DE69030817T2

DE69030817T2 - Verfahren zur Herstellung einer Zeaxanthin enthaltenden Zusammensetzung mittels eines Mikroorganismus der Spezies Flavobacterium multivorum

Info

Publication number: DE69030817T2
Application number: DE69030817T
Authority: DE
Inventors: Dennis Gierhart
Original assignee: Applied Food Biotechnology Inc
Current assignee: Applied Food Biotechnology Inc
Priority date: 1989-08-30
Filing date: 1990-07-12
Publication date: 1997-10-16
Anticipated expiration: 2010-07-13
Also published as: PT95088B; US5308759A; JP2887848B2; KR927003840A; JP3361064B2; WO1991003571A1; EP0534955A4; ATE153700T1; JPH11206339A; EP0534955A1; GR900100566A; DE69030817D1; PT95088A; KR0148133B1; EP0534955B1; US5427783A; JPH05508532A; ES2104608T3; GR1000713B; DK0534955T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Zeaxanthin unter Verwendung eines Mikroorganismus der Spezies Flavobacterium multivorum, Nährstoffmedien zum Kultivieren und Fermentieren von F.multivorum, Zusammensetzungen, die F.multivorum-Zellteilchen enthalten, und Zusammensetzungen, die Zeaxanthin enthalten, das durch einen Mikroorganismus der Erfindung produziert wurde.

HINTERGRUND UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Zeaxanthin (3,3'-Dihydroxy-β-carotin) ist ein Carotinoid, das Mais, Eidotter und Geflügelhaut eine gelbe Farbe verleiht. Es kann als Nahrungsmitteladditiv und als Farbstoff in der Kosmetik- und Nahrungsmittelindustrie eingesetzt werden.
Das reine Zeaxanthin und die pigmenthältige Zellmasse, die gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt werden, können zur Färbung von Nahrungsmitteln und Kosmetika herangezogen werden. Die pigmenthältige Zellmase eignet sich besonders zum Färben von Beinen, Schnäbeln, Haut, Fett, Fleisch und Eidotter von Geflügel.
Zeaxanthin wird biologisch durch sehr wenige Bakterienspezies der Gattung Flavobacterium synthetisiert. Mit wenigen Ausnahmen können alle Flavobacterium- Spezies der Einfachkeit halber in zwei Kategorien eingeteilt werden: 1) stark proteolytisch (Spaltung von Gelatin, Kasein und koaguliertem Serum) und 2) nichtproteolytisch. F. meningosepticum (biovar IIa) und F. indologenes (biovar IIb) sind immer proteolytisch; andere Flavobakterien sind es nicht (IIc IIe, IIh, IIi und IIk-2). F.multivorum ist eine von drei Spezies, die nun in der IIk-2-Gruppe von CDC bekannt sind (nicht-proteolytisch).
Geflügelproduzenten sehen sich seit langer Zeit mit Problemen bezüglch Stabilität und biologischer Verfügbarkeit konfrontiert, insbesondere mit Xanthophyllen aus Ringelblumen und Alfalfa. Es werden große Anstrengungen unternommen, diese Eigenschaften zu messen und zu verbessern. Die meisten Ringelblumenprodukte müssen lösungsmittelextrahiert und verseift werden und erfordern möglicherweise das Zugeben von Antioxidantien während des Extraktionsprozesses (Marusich und Bauerfeind, Carotenoids As Colorants and Vitamin A Precursors; Hg., J.C. Bauerfeind, Academic Press, 1981). Die in Beispiel 6 gezeigten Futteruntersuchungen verglichen direkt eine bekannte Pigmentmenge mit verschiedenen verarbeiteten Extrakten aus Ringelblumen; die Daten zeigen, daß die Zusammensetzung der Erfindung biologisch verfügbar und stabil ist, rascher pigmentiert und - lediglich auf Pigmente bezogen - zwei- bis dreimal wirkungsvoller ist als Ringelblumen-Xanthophylle. Es ist bekannt, daß verschiedene Spezies mit dem Namen Flavobacterium unter bestimmten Verfahrensbedingungen und/oder bei Verwendung bestimmter Nährstoffmedien Zeaxanthin produzieren können (siehe Abschnitt über die einschlägige Literatur).
Es ist weiters bekannt, daß verbesserte Ausbeuten von Zeaxanthin durch Kultivieren eines als Flavobacterium bezeichneten Mikroorganismus unter Bedingungen erzielt werden können, die dafür sorgen, daß die Mengen an im Kulturmedium vorhandenem Kohlenstoff und Stickstoff in einem im Wesentlichen konstanten Verhältnis gehalten werden. Die Nährstoffmedien dieser Verfahren erfordern Glukose und andere Nährstoffe, die relativ teuer sind und eine lange Kultivierungsdauer notwendig machen.
Die vorliegende Erfindung bietet auch ein Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin durch Kultivieren eines Zeaxanthin produzierenden Mikroorganismus von Flavobacterium multivorum, wobei das erste Mal aufgezeigt wurde, daß diese Flavobacterium-Spezies Pigmente erzeugt. Das Nährstoffmedium, in dem der Mikroorganismus kultiviert wird, ist außerdem ein relativ kostengünstiges Nährstoffmedium. Weiters ist die Kultivierungszeit viel kürzer und ergiebiger als bei bekannten Verfahren.
Demzufolge ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin unter Verwendung eines Stamms von Flavobacterium multivorum oder eine Mutante oder Variante davon bereitzustellen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, größere Mengen an Zeaxanthin und bessere Zellausbeuten von Zeaxanthin enthaltenden Zeilen zu erzielen als bekannte Mikroorganismen und Verfahren.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Erzielung größerer Ausbeuten des biologisch verfügbaren Zeaxanthinpigments bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel, ein Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin unter Verwendung von Mikroorganismen bereitzustellen, die genügsam sind, rasch wachsen und nicht-pathogen sind. Diese Mikroorganismen können ein Nährstoffmedium verarbeiten, das unterschiedliche Kohlenstoffquellen enthält.
Es ist ein weiteres Ziel, ein wirtschaftliches und kommerziell geeignetes Nährstoffmedium bereitzustellen, das die Menge des produzierten Zeaxanthins optimiert, eine hohe Zellausbeute erzielt, eine hohe Ausbeute an Zeaxanthin liefert und die Fermentationsdauer zur Herstellung von Zeaxanthin verkürzt.
Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung einer Zeaxanthin produzierenden Bakterienspezies.
Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellugn eines Mikroorganismus, von dem bislang nicht bekannt war, daß er Zeaxanthin produziert.
Diese und andere Ziele sind in der folgenden Beschreibung der Erfindung und den Patentansprüchen dargelegt.

EINSCHLÄGIGE LITERATUR

US-Patent Nr. 3.891.504 offenbart Zusammensetzungen und ein Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin. Die zwei Flavobacterium-Spezies sind als ATCC Nr. 21588 und 21081 identifiziert. Diese Stämme wurden in einem Nährstoffmedium fermentiert, das Glukose, Trypton und einen Hefeextrakt enthielt, und einem Verfahren unterzogen, das Temperaturverschiebungen und die Verwendung von Pigmentverstärkern (Milchsäure- und Palmitinsäuremethylester) umfaßte. Diese Bakterien sind im 1985- Katalog der ATCC als "Unidentifizierte Bakterien" aufgelistet. Wie nachstehend angemerkt (S. 22) würden ATCC 21588 und 21081 gemäß dem taxonomischen Schema, das in der 1984-Ausgabe des Handbuchs von Bergey beschrieben ist, nicht unter die Flavobacteri um-Gattung fallen.
US-Patente 3.841.967, 3.951.742 und 3.951.743 offenbaren die Verwendung von Flavobacterium-Stämmen (als ATCC Nr. 21588, 21081 und 11947 identifiziert, aus der gleichen Abstammungslinie wie ATCC 21588 und 21081) in einem Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin durch eine ähnliche Vorgangsweise wie zur β- Karotinproduktion. Das Verfahren umfaßt das Wachstum des Mikroorganismus in einem Glukose-Nährstoffmedium im Chargenbetrieb, mit der Ausnahme, daß der Kultur kontinuierlich zusätzliche Nährstoffe zugegeben werden, um ein konstantes Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis aufrechtzuerhalten. Diese Patente offenbaren auch ein Mutationsverfah ren zum Isolieren von stark pigmentproduzierenden Bakterienstämmen. Das Verfahren mittels dieser Mutante erzeugt hohe Mengen an Zeaxanthin, es ist aber nicht wirtschaftlich.
US-Patent 4.026.949 offenbart die Herstellung von optisch aktiven Zwischenprodukten, die bei der Erzeugung von Karotinoiden wie z.B. Zeaxanthin verwendet werden; das in diesem Verfahren eingesetzte Bakterium ist Flavobacterium dehydrogenans.
Arch. Microbiol., 113, 33-37 (1977) beschreibt die Produktion von Zeaxanthin aus bestimmten Bakterien, die durch die Autoren als "Flavobacterium" bezeichnet wurden. Dazu zählen "Flavobacterium rhenanum". Der 1975-Katalog von NCIB führt an, daß dieses Bakterium besser als Erwinia klassifiziert werden sollte.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Zeaxanthin mittels eines Mikroorganismus (Flavobacterium multivorum), von dem bislang nicht bekannt war, daß es dieses Pigment produziert. Die Erfindung betrifft das Isolieren von Flavobacterium mutlivorum-Zellen und deren Kultivieren in einem Nährstoffmedium unter Bedingungen, bei denen Zeaxanthin in gewinnbaren Mengen erzeugt wird. Die mikrobiellen Zellen können von der Fermentationsbrühe abgetrennt und in Biomassezusammensetzungen verwendet werden.
Demzufolge bietet ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zeaxanthin enthaltenden Zusammensetzung, umfassend:
das Kultivieren eines Flavobacterium multivorum-Mikroorganismus oder von Mutanten oder Varianten davon in einem Nährstoffmedium, das zumindest eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und zumindest eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff enthält, worin das Kultivieren des Mikroorganismus zur Herstellung einer Kultur führt, die eine Zeaxanthin enthaltende Zellmasse und restliches Nährstoffmedium enthält; sowie das Gewinnen von Zeaxanthin aus der Kultur.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist eine Futtermittelzusammensetzung bereitgestellt, umfassend nicht-lebensfähige Zeaxanth in enthaltende Flavobacterium multivorum-Zellen sowie verbleibende Zellreste und unverbrauchte Nährstoffmedium- Feststoffe, die aus der Fermentation von Flavobacterium multivorum-Zellen gewonnen wurden.
Der Ausdruck "Flavobacterium multivorum" bezeichnet alle Mikroorganismen der Gattung Flavobacterium und Spezies Multivorum, die Zeaxanthin produzieren, einschließlich ihrer Subkulturen (Mutanten und Varianten), die nicht definitiv vom oder von den Bakterienstämmen differenziert werden können, die in den Beispielen oder in Bergey's Manual (1984-Ausgabe) beschrieben sind. Die Eigenschaften von F.multivorum sind weiter unten erläutert, und eine taxonomische Beschreibung des F.multivorum-Stamms AFB-44 wird in Beispiel 4 gegeben. Der Ausdruck "Mutanten" bezieht sich hierin auf Mutanten, die auf unterschiedliche Weise aus Flavobacterium multivorum produziert werden, u.a. durch chemische mutagene Mittel, UV-Bestrahlung, Phage-Exposition u.dgl. Diese Verfahren und Mittel sind Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt. Die in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebenen Mutanten wurden einer herkömmlichen Mutagenese durch NTG (n-Methyl-N-nitro N- nitrosoguanidin) und UV-Strahlung ausgesetzt, wie dies in Manual of Methods for General Bacteriology; ASM 1981, Kapitel 13 beschrieben ist. Der Ausdruck "Varianten" umfaßt hierin Varianten von Flavobacterium multivorum, darunter jene, die in Bergey's Manual (1984-Ausgabe) beschrieben sind. Der Ausdruck "Biomasse" bezieht sich hierin auf nicht-lebensfähige, Zeaxanthin enthaltende Flavobacterium multivorum-Zellen, verbleibende Zellreste einschließlich unverbrauchter Medienfeststoffe, die aus der Fermentierung lebender Flavobacterium multivorum-Zellen gewonnen werden, und aus diesem Material stammende Pulver. Die Biomasse kann auch bestimmte allgemein bekannte Additive, Schutzmittel sowie Emulgatoren und stabilisierte Pulver aus diesem Material enthalten. Die Biomasse kann in einen inerten Träger eingebracht werden, der z.B. Stärke und/oder verbleibendes Fermentationspulver und/oder ein oder mehrere Mehle enthält.
Flavobacterium multivorum wächst in glatten, nicht-pigmentierten Kolonien von weniger als 1 mm auf einer Eintages-Schafsblutagarplatte; die Platte zeigt keine Hemmzonen um Penicillin-, Vancomycin- und Polymyxin-Scheiben. Die Mikroorganismen sind stark oxidasepositive, katalasepositive, gram negative Stäbchen; unbeweglich; stark saccharosepositiv (die meisten nicht-fermentierenden Bakterien sind saccharosenegativ); immer mannitnegativ und ethanolnegativ; und harnstoffpositiv.
Die Herstellung von Zeaxanthin gemäß der vorliegenden Erfindung kann mittels herkömmlicher Kultivierungsverfahren erfolgen, die Praktikern auf dem Gebiet der Herstellung von Zeaxanthin allgemein bekannt sind. Siehe z.B. US-Patente 3.891.504, 3.841.967, 3.951 742 und 3.951.743. Zusammenfassend gesagt können Flavobacterium multivorum-Zellen in bekannter Weise isoliert werden, die gelben Kulturen können gereinigt und auffesten Nährstoffmedien oder in flüssigen Nährstofflösungen unter Bedingungen kultiviert werden, bei denen Zeaxanthin intrazellulär erzeugt wird. Die Zelle kann mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und das Zeaxanthin mittels Spektrophotometrie und Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie analysiert werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist allerdings das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin in Beispiel 2 dargelegt.
Vorzugsweise erfolgen die Isolierung und Reinzüchtung der gelben Flavobacterium- Mikroorganismen der Erfindung wie folgt. Material aus einer Quelle oder einem anderen natürlichen Ursprung wird in physiologischer Salzlösung suspendiert. Strichkulturen werden in Petrischalen eingebracht. Dann werden die auf dem Agar wachsenden gelben Kulturen bezüglich des Karotinoidgehalts untersucht. Flavobacterium multivorum-Kolonien können durch Vergleichen der Zellen mit der taxonomischen Beschreibung in Bergey's Manual (1984-Ausgabe) identifiziert werden. Schließlich werden die erfindungsgemäßen Flavobacterium multivorum- Mikroorganismen gemäß ihrem Zeaxanthingehalt identifiziert [(bestätigt durch analytische Verfahren, vorzugsweise Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie; F. Quackenbush, J. Liquid Chromatography, 10(4), S. 643-653 (1987)] und isoliert. Verfahren zur Bestimmung von Zeaxanthin produzierenden Mikroorganismen sind unter anderem die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie. Andere Verfahren zur Isolierung von F.multivorum sind Praktikern auf dem Gebiet bekannt und eignen sich zur Verwendung für die Erfindung. F.multivorum-Stämme sind auch bei der American Type Culture Collection und verschiedenen öffentlichen und privaten Hinterlegungsstellen auf der ganzen Welt erhältlich.
Die im vorliegenden Verfahren eingesetzten Mikroorganismen können in herkömmlicher Weise in einem Nährstoffmedium kultiviert werden. Beim Kultivieren der Mikroorganismen können zahlreiche feste Nährstoffmedien (oder herkömmliche flüssige Nährstofflösungsmedien), die assimilierbaren Kohlenstoff oder Stickstoff enthalten, verwendet werden. Der Ausdruck "Nährstoffmedium" bezeichnet ein Kulturmedium, das assimilierbare, für das Wachstum des Mikroorganismus notwendige Substanzen enthält. Diese Substanzen enthalten insbesondere eine Quelle für leicht assimilierbaren Kohlenstoff und eine Quelle für leicht assimilierbaren Stickstoff sowie Mineralsalze, wie dies unten angeführt ist. Das Nährstoffmedium kann auch wahlweise Additive wie z.B. Vitamine, Pigmentbildungsverstärker, Wachstumsfaktoren, bestimmte anorganische Salze wie z.B. NaCl (die herkömmlicherweise in solchen Medien vorhanden sind) und Spurenelemente enthalten, wie dies unten angeführt ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt das bevorzugte Medium die folgende Zusammensetzung (die Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht des Gesamtmediums):
Stickstoffquelle 3-10%
Kohlenstoffquelle 1-7%
Mineralien 0,0001-0,5%
Na&sub2;HPO&sub4; 0-1%
Fettquelle 0,5-3%
Wachstumsfaktor(en) 0-1 %
Enzym 0,001-0,1%
Wasser Rest
Quellen für leicht assimilierbaren Stickstoff sind unter anderem zahlreiche Substanzen tierischen, pflanzlichen und/oder mikrobiellen Ursprungs sowie anorganische Stickstoffverbindungen. Unter den bevorzugten Quellen für leicht assimilierbaren Stickstoff sind Sojamehl, Fischmehl, Fleischmehl, Fleischextrakt, Pepton, Maisquelwasser, Hefeextrakt, Aminosäuren, Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumphosphat oder Ammoniumsulfat) und Proteinhydrolysate, insbesondere Produkte, die durch die saure oder enzymatische Hydrolyse pflanzlicher Proteine erhalten werden, z.B. Sojabohnen-, Soja- oder Erdnußproteine und/oder das Kaseinhydrolysat namens Trypton. Die Stickstoffquelle kann auch ein Material enthalten, das durch saure oder enzymatische Hydrolyse einer Biomasse gebildet wird, die als Nebenprodukt der Biosynthese eines Karotinoidpigments durch Kultivieren eines Bakten ums des Flavobacterium-Gattung anfällt, insbesondere durch Hydrolyse einer Biomasse von Flavobacterium, die zur Herstellung von Zeaxanthin kultiviert wird und aus der das Pigment extrahiert wurde.
Die bevorzugteste assimilierbare Stickstoffquelle ist Maisquellwasser, da sie billig ist und erwünschte Wachstumsfaktoren vorhanden sind.
Quellen für leicht assimilierbaren Kohlenstoff sind unter anderem Zucker und ihre Polymere, z.B. Stärken, Dextrin, Saccharose, Maltose, Lactose, Glukose und Molassen; Fettsäuren; und Polyalkohole wie Glyzerin. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Mais, Maismehl, Reis, Mib, Weizen, Stärke, Laktate, Acetate und Glukosefeed. Maismehl ist aufgrund seines Preises, seiner Teilchengröße und Kulturverwendung bei Werten von 1- 7 Gew.-% des Gesamtmediums am bevorzugtesten. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig ist, erfordern Mais, Maismehrl und Stärke die Behandlung mit einem Maisverflüssigungsenzym wie z.B. α-Amylase (im Handel als Termamyl 120 L erhältlich), die Stärke zu Dextrin hydrolysiert. Ohne diese Behandlung würde die Stärke nach dem Erwärmen zu einer festen Masse aushärten. Zu viel enzymatische Hydrolyse senkt jedoch die Ausbeuten, während zu wenig Hydrolyse die Ausbeuten senkt und die Fermentationszeiten verlängert.
Die Nährstoffmedien können auch Spurenelemente enthalten, die aus vorhandenen oder hinzugefügten mineralischen oder organischen Ingredientien stammen. Beispielsweise können Schwefel und Phosphor aus anorgansichen oder organischen Ingredientien entstehen, die im Nährstoffmedium vorhanden sind, oder sie werden dem Nährstoffmedium eigens zugegeben. Falls dies erwünscht oder erforderlich ist, können Wachstumsfördermittel oder -stimulantien wie z.B. Vitamine dem Nährstoffmedium zugegeben werden. Die bevorzugten Mineralien sind geringe Mengen an Eisen(II)sulfat (das das Zellwachstum verbessert) und Dinatriumphosphat.
Die Fettquelle ist u.a. Ausgangsmaterial für Seife, Sojabohnenöl, Sonnenblumenöl und Olivenöl, wobei Ausgangsmaterial für Seife vorzuziehen ist.
Die Kultivierung erfolgt vorzugsweise durch Verwendung bestimmter Wachstumsfaktoren oder Additiven zur Steigerung der Ausbeute in den Medien. Der bevorzugte Wachstumsfaktor ist Hefeextrakt.
Die für das Kultivierungsverfahren geeigneten Stämme können nach bekannten Verfahren aus der Strichkulturplatte in das Fermentierungsgefäß eingebracht werden. Die bevorzugten Verfahren umfassen die Agarschrägkultur und die Glaskolben- Flüssigkeitskultur.
Die Kultivierung des Mikroorganismus unter Bedingungen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung zur Bildung von Zeaxanthin führen, kann in herkömmlicher Weise erfolgen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsfom der Durchführung des vorliegenden Verfahrens findet die Kultivierung in einem wäßrigen Medium statt. Bei der Durchführung dieser Submerskultivierung können die Bedingungen herrschen, die herkömmlicherweise bei der Submerskultivierung herrschen. Im bevorzugten Verfahren erfolgt die Fermentierung bei einer Temperatur zwischen 10 und 35ºC in einem pH- Bereich von etwa 6,5 bis 8,0 und über eine Zeitspanne von etwa 24 bis etwa 72 Stunden. Die bevorzugten Bedingungen des Kultivierungsverfahrens mittels der Nährstoffmedien der vorliegenden Erfindung sehen eine Temperatur zwischen etwa 22 und 30ºC, einen pH-Wert von etwa 7,2 und eine Kultivierungsdauer von etwa 30-36 Stunden vor.
Der pH-Wert des Kulturmediums wird zwischen 6,5 und 8,0, vorzugsweise zwischen 7,0 und 7,5, eingestellt. Die Einstellung des pH-Werts kann mit Substanzen erfolgen, die u.a. wäßrige Lösungen von Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxid sein können. Diese Substanzen sind Praktikern auf dem Gebiet allgemein bekannt.
Beim Verfahren der Erfindung nimmt die Pigmentbildung im Verhältnis zum Kulturwachstum zu, wobei die maximale Pigmentbildung in etwa 30-36 Stunden erreicht wird.
Nach dem Abschluß der Kulturzeit kann der Zeaxanthingehalt des Fermentationsmediums bestimmt werden. Zu diesem Zweck wird die Biomasse durch Zentrifugieren vom Nährstoffsubstrat abgetrennt und das Zeaxanthin aus den Zellen extrahiert. Der Zeaxanthingehait der Extraktionslösung kann kolorimetrisch durch Vergleich mit Standardlösungen von synthetischem Zeaxanthin im gleichen Lösungsmittel ermittelt werden.
Am Ende der Kultur kann die Fermentationsbrühe konzentriert und das Zeaxanthin aus den Zellen extrahiert werden; dies erfolgt mithilfe eines organischen Lösungsmittels, z.B. mit Aceton, Hexan oder einem chlorierten Lösungsmittel wie Chloroform, oder durch überkritische Flüssigextraktion. Siehe z.B. F. Favati et al., J. Food Sci. 53(5): 1532- 1535 (1988).
Alternativ dazu kann die Biomasse vom Kulturmedium abgetrennt werden, z.B. durch Zentrifugieren, Dekantieren oder Filtrieren. Bei Anwendung des Zentrifugierens kann die Zellengewinnung durch Zugabe von Bentonit und Calciumchlorid verbessert werden (siehe Beispiel 2). Beim bevorzugten Verfahren werden Bentonit und Calciumchlorid der Fermentationsbrühe zugegeben, die dann erhitzt wird, um alle lebensfähigen Zellen zu töten. Die Brühe wird anschließend zentrifugiert, um eine Paste gepackter Zellen und unverbrauchter Medienfeststoffe zu gewinnen. Die Zellpaste kann in Wasser zu einer praktikablen Viskosität aufgeschlämmt werden. EDTA (etwa 0,2%), BHA (etwa 0,05%), Tween (etwa 0,1%) und Tocopherolacetat (etwa 0,015%) können der Aufschlämmung zugegeben werden, um Pigmentabbau zu verhindern oder zu verringern; die angegebenen Prozentsätze beziehen sich auf das Zellgewicht in der Aufschlämmung Diese wird dann homogenisiert (z.B. mittels Glasperlenzellaufbrechens oder eines Hochdruckhomogenisierers) und für weitere Verwendungen getrocknet. Das bevorzugte Trocknungsverfahren ist das Sprühtrocknen
Die Biomasse kann als Additiv in Hühnerfutter verwendet werden, oder sie kann auch mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert werden (siehe oben).
Die pigmenthaltige Biomasse kann gemäß der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise verwendet werden, um Nahrungsmittel ohne Notwendigkeit des Isolierens von reinem Zeaxanthinpigment zu färben. Das intrazelluläre Zeaxanthin kann jedoch in herkömmlicher Weise von den Zeilen abgetrennt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Abtrennen oder Extrahieren des Zeaxanthins umfaßt das sorgfältige Trocknen der Zellmasse; das Pulverisieren der getrockneten Zellmasse; das Digerieren des pulverisierten Materials mit einem inerten organischen Lösungsmittel; das Filtrieren der Lösung; und das Isolieren des reinen Zeaxanthins durch Eluieren des Filtrationsrests mit einem inerten organischen Lösungsmittel. Die einzelnen Schritte des bevorzugten Verfahrens können in herkömmlicher Weise erfolgen. Gemäß einem besonders bevorzugten Verfahren des Abtrennens von Zeaxanthin wird die Zellmasse durch Sprühtrocknen getrocknet. Inerte organische Lösungsmittel sind u.a. ein Niederalkanol, vorzugsweise Ethanol; ein Keton, vorzugsweise Aceton; oder ein halogenhaltiger Kohlenwasserstoff, vorzugsweise Chloroform. Es ist weiters besonders vorzuziehen, den Verdampfungsrest in Ethylacetat, einem Niederalkanol oder Gemischen davon aufzunehmen. Weiters ist besonders das Filtrieren der Lösung über Kieselgel, neutralem Aluminiumoxid oder Magnesiumsilikat vorzuziehen. Noch bevorzugter ist das Eluieren des Zeaxanthins mit einem chlorierten Kohlenwasserstoff, insbesondere Methylenchlorid oder Dichlorethylen oder einem Di-Niederalkylether, insbesondere Diethylether. Alternativ dazu kann das getrocknete Pulver mittels überkritischer Extraktion mit CO&sub2;-Gas unter hohem Druck extrahiert werden.
Das durch Flavobacterium gebildete Pigment besteht aus bis zu 95-99% Zeaxanthin. Tests zeigen, daß durch Flavobacterium erzeugtes Zeaxanthin mit aus Zea-Mais isoliertem Zeaxanthin identisch ist.
Die fast pigmentfreie Zellmasse, die nach der Extraktion des Zeaxanthins verbleibt, kann als ideale Quelle von Proteinen (essentiellen Aminosäuren wie Methionin und Lysin) und Vitaminen (insbesondere Vitaminen der B-Gruppe, vor allem Vitamin B&sub1;&sub2;) für die Geflügelzucht dienen.
Die vorliegende Erfindung enthält auch Mutanten und Varianten von F.multivorum mit im wesentlichen gleichen toxonomischen Eigenschaften wie der in Beispiel 4 gezeigte AFB-44-Stamm. Wie bereits erwähnt, können Mutationen durch herkömmliche Verfahren hervorgerufen werden.
Alle in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Publikationen legen Zeugnis über die Kompetenz der Fachleute auf dem Gebiet ab, zu dem die Erfindung zählt.
Obwohl die Erfindung in veranschaulichender und beispielhafter Weise beschrieben wurde, um ihr Verständnis zu fördern, ist zu beachten, daß innerhalb des Schutzbereichs der beiliegenden Ansprüche bestimmte Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können.

BEISPIELE

Beispiel 1. Isolation von F.multivorum

Proben aus der Umwelt wurden hinsichtlich gelborange pigmentierter Bakterien gescreent, indem die Proben direkt auf eine Petriplatte mit Agarmedien aufgestrichen wurden (2,0% Agar, 0,02% Trypticase-Sojabrühe, 0,01% Hefeextrakt und 0,25% Natriumchlorid). Außerdem wurden Proben unter Beleuchtung in wassergefüllten Whirl- Pack-Taschen 3 Tage lang bei Raumtemperatur als Anreicherungsverfahren (mit 0,5% Natriumchlorid) vor dem Aufstreichen auf Agar inkubiert. Pigmentierte Stämme aus einigen Kultursammlungen aus der ganzen Welt wurden auf Trypticase-Soja-Agar + 1% Hefeextrakt-Schrägkultur gehalten. Der beschriebene F. multivorum-Stamm AFB-44 wurde aus einer Frischwasserquelle in der Nähe von High Ridge, Missouri, USA isoliert.
Hunderte auf diese Weise isolierte oder aus Kultursammlungen erhaltene Stämme wurden dann in eine Pigment-Screeningbrühe geimpft (autoklaviert bei 121 ºC; 30 Minuten):
Trypticase-Soja-Brühe 1,0%
Pyridoxin 0,001%
Casiton 0,25%
Dinatriumphosphat 1,0%
Hefeextrakt 0,25%
Maisquellwasser 0,1%
Methionin 0,1%
Eisen(II)sulfat 0,01%
Mg&spplus;&spplus;-Sulfat 0,01%
Mn&spplus;&spplus;-Sulfat 0,01%
Zn&spplus;&spplus;-Sulfat 0,01%
Thiamin 0,01%
Glyzerin 0,5%
pH 7,8
Kulturen wurden bei 25ºC unter Beleuchtung 72 Stunden lang oder bis zum Eintreten von ausreichendem Wachstum inkubiert und durch Pelletieren unter Zentrifugieren (25.000 rcf) geerntet. Sie wurden als 50 ml-Chargen in 300 ml-Einbeulkolben bei 250 U/min auf einem Rollinkubator/mischer gezüchtet. Pellets wurden gefroren und dann mit Aceton extrahiert. Zentrifugierte Extrakte wurden anschließend getrocknet, in Hexan aufgenommen und auf eine Aluminiumoxid-Chromatografievorrichtung aufgebracht, die für das AOAC-Verfahren für Xanthophylle entwickelt worden war [Quackenbush et al., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 56: 748-753 (1973)]. Verschiedene Fraktionen wurden gesammelt, insbesondere Dihydroxycarotinoide, und hinsichtlich Absorptionsmaxima durch ein Beckman -Scanningspektrophotometer abgetastet.
Von den Tausenden Ausgangsisolaten erzeugen 12 Isolate ein ähnliches Absorptionsspektrum und eine ähnliche chromatografische Retention wie Zeaxanthin. Diese Isolate wuden gezüchtet, extrahiert und einem Experten außer Haus zur Authentisierung durch Umkehrphasen-HPLC vorgelegt [Quackenbush F., J. Lig. Chrom. 10(4): 643-653 (1988)]. Eine Kultur produzierte eine relativ reine Ausbeute von Zeaxanthin als ihr Hauptpigment (95%).
Diese Kultur wurde vertraulich zwei unabhängigen Laboratorien zur taxonomischen Aufarbeitung vorgelegt. Beide Laboratorien kamen zum Schluß, daß die Kultur zuvor beschriebenen, Zeaxanthin produzierenden Bakterien nicht ähnelte. Der Kulturstamm wurde als ein Flavobacterium multivorum-Stamm charakterisiert. Dies war der erste Bericht der Zeaxanthin-Herstellung durch diese Spezies.

Beispiel 2. Kultivierung von Flavobacterium multivorum

Die Kultur wird auf einem Schrägrohr von Zählplattenagar gehalten. Diese Schrägkulturen werden geimpft und dann 24 Stunden lang bei 30ºC inkubiert. Vorratsschrägkulturen werden in einem Kühlschrank gelagert, um als Impfmaterial für flüssige Medien verwendet zu werden.
Das flüssige Medium besitzt die folgende Zusammensetzung:
Das Nährstoffmedium wurde mit konzentriertem (10N) Natriumhydroxid auf einen pH Wert von 7,6 eingestellt. Das Medium wurde dann auf etwa 85ºC erhitzt und 30 Minuten lang bei diesem Wert gehalten; dies ermöglichte die enzymatische Hydrolyse der Stärke zu Dextrin. Das erhitzte Medium wurde anschließend 30 Minuten lang bei 121ºC sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde das Medium aus einer wie oben gebildeten Vorratsschrägkultur oder aus einer zuvor geimpften Brühenkultur, die etwa 24 Stunden alt ist, geimpft. Die Menge des Impfmaterials beträgt etwa 5% V/V.
Die Wachstumsbedingungen für das geimpfte Nährstoffmedium waren wie folgt: Temperatur 30ºC, pH-Wert 7,2, Dauer 36 Stunden, Menge an Impfmaterial 5 Gew.-%, kontinuierliche Belüftung. Die Belüftung erfolgt bei 200 U/min in einem Schüttelinkubator mit 300 ml Erlenmeyer-Einbeulkolben mit 30 ml Medium oder in einem Fermentierer unter Rühren bei 400 U/min, der Luft bei einer Rate durchperlen läßt, die ausreicht, eine Menge an aufgelöstem Sauerstoff von 50% Sättigung aufrechtzuerhalten. In diesem Versuch betrug die Durchperlrate etwa 0,25 VVM.
Nach etwa 12-stündiger Inkubation wurden Lipase und Glucoamylase zugegeben (in geringen Mengen, etwa 0,03 Gew.-% des Mediums bzw. 30 Lipase-Einheiten und 6 AG- Einheiten pro Liter Fermentationsmedium).
Nach Abschluß der Fermentation wurden Flavobacterium multivorum-Zellen nach der Zugabe von 0,006 g/l bis 0,01 g/l Bentonit und 0,16 g/l bis 0,4 g/l CaCl&sub2; durch Zentrifugieren aus dem Medium geerntet. Das Medium wurde anschließend auf 50ºC erwärmt, um lebensfähige Zeilen zu töten, und die Kulturbrühe dann zentrifugiert, um eine dicke Paste gepackter Zeilen und unverbrauchter Medienfeststoffe zu gewinnen. Die Zellpaste wurde dann erneut aufgeschlämmt, und es wurden EDTA (0,2%), Tocopherolacetat (0,015%), BHA (0,05%) und Tween 80 (0,1%) zur Aufschlämmung zugegeben. Diese wurde homogenisiert und für weitere Verwendungen getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde danach für Fütterungstests bei Legehühnern und als Brathühner vorgesehenen Hühnern verwendet. Die getrocknete Biomasse wurde zwei Monate lang bei Raumtemperatur gelagert, um einen Lagerbeständigkeitsversuch zu simulieren.

Beispiel 3

Der folgende Versuch diente dazu, die Vorteile des vorliegenden Verfahrens gegenüber dem Wachstum auf anderen in der Literatur und in Patenten beschriebenen Medien aufzuzeigen.
Medien mit den folgenden Zusammensetzungen wurden formuliert, autoklaviert, gekühlt und mit einem Stamm von F.multivorum geimpft (siehe oben).
Medien A, B und C sind in den Patenten im Abschnitt über einschlägige Literatur Patenten beschrieben. Medien D und E sind Nährstoffmedien der Erfindung.
* Getrennt sterilisierte Glukose
** Amylase war Termamyl (120L Novo Inc.)
*** Lipase war Palatase (A 750L Novo Inc.) Filter, sterilisiert und nach 12 Stunden zugegeben. Glucoamylase war (AMG 200L, Novo Inc.) Filter, sterilisiert und nach 12 Stunden zugegeben.
**** Ausgangsmaterial für Seife in Form von Maisöl anstelle von Pflanzenöl mit gleichem Gewicht.
Alle pH-Werte wurden auf 7,5 eingestellt und durch periodische Überprüfungen bei diesem Wert gehalten. Nur Medium C erforderte eine wesentliche Einstellung. Alle Medien wurden bei 121ºC 30 Minuten lang autoklaviert, mit Ausnahme von D und E, die zusätzlich 30 Minuten lang knapp vor der Sterilisation bei 80-90ºC gehalten wurden. Alle Medien mit Ausnahme von E und F wurden bei 5% V/V mit dem AFB 44- Stamm geimpft und auf einem Drehschüttler bei 250 U/min 24 Stunden lang bei 30ºC und dann 24 Stunden lang bei 26ºC vor dem Zentrifugierernten inkubiert. Medien E (mit der Mutante) und F wurden getrennt mit einer Mutante aus dem AFB-44-Stamm geimpft; in diesem Fall wurden die in Medien E und F gezüchteten Mutanten 32 Stunden lang bei 30ºC inkubiert. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle veranschaulicht. Ergebnisse
N.D. = Nicht bestimmt
Die Zellausbeuten wurden durch zehnminütiges Zentrifugieren bei 20.000 xg, Dekantieren des Überstands und Trocknen des resultierenden Pellets bei 105º über einen Zeitraum von 24 Stunden bestimmt. Die echten Zellausbeuten wurden durch Zentrifugieren bei 3.000 xg zur Entfernung von unlöslichen Fermentationsstoffen und anschließendes Trocknen dieses Pellets bestimmt; das Trockengewicht des Pellets wurde von den regulären Zellausbeutewerten subtrahiert. Zeaxanthin wurde durch Extrahieren des gefrorenen Zellpellets mit Aceton und Ablesen des O.D.&sub4;&sub5;&sub0; der zentrifugierten Extrakte auf einem Spektrophotometer errechnet. Diese abgelesenen Werte wurden dann mit geeigneten Faktoren bezüglich Extinktionskoeffizient und Verdünnungseffekte multipliziert.
Zusätzlich wurde Medium D dazu verwendet, andere F.multivorum-Stämme zu kultivieren, um aufzuzeigen, daß das Nährstoffmedium der Erfindung mit anderen F.multivorum-Stämmen funktioniert und daß es zu einer verbesserten Zeaxanthin- Ausbeute führt.
Medium D wurde mit Stämmen K2361 oder K1180 geimpft (in Beispiel 4 beschrieben) und wie in Beispiel 2 kultiviert. K2361 lieferte eine Roh-Zellausbeute von 25 g/l, eine echte Zellausbeute von 13 g/l und 11 µ/ml Zeaxanthin. K1180 lieferte eine Roh- Zellausbeute von 24,5 g/l, eine echte Zellausbeute von 12,5 g/l und 4 µ/ml Zeaxanthin. Die Ergebnisse für K2361 zeigten, daß das erfindungsgemäße Nährstoffmedium die Zellausbeute und die Menge an duch einige Stämme von F.multivorum erzeugtem Zeaxanthin verbessert. Die Ergebnisse für K1180 zeigen, daß das wirtschaftlichere Nährstoffmedium der Erfindung etwa die gleiche Zellausbeute und Menge an Zeaxanthin liefert wie teurere Nährstoffmedien.
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, daß mit dem AFB-44-Stamm von F.multivorum:
a) Medien D und E (der Erfindung) deutlich höhere Zellausbeuten und Zeaxanthin- Ausbeuten liefern als die in der Patentliteratur beschriebenen Medien A, B und C;
b) Medien C und E anfangs zwar einen etwa gleichen Feststoffanteil besitzen, Medium E aber eine bessere Ausbeute von Zellen und Pigment liefert;
c) Medien A, B und C im Vergleich zu D und E sehr teuer sind, die letzteren aber bessere Ausbeuten ergaben;
d) durch Verwendung von Mutanten des AFB-44-Stamms (an Medium A angepaßt) sehr hohe Zell- und Pigmentausbeuten in Produktionszeiträumen von nur 32 Stunden möglich sind, d.h. das Wachstum schneller ist. AFB-44-Mutanten in Medium E führten zu den höchsten je erzielten Zell- und Pigmentausbeuten;
e) Ausgangsmaterial für Seife - bei gleichbleibender Zeaxanthin-Ausbeute - an die Stelle von Pflanzenöl treten kann.

Beispiel 4. Vergleich zu anderen Flavobacterium-Mikroorganismen

Ein Isolat von Flavobacterium multivorum (AFB-44) wurde taxonomisch mit anderen Flavobacterium-Spezies verglichen: ATCC 21 588 (oder 21 588L) und ATCC 11947 werden in US-Patenten 3.841.967, 3.951.742 und 3.951.743 beschrieben. ATCC 21081 wird in US-Patenten 3.891.504 und 3.841.967 geoffenbart Man beachte, daß die patentierten Stämme ATC 21588 und 21081 gemäß dem neuen taxonomischen Schema der 1984-Ausgabe des Bergey's Manual nicht unter die Flavobacterium-Gattung fallen würden.
ATCC Nr. 21081 unterscheidet sich bezüglich seiner erforderlichen Wachstumstemperatur und seines Salzbedarfs deutlich vom AFB-44-Stamm.
ATCC Nr. 21588 unterscheidet sich hinsichtlich zahlreicher Fermentations- und Verwendungsmuster insofern deutlich von F.multivorum, als F.multivorum-Stämme bei 35ºC und in Motilitäts-Nitratagar und Infusionskulturbrühe gut wachsen, während dies für ATCC 21588 nicht zutrifft. Außerdem ist ATCC 21588 im Gegensatz zu F.multivorum penicillin- und vancomycinempfindlich. ATCC 21 588 war auch LANA- negativ und konnte keine sporenartigen Strukturen bilden; beide Eigenschaften sind für die Flavobacterium-Gattung untypisch.
Die Taxonomiebestimmung wurde durch einen anerkannten Experten auf dem Gebiet der Taxonomie pigmentierter Bakterien durchgeführt. Seine Schlußfolgerungen, wonach der F.multivorum-Stamm von ATCC 11947, 21081 oder 21588 deutlich zu unterscheiden ist, wurden durch ähnliche Schlußfolgerungen der Abteilung für mikrobielle Taxonomie der American Type Culture Collection untermauert.
* Meeresagar
ATCC Nr. 21081 ist ein gramnegatives Stäbchen und in einer nassen Umgebung nichtmotil. Seine Wachstumseigenschaften sind nicht jene der Gattung Flavobacterium, wie sie derzeit durch Holmes et al. in Bergey's 1984-Manual beschrieben sind, stimmen jedoch mit einem Teil der Taxonomie von Weeks' Flavobacterium-Abschnitt II in Bergey's Manual des Jahres 1974 überein. Es hat einen absoluten Bedarf an NaCl und kann bei 30ºC nicht wachsen.

Beispiel 5. Vergleich von F.multivorum-Stämmen

Der ursprüngliche AFB-44-Stamm wurde nach der oben beschriebenen Isolation als Zeaxanthin produzierendes Bakterium identifiziert. Nach anfänglichen Vergleichen mit bekannten Flavobacterium-Stämmen wurde bestimmt, daß er sich in deutlich unterschied und als F.multivorum klassifiziert werden sollte. Während des anfänglichen umfangreichen Screeningverfarhens handelte es sich um den einzigen Flavobacterium- Stamm, der als zeaxanthinproduzierend identifiziert werden konnte. Dies umfaßte die gesamten Sammlungen der Flavobacteri um/Cytophaga-Gruppe aus fünf öffentlichen Sammlungen der ganzen Welt. Die Anmelder schlossen daraus, daß Zeaxanthin produzierende pigmentierte Bakterien sehr selten sind. Nach der Identifizierung des vorliegenden Organismus wurde bestimmt, daß zusätzliche F.multivorum-Stämme überprüft werden sollten. F.multivorum-Stämme aus der Sammlung des Instituts für Mikrobiologie der UCLA, Nr. K-1213, K-1204, K-1180, K-2361, K-2303, wurden wie folgt mit Stamm AFB-44 verglichen. Die Stämme wurden auf PCA-Schrägkulturen gezüchtet, in ein flüssiges Medium eingeimpft und 24 Stunden lang bei 30ºC sowie 48 Stunden lang bei 24ºC auf einem Rüttler mit Hin- und Herbewegung in Einbeulkolben gezüchtet, bevor sie durch Zentrifugieren geerntet wurden. In diesem Versuch wurde auch Beleuchtung angewendet. Die Proben wurden mit Aceton aus den gefrorenen Pellets extrahiert und der Extrakt unter N&sub2;-Gas getrocknet, in Hexan aufgenommen und auf eine neutrale Aluminiumoxid-Säulenchromatografievorrichtung aufgebracht. Zunehmende Aceton/Hexan-Verhältnisse dienten der Fraktion ierung; mit Hilfe spektrophotometrischer Scans wurden die Absorptionsmaxima jeder Fraktion überprüft. Es wurden die folgenden Ergebnisse erzielt.
Die Daten zeigten, daß:
a) andere F.multivorum-Stämme überraschenderweise Zeaxanthin produzieren;
b) offenbar jeder F.multivorum-Stamm eine quantifizierbare Pigmentmenge bildet (in diesem Versuch konnte jedoch nicht aufgezeigt werden, daß K-2303 quantifizierbares Pigment erzeugt - er ist somit ein schwacher Pigmentierbildner; die Produktion von Zeaxanthin konnte nicht bestimmt werden);
c) der wilde Stamm von AFB-44 mehr Pigment produziert und zu einem besseren Verhältnis zwischen Zeaxanthin und den gesamten Karotinoiden führt als die anderen Stämme;
d) - wie aus der Säulenchromatografie ersichtlich - das durch alle Stämme (mit Ausnahme von K-2303) produzierte Dihydroxykarotinoid offenbar vor allem Zeaxanthin ist;
e) öffentlich erhältliche F.multivorum-Stämme Zeaxanthin produzieren;
f) eine bisher unbekannte Gruppe von Flavobacterium eine Neigung zu Zeaxanthin als gemeinsames Pigment ihrer Zellzusammensetzung aufweist.

Beispiel 6. Futtermittel untersuchungen, die die verstärkte biologische Verfügbarkeit, Stabilität und Pigmentierungsleistung einer Biomassezusammensetzung im Vergleich zu aktuellen kommerziell verarbeiteten Pigmentquellen aufzeigen

Eine Biomassezusammensetzung, die wie in Beispiel 2 gebildet und 2 Monate lang bei Raumtemperatur gelagert worden war, wurde an als Brathühner vorgesehene Hühner verfüttert und mit stabilisierten und verseiften Ringelblumenextrakten verglichen. Die Grundkost war wie folgt: ERGEBNISSE:
* Durch 5 Bewerter subjektiv mittels des Roche-Farbfächers (Unterschenkel- Farbergebnisse) beurteilt
** Ähnliche Ergebnisse (Wirksamkeit) wurden mit zwei anderen führenden Ringelblumenextrakten erzielt.
Die Ergebnisse zeigen, daß es keine nachteiligen Auswirkungen auf die Hühner gibt und 10 ppm Xanthophyll aus der Biomassezusammensetzung biologisch verfügbar ist und 25 ppm Xanthophyll aus Ringelblumenextrakt entspricht, der besten natürlich stabil isierten und verarbeiteten handelsüblichen natürlichen Quelle von Xanthophyllen. Das Xanthophyll muß biologisch verfügbar sein, um eine verbesserte Pigmentierung zu zeigen, und scheint auch leichter zu pigmentieren. Diese Ergebnisse beschreiben eine mikrobielle Pigmentzusammensetzung, die - ohne die Notwendigkeit teurer Extraktionsund Verseifungsverfahren - eine überraschend gute Stabilität und biologische Verfügbarkeit aufwies. Außerdem lassen sich in den Wachstumsdaten keine schädlichen Auswirkungen feststellen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Zeaxanthin enthaltenden Zusammensetzung, umfassend:

das Kultivieren eines Flavobacterium multivorum-Mikroorganismus oder von Mutanten oder Varianten davon in einem Nährstoffmedium, das zumindest eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und zumindest eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff enthält,

worin das Kultivieren des Mikroorganismus zur Herstellung einer Kultur führt, die eine Zeaxanthin enthaltende Zellmasse und restliches Nährstoffmedium enthält,

sowie das Gewinnen von Zeaxanthin aus der Kultur.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das weiters das Abtrennen der Zeaxanthin enthaltenden Zel Imasse vom Nährstoffmedium umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, das weiters das Abtrennen von Zeaxanthin aus der Zellmasse umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Zeaxanthin aus der Kultur als Zellpaste gewonnen wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Flavobacterium multivorum oder eine Variante oder Mutante davon folgende taxonomische Eigenschaffen aufweist: penicillinunempfindlich, vancomycinunempfindlich und polymyxinunempfindlich; stark oxidasepositive, katalasepositive, gram negative Stäbchen; nicht beweglich; stark saccharosepositiv, mannitnegativ; und ethanolnegativ; harnstoffpositiv; und nichtproteolytisch.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Verfahren zumindest 40 g/l Zeaxanthin enthaltende Zeilen ergibt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Nährstoffmedium Maisquellwasser oder andere Quellen für assimilierbaren Stickstoff und eine enzymatisch behandelte Kohlenstoffquelle enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Enzym α-Amylase ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Glukosespiegel in den Medien geringer als etwa 0,035 Gew.-% ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mais, Reis, Milo, Weizen, aus diesen Getreiden gewonnenen Mehlen, aus diesen Getreiden gewonnenen Stärken, Maltodextrin und Glukose besteht.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Quelle für assimilierbaren Stickstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Maisquellwasser, hydrolysiertem Kasein, hydrolysierten Sojabohnen, Ammoniumphosphat und Ammoniumsulfat, Ammoniak, Hefeextrakt, einem Proteinhydrolysat und einem Hydrolysat einer Flavobacterium-Biomasse besteht.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Kultivierungsschritt in einem Temperaturbereich von etwa 16 bis 38ºC, in einem pH-Bereich von etwa 6,0 bis etwa 8,5 und etwa 24 bis etwa 72 h lang durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Verfahren nach etwa 32 h im wesentlichen abgeschlossen ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Nährstoffmedium eine wäßrige Lösung ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Kultivieren zwischen etwa 22ºC und etwa 34ºC durchgeführt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Kultivieren in einem pH Bereich von etwa 6,5 bis etwa 8,0 durchgeführt wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Kultivieren in etwa 24 bis etwa 72 h durchgeführt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Verfahren nach etwa 32 h im wesentlichen abgeschlossen ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das weiters das Zugeben von Enzymen zum Nährstoffmedium während des Kultivierens umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin das Enzym Glukoamylase, Lipase oder ein Gemisch daraus ist.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin den Nährstoffmedien ein Pigmentbildungsverstärker zugegeben wird.

22. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Zeaxanthin von der Zellmasse durch

Digerieren der Zellmasse mit einem inerten organischen Lösungsmittel zum Auflösen des Zeaxanthins; und

Entfernen des Lösungsmittel vom Zeaxanthin abgetrennt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin das Lösungsmittel durch Verdampfen vom Zeaxanthin abgetrennt wird.

24. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nährstoffmedium etwa 1 Gew.-% bis etwa 7 Gew.-% Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und von etwa 3 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-% Quelle für assimilierbaren Stickstoff enthält.

25. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem nach dem Kultivierungsschritt Zeaxanthin durch Lösungsmittelextraktion von den Mikroorganismuszellen extrahiert wird.

26. Verfahren nach Anspruch 1, das zusätzlich

das Abtrennen der Zellmasse von der Fermentationsflüssigkeit zur Bildung einer Zellpaste;

das Aufschlämmen der Paste;

das Homogenisieren der Paste; und

das Trocknen der Paste umfaßt.

27. Verfahren nach Anspruch 26, worin die Paste in Schutzmitteln und einem Emulgator aufgeschlämmt wird.

28. Verfahren nach Anspruch 27, worin die Schutzmittel Antioxidantien, Chelatbildner oder Gemische daraus sind.

29. Verfahren nach Anspruch 26, worin die Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff enzymatisch behandelt ist.

30. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mais, Reis, Milo, Weizen, aus diesen Getreiden gewonnenen Mehlen, aus diesen Getreiden gewonnenen Stärken, Maltodextrin, Mehlen und Stärken sowie Glukose besteht; und worin die Quelle für assimilierbaren Stickstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Maisquellwasser, hydrolysiertem Kasein, hydrolisierten Sojabohnen, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniak, Hefeextrakt, einem Proteinhydrolysat und einem Hydrolysat einer Flavobacterium- Biomasse besteht.

31. Futtermittel-Zusammensetzung, umfassend nicht-lebensfähige Zeaxanthin enthaltende Flavobacterium multivorum-Zellen sowie verbleibende Zellreste und unverbrauchte Nährstoffmedium-Feststoffe, die aus der Fermentation von Flavobacterium multivorum-Zellen gewonnen wurden.

32. Zusammensetzung nach Anspruch 31, die eine Geflügel-Futtermittelzusammensetzung, Lachs-Futtermittelzusammensetzung oder Lebensmittelfärbezusammensetzung ist.

33. Futtermittel-Zusammensetzung, die Zeaxanthin enthaltende Flavobacterium multivorum-Zellen und ein Nährstoffmedium umfaßt.

34. Zusammensetzung nach Anspruch 33, worin die Zusammensetzung eine Geflügel- Futtermittelzusammensetzung ist.

35. Verwendung von Flavobacterium multivorum-Zellen bei der Herstellung einer Futtermittel-Zusammensetzung.