweisen. Dazu wurden die Zellen in 0,1 M Borat·Puffer (pH 8,0) auf 1% Zelldichte suspendiert und die Suspension mit von der Bauchspeicheldrüse eines Oelb'schwanzfisches nach dem Luskowskl-Verfahren (»Methods of Enzymology«, Bd. II, Seite 8. 1. Aufl.:

herausg. von S. P. Colo wick und N. O. Kaplan. Academic Press Inc., New York, 1955) hergestelltem proteolytischen Enzym sowie 0,005 M CaCI? bis zu einer Konzentration von 0,5"/< > (Gewicht pro Volumen) versetzt. Die Mischung wurde bei 37"C der Verdauung überlassen und die Verdaubarkeil nach dem gleichen Verfahren wie bei der Untersuchung mit gastrischem Pepsin vom Rind bestimmt. Die Ergebnisse sind in F i g. 4 wiedergegeben.

In F i g. 4 ist längs der Ordinate die Verdauung des I lelezellproteins durch proteolytisches Enzym von der Bauchspeicheldrüse eines Gelbschwanzfisches und längs der Abszisse die Verdauungszeit aufgetragen. Die Verdai'barkeii der Mutanten der Gruppe A, der Mutanten der Gruppe B, der Kontrollslämme und der CA-Stämme wird durch die Kurven A, B, Kontrolle und CA veranschaulicht. Wie man sieht, zeigen die Mutanten tier Gruppen A und B eine 2,2 bzw. l,8mal höhere Verdaubarkeil als die Konirollstämmc bei der Verdauung durch Bauchspeicheldrüsenenzym vom Gelb schwanzfiseh. Das heißt die Verdaubarkeit der Mutanten gemäß der Erfindung und insbesondere der Mutanten der Gruppe A ist im Vergleich zu derjenigen der Kontrollsiämme merklich verbessert.

Die CAStämme erweisen sich bei diesen Prüfungen hinsichtlich der Verdaubarkeit jeweils als den Konirollstiimmen vergleichbar. Obgleich also die CA-Slämme, wie Tabelle 2 zeigt, einen etwas geringeren Mannangehalt als die Kontrollstämme haben, sind sie doch ilen Mutanten gemäß der Erfindung hinsichtlich der Verdaubarkeit des Zellproteins merklich unterlegen. Diese CA-Stämme wurden keiner mutationsinduzierenden Behandlung gemäß der Erfindung unterworfen und zeigten ein hohes Streuvermogen der peripheren Bereiche der Zelle bei Beobachtung im Elektronenmikroskop.

Danach kann angenommen werden, daß die geringe Angreifbarkeit der Zellwand bei diesen CA Stämmen nicht verlorengegangen ist. Bei den Mutanten gemäß der Erfindung ist dagegen abweichend von den Kontroll- und CA-Siammen das Zellprotein in leicht verdaubarem Zustand, da diese Mutanten gemäß der Erfindung nicht nur keinen oder einen verminderter Mannangehalt besitzen, sonderen ihr Cytoplasm» odei ihre Zellmembran dem umgebenden Medium direk ausgesetzt ist, während die Zellwand-lntegritüt vollstan dig oder teilweise verlorengegangen ist.

Anschließend wurde die Extruhierbarkeil de intrazellularen Substanzen dieser Mutanten, der Kon trollstämme und der CA-Stamme durch chemisch' Reagenzien oder physikalische Mittel bestimmt, un Vorrichtungen zur Extraktion und Isolierung intrazcllu Ittrer Substanz festlegen zu können.

Tabelle i	Protein aus den Zellen	durch
Hxtraktion von		SchulloK/ll
MefcMilmmc		lulloncn
	% extrahiertes l'rotoin	79,3
	durch	72,5
	Alkali-	69,9
M-7002	lösung	73.2
M-7003	49,5
M-7004	51,2
M-7005	50,0
	49,5

Fortsetzung

llclcstii.iinic

% cxiruhicrtcs l'roicin

M-7006
M-7007
M-7008
M-7009
M-7010
Kontrolle (I)
Kontrolle (II)
Kontrolle (III)
Candida lipolytica
NRRL-6795
Candida tropicalis
IAM-4147

durch	d u ah
Alkuli	Schallos.'il
lösung	Unionen
49,9	75,2
49,5	69,3
35,2	60,0
28,6	45,5
34,0	52,2
23,6	22,6
25,2	27,2
24,8	25,4
25,6	29,3

23,5

25.9

In gleicher Weise wie für die Untersuchungen gemäß F i g. 3 und 4 wurden 9 Stämme der oben beschriebenen Mutanten, 3 Kontrollstämme und 2 CA-Stämme in normal-Paraffinmedium gezüchtet bzw. vermehrt. Die Zellen wurden dann gesammelt und in 0,05 n-Natronlauge auf 1 % Zelldichte suspendiert und 2 Stunden lang auf 50°C erwärmt; nach dem Zentrifugieren wurde der Stickstoffgehalt im überstehenden Anteil nach K j e 1 da hl bestimmt und die Extraktionsrate (%) über das Verhältnis der durch Natronlauge extrahierten Stickstoffmengen zum Gesamtstickstoff der Zelle vor der Behandlung berechnet. Die Ergebnisse sind in Spalte 2 der Tabelle 3 wiedergegeben.

Zellen der oben beschriebenen 3 Gruppen wurden weiter in einer sterilisierten Salzlösung auf 5% Zelldichte suspendiert und es wurden dann 5 ml Portionen dieser Suspensionen mit einem 1OkHz (10 KC) Schall-Disintegrator 5 Minuten lang behandelt bzw. zerrissen und anschließend zentrifugiert, wonach der Stickstoffgehalt in der überstehenden Fraktion bestimmt wurde. Die Extraktionsrate (%) wurde in gleicher Weise wie oben angegeben berechnet. Die Ergebnisse sind in Spalte 3 der Tabelle 3 wiedergegeben.

Aus Tabelle 3 ist klar ersichtlich, daß die gemäß der Erfindung erzielten Mutanten im Vergleich zu den Kontrollstämmen eine merklich höhere Proteinextraktionsrate sowohl bei Verwendung von Alkalilösung als auch bei Schalleinwirkung aufweisen and daß die Proteinextraktionsrate ähnlich wie bei der Verdaubarkeitsprüfung mit Enzymen in Abhängigkeit von der Abnahme des Mannangehalts zunimmt. Die CA-Stämme bleiben dagegen trotz ihres geringeren Mannangehalts hinsichtlich der Proteinextraktionsrate in ähnlichen Bereichen wie die herkömmlichen Stämme.

Wie anhand der zu Fig. 3 und 4 führenden Untersuchungen bereits beschrieben wurde, ist es ebenfalls klar, daß die gemäß der Erfindung erhaltenen Mutanten nicht nur durch einen mangelnden Mannangehalt hervorstechen, sondern auch durch genetisch fehlerhafte Zellwandstrukturen, was im Vergleich zu den Kontroli- und CA-Stämmen zu einer bemerkenswerten Verbesserung der Proteinextraktion durch Alkalibehandlung oder Schalleinwirkung führt.

Darüber hinaus sind die Mutanten gemäß der Erfindung den herkömmlichen wilden Stämmen hinsichtlich der Extrahierbarkeit intrazellularer Substanzen

bei Harnstoffbehandlung, Autolyse, mechanischen Mahlvorgang oder Gefrier- und Auftaubehandlungei überlegen.

Aus der Tatsache, daß die Stämme M-7002, M-7OO3 ■ M-7004, M-7005 und M-7006 unter den erfindungsge maß isolierten Hefemutanten der Genus Candidi gramnegativ sind, während sich alle herkömmlicher Hefestämme unabhängig von Wachstumsbedingunger und Wachstumsphase als grampositiv erweisen (untei der berechtigten Annahme, daß die Gram-Anfärbunj ein Mittel zur Unterscheidung der Beschaffenheit vor Zellwänden ist), sowie aus der elektronenmikroskop! sehen Beobachtung und den experimentellen Ergebnis sen bei der Prüfung der Verdaubarkeit durch Enzyme und aus der hohen Proteinextraktionsrate kanr geschlossen werden, daß sich diese erfindungsgemäßer Hefemutanten der Genus Candida von herkömmlicher Arten in positiver Weise unterscheiden und durch mangelnde Zellwand-Integrität auszeichnen, wöbe Cytoplasma oder Zellmembran frei liegen.

Von den 4 übrigen Mutanten sind die Stämme M-7OO7, M-7008 und M-7010 ähnlich wie die herkömmlichen Hefestämme bei Inkubation unter gleichen Bedingungen grampositiv, und der Stamm M-7009 nimmt eine Zwischenstellung zwischen grampositiv und gramnegativ ein, jedoch ist ihr Mannangehalt im Vergleich zu den Kontrollstämmen der Genus Candida auf 70—10% vermindert. Aus der Tatsache, daß die Werte von Proteinverdauungs- oder Extraktionsrate bei diesen Mutanten in einem mittleren Bereich zwischen derjenigen der ihrer Zellwand-Integrität beraubten Mutanten und derjenigen der Kontrollstämme liegen, kann geschlossen werden, daß diese 4 Mutanten ihrer Zellwand-Integrität partiell beraubt sind

Unter den herkömmlichen Helestämmen der Genus Candida haben die CA-Stämme, Candida lipolytica und Candida tropicalis einen etwas geringeren Mannangehalt als die Kcntrollstämme, und Candida lipolytica nimmt eine Zwischenstellung zwischen grampositiv und gramnegativ ein. Diese CA-Stämme haben jedoch eine bemerkenswert geringere Proteinverdaubarkeit und -extrahierbarkeit als die Mutanten gemäß der Erfindung und unterscheiden sich mithin recht deutlich vondiesen. Die wie oben beschrieben isolierten Hefemutanten der Genus Candida gemäß der !Erfindung sind mithin Mutanten, die der Zellwand-Integrität beraubt, gramnegativ und praktisch mannanfrei oder aber grampositiv sind und einen partiell verringerten Mannangehalt besitzen und im Gegensatz zu den üblichen bekannten wilden Hefestämmen durch abhauendes Enzym gut verdaubar sind und deren intrazelluläres Protein durch unterschiedliche Behandlungen sehr leichi extrahiert werden kann.

Bei Verwendung von Hefezellen für menschliche Nahrung und Futter für Haustiere oder Fische bilden die Hefemutanten der Genus Candida gemäß der Erfindung mithin sehr gut verdaubare Produkte, und es ist damit möglich, Nährmittel von hohem Nährwert und nährende Medikamente zu erzeugen. Im Falle einer industriellen Isolierung und Abtrennung intrazellulärer Substanzen von der Hefe können daher die Kosten für die Anlage und die Betriebskosten vermindert werden, wenn Hefemutanten gemäß der Erfindung zum Einsatz kommen, und es kann weiter ein Abbau und eine Denaturierung des Produktes weitgehend gehemmt werden, da die Isolierung und Abtrennung der intrazellulären Substanzen und Autolyse unter milden Bedingungen durchgeführt werden kann. Auch im

Hinblick auf die Extraktion und Ausnutzung biologisch wirksamer Substanzen, wie Enzyme, kann das erfindungsgemäße Verfahren im Vergleich zu den üblichen Methoden mit bemerkenswertem Vorteil angewandt werden.

Beispiel 1

201 Kulturmedium (pH 5,5) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung: 1% normal Paraffin mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen; 0,5% NH₄Cl; 0,7% KH₂PO₄; 0,001% FeSO₄ · 7 H₂O; 0,02% MgSO₄ ■ 7 H₂O; 0,001% MnSO₄ · 7 H₂O; 0,01% CaCI₂ · 2 H₂O und 0,05% Hefeextrakt wurden sterilisiert. Nach Einimpfen der Mutante M-7OO2 ( = ATCC 20314) wurde die Mischung 24 Stunden lang unier Belüftung bei 30⁰C inkubiert. Danach wurde dieses Kulturmedium zu 500 I sterilisiertem Kulturmedium der oben beschriebenen Art hinzugegeben mit weiterer 48stündiger Inkubation bei 30⁰C unter Belüftung und Einstellung des pH-Wertes. Danach wurden die Zellen mit einem Zentrifugiertrockner gesammelt und 2,5 kg trockene Hefezellen von hoher Verdaubarkeit erzielt. 2 kg der trockenen Zellmasse wurden abgenommen und mit 12 kg Weizenmehl versetzt. Nach dem Durchkneten wurde die Mischung mit 6 kg weißem Fischmehl gemischt zur Erzielung von Fischfutter.

Beispiel 2

20 I Kulturmedium (pH 6,0) mit 5% (als Kohlehydratkonzentration) Gärmelasse, 0,25% (NH₄J₂SO₄; 0,5% KH₂PO₄; 0,02% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,04% Hefeextrakt (gewichtsmäßige Zusammensetzung) wurden nach dem Aufkochen filtriert und sterilisiert. Danach wurde die Mutante M-7005( = ATCC 20315) eingeimpft und 24 Stunden lang bei 30⁰C präinkubiert. Diese Mischung wurde dann zu 500 I des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugegeben, und es folgte eine Inkubation unter Belüftung, die 36 Stunden bei 30°C und 12 Stunden bei 40⁰C durchgeführt wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser in einem Trommeltrockner getrocknet zur Erzielung von 3 kg trockener Hefezellcn.

Eine 2 kg Portion wurde davon entnommen und mit 20 kg 0,1 n-NaOH versetzt und nach 2 Stunden langem Stehenlassen bei 50" C zentrifugiert. Die überstehende Fraktion wurde zur Ausfällung von Protein mit HCl versetzt, wobei der pH-Wort auf 4.8 eingestellt wurde. Das ausgefällte Protein wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und mit einem kleinen Sprühtrockner getrocknet zur Erzielung von 500 g trockenem ZeIlprotein. 50 kg Wasser und 1 kg Glucose wurden zu den 500 g Protein hinzugegeben. Die Mischung wurde mit Lactobacillus acidophilus geimpft und 30 Stunden lang bei 37°C zur Bildung von Milchsäure vergoren. Abschließend wurden Zucker und Geschmacksstoffe in geeigneter Menge hinzugegeben und ein schmackhaftes und nährendes hochprotcinhaltiges Getränk erhalten

Beispiel 3

Die Mutante M-7006 (= ATCC 2031b) wurde in 20 I Kulturmedium (pH 6,0) mit folgender gewichtsmüßiger Zusammensetzung: 4% (als Kohlehydratkonzentration) von Sulfit befreiter Sulfitpülpeliquor; 0.2% (NH₄)jSO₄; 0.1% KHjPO₄; 0,25% MgSO₄ · 7 HjO und 0.3% Hefeextrakt eingeimpft. Nach 48stündiger Inkubation bei 30⁰C wurde die Flüssigkeit zu 500 1 des oben hoschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugefügt und unter Belüftung 48 Stunden lang bei 30⁰C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser in einem Trommeltrockner getrocknet zur Erzielung von 2,5 kg trockener Hefezcls len, die dann mit einem Mahlwerk pulverisiert wurden zur Erzielung eines Nährmedikaments mit hohem Protein- und Vitamingehalt sowie guter Verdaubarkeil.

Beispiel 4

ίο 201 Kulturmedium (pH 6,0) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung: 1% normal Paraffin mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen; 0,5% NH₄Cl; 0,7% KH₂PO₄; 0,001% FeSO₄ · 7 H₂O; 0,02% MgSO₄ ■ 7 H₂O; 0,001% MnSO₄ · 7 H₂O; 0,01% CaCI₂ · 2 H₂O und 0,05%

ι s Hefeextrakt wurden sterilisiert. Diese Flüssigkeit wurde mil der Mutante M-7010 ( = ATCC 20318) geimpft und 24 Stunden lang unter Belüftung bei 30⁰C inkubiert. Anschließend wurde die Mischung zu 500 I des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugegeben, und es folgte eine weitere 48stündige Inkubation bei 3O⁰C unter Belüftung, wobei der pH-Wert kontrolliert wurde. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser bei 50⁰C getrocknet zur Erzielung von 2,8 kg

;s trockener Hefezellen hoher Verdaubarkeit. 1 kg wurde davon entnommen und mit 3 kg Getreide-Schrotmehl; 4,8 kg Reiskleie; 1kg Sojamehl; 50 g Salz und 50 g Calciumcarbonat gemischt zur Erzielung einer Futtermischung für Rindvieh.

Beispiel 5

201 Kulturmedium (pH 6,0) mit folgender gewichtsmäßiger Zusammensetzung: 5% (als Kohlehydratkonzentration) Gärmelassen; 0,25% (NH₄I₂SO₄; 0,5%

3> KH₂PO₄; 0,02% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,04% Hefeextrakt wurden nach Aufkochen filtriert und sterilisiert. Die Mutante M-7OO7 ( = ATCC 20317) wurde darin eingeimpft und unter Belüftung 24 Stunden lang bei 30⁰C inkubiert. Die erhaltene Mischung wurde zu 500 I des oben beschriebenen sterilisierten Kulturmediums hinzugegeben, und es folgte eine Inkubation unter Belüftung bei 3O⁰C (36 Stunden) und dann bei 40°C (12 Stunden). Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und nach Waschen mit Wasser in einem Trommeltrockner getrocknet zur Erzielung von 3 kg trockner Hefezellen.

2 kg wurden davon entnommen und mit 20 kg 0.1 n-NaOH versetzt und 2 Stunden lang bei 50 C stehengelassen und dann zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde zur Ausfällung von Protein mit

1 n-HCI versetzt, wobei der pH-Wert auf 4,8 eingestellt wurde; das Protein wurde dann durch 21entrifugieren abgetrennt und mit einem kleinen Sprühtrocknci getrocknet zur Erzielung von 500 g trockenem intrazel· lulärem Hefeprotein.

50 kg Wasser und 1 kg Glucose wurden zu den 5001 Protein hinzugefügt. Die Flüssigkeit wurde durch 3( Stunden lange's Inkubieren mit Lactobacillus acidophilu: bei 37' C einer Milchsäuregärung unterworfen und dam

(Ό mit Zucker und Geschmacksstoffen versetzt zu Erzielung eines schmackhaften nährenden proteinrei chen Getränks.

Beispiel b

<>s 1 kg der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Hefezellei wurden mit 5 kg Weizenmehl, 40 g Salz, 20 g Honig um

2 kg Wasser und weiter mit 3,5 kg Gluten, 300 eßbarem öl und Geschmacksstoffen versetzt. Di

Mischung wurde in einem Ofen 30 Minuten lang bei 120°C gebacken zur Erzielung einer knusprigen Imbiß-Diät mit einer abgeglichenen Aminosäurezusammensetzung.

Beispiel 7

4 kg nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellte trockene Hefezellen wurden zu 20 kg 0,5n-NaOH hinzugegeben, 2 Stunden lang bei 50⁰C stehengelassen und dann zur Abtrennung der intrazellu-

lären Substanzen enthaltenden nberstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Zwei kg CaCI₂ · 2 H₂O und 0,2 kg Ca(OH)₂ wurden in 15 kg Wasser von 90⁰C suspendiert und dann mit der obigen überstehenden Flüssigkeit

s unter Rühren versetzt. Nach 30 Minuten Stehenlassen wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann in Wasser suspendiert und der pH-Wert mit 6 n-HCI auf etwa 7 eingestellt. Der Niederschlag wurde zentrifugiert zur

ίο Erzielung eines flockenähnlichen und fleischähnlich texturierten Nahrungsmittels.

Hier/u 4 Bhitt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Biochemisches Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen proteinhaltigen Substanzen in Form von Hefezellen, welche leichter extrahierbar sind und durch Mensch und Tier leichter verdaut werden können, ausgehend von einer Kohlenwasserstoff assimilierenden Hefe der Gattung Candida, d a -durch gekennzeichnet, daß man

a) die Hefe durch chemische oder physikalische mutagene Mittel mutiert,

b) daß man eine die erhaltenen Mutanten enthal tende Suspension zur Bildung von Kolonien auf ein festes Kulturmedium überimpft,

c) daß man sodann entweder

C;) von den in b) erhaltenen Kolonien, Kolonien mit rauher Oberflächenschicht auswählt, daß man von den Zellen der Kolonien mit rauher Oberflächenschicht mit Hilfe eines lichtopiisehen Mikroskops Zellen von Kugelform gewinnt, daß man aus den erhaltenen kugelförmigen Zellen nach Gram-Anfärbung gramnegative Zellen auswählt, daß man aus den erhaltenen gramnegativen Zellen Zellen mit praktisch vernachlässigbarem Mannan-Gchalt isoliert, oder

Ci) daß man die Zellen der in b) erhaltenen Kolonien einer Gram-Anfärbung unterwirft, daß man von den erhaltenen grampositiven Zellen auf elektronenmikroskopischem Wege solche auswählt, welche ein geringeres Elektronenstreuvermögen der äußeren Schicht der Zellwand besitzen, daß man von den erhaltenen grampositiven Zellen, welche ein geringeres M Elektronenstreuvermögen der äußeren Schicht der Zellwand besitzen, solche Zellen isoliert, deren Mannan-Gehalt unter 70% des Mannan-Gehaltes des unter .gleichen Bedingungen gezüchteten Mutterstammes liegt,

d) daß man die nach Ci) oder C2) ausgewählten Mutanten in einem Kulturmedium aerob vermehrt und

e) daß man schließlich die vermehrte Zellmasse gewinnt.

2. Verwendung der nach Anspruch 1 erhaltenen mikrobiellen proteinhaltigen Substanzen in Form von Hefezellen bei der Herstellung von Fischkulturfutter, von proteinreichem Getränk, von Nährmetiikamenten, von Tierfutter, von Nähr-Imbiß und von fleischähnlichen Nahrungsmitteln.