DE2402217A1

DE2402217A1 - Verfahren zur herstellung von proteinmaterial auf mikrobiologischem wege

Info

Publication number: DE2402217A1
Application number: DE2402217A
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Fukita; Toyozoo Katsura; Yukio Tanigawa; Hiroo Wada; Junichi Yoshikawa
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1973-01-17
Filing date: 1974-01-17
Publication date: 1974-07-25
Also published as: US3901762A; JPS5714833B2; DE2402217B2; FR2213980B1; GB1444072A; FR2213980A1; DE2402217C3; IT1044732B; JPS4993589A

Description

SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED
Osaka, Japan

"Verfahren zur Herstellung von Proteinmaterial auf mikrobiologischem Wege"

Priorität: 17. Januar 1973, Japan, Nr. 820^/1973

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinmaterial auf mikrobiologischem Wege unter Verwendung von Methanol als Kohlenstoffquelle.

Der Proteinbedarf für die ständig anwachsende Weltbevölkerung kann in naher Zukunft nicht mehr allein aus natürlichen Quellen gedeckt werden. Für das Jahr 2000 wird der Fehlbetrag auf etwa 18 000 000 Tonnen geschätzt. Es wurden daher verschiedene Ver-. suche durchgeführt, Proteine aus Erdölprodukten, insbesondere aus n-Paraffinen, auf mikrobiologischem Wege herzustellen. Aus bekannten Gründen ist aber Methanol, das sich aus Erdöl billig in großtechnischem Maßstab herstellen läßt, bei der fermentativen Herstellung von Proteinmateriäl den genannten Petroleumpro-

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dukten vorzuziehen. Es sind verschiedene Methanol verwertende Mikroorganismen bekannt; vgl. Advance in Microbial Physiology, Bd. 7 (1972), S. 119 sowie JA-AS 2J 393/1972 und JA-OS 14 389/ 1972.

Aufgabe der Erfindung ist es, Mikroorganismen zur "Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe aus Methanol Proteinmaterialien billig und in hohen Ausbeuten hergestellt werden können.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Proteinmaterial durch Züchtung von Methanol verwertenden Mikroorganismen in einem Methanol als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium und Abtrennen des angereicherten Proteinmaterials aus der Gärmaische, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismen Stämme von Pseudomonas utilis oder Pseudomonas inaudita verwendet.

Bevorzugte Beispiele für Pseudomonas-Stämme, die sich im erfindungsgemäßen Verfahren verwenden lassen,sind Pseudomonas utilis Nr. 22 FERM-P 1690, Pseudomonas utilis Nr. 133 FERM-P. 1691, Pseudomonas inaudita Nr. 200 FERM-P 1692, Pseudomonas inaudita Nr. 3OO FERM-P 1693 und Pseudomonas inaudita Nr. 400 FERM-P 1694. Die erstgenannten Nummern beziehen sich auf die Sammlung des Takarazuka-iOrschungslaboratoriums der Sumitomo Chemical Company, während die letztgenannten Nummern Hinterlegungsnummern beim Fermentation Research Institute, Agency of. Industrial Science and Technology, in Chiba-shi, Chiba-ken, Japan sind.

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Die taxönomischen Eigenschaften der Stämme Pseudomonäs utilis Nr. 22 und Nr. 133 sind in Tabelle I zusammengestellt. Das Nährmedium hat die folgende Zusammensetzung: 5 "bis 1.0 g Diammoniumhydrogenphosphat, 2 g Kaliumchlorid, 0,2 g Magnesiumsulf at-heptahydrat, 0,1 g Natriumchlorid, 0,02 g Eisen(II)-sulfat, 0,01 g Mangansulfat, 0,01 g Kobaltnitrat, 0,01 g Calciumsulfat, 0,01gKupfersulfat, 0,01 g Zinksulfat, 1 Liter Wasser und 10 bis 20 ml Methanol. Die Pigmentbildung wird an King-Medien A und B untersucht. Die Verwertung von Kohlenstoffquellen wird unter Verwendung eines Hugh-'LeIf son-Mediums und eines Mediums der vorgenannten Zusammensetzung, das .anstelle von Methanol 0,5 Gewichtsprozent der zu untersuchenden Kohlonstoffquelle enthält, untersucht, wobei das Fehlen eines sichtbaren Wachstums des Mikroorganismus nach 14-tägiger Züchtung bei 3O⁰C als negativ gewertet wird.

bei 30°C

Tabelle I

Morphologische Eigenschaften
Nach 24- bis 4-Sstündiger Züchtung/auf einem Agar-Schrägröhrchen (2 Prozent Methanol und die vorstehend genannten anorganischen Salze) lassen sich Bazillen von 0,5 χ 1,0 - 1,5/1 Größe beobachten. Die Bazillen sind beweglich und weisen polare Geißeln auf. Sie sind gram-negativ. Sporen - und Kapselbildung treten nicht auf.

Züchtungseigenschaften

Kolonien auf einem 2 Prozent Methanol und die anorganischen Salze enthaltenden Nährmedium: rund, glatt und flach,

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glattrandig, flach konvex, gelblich-weiß, glänzend,

durchscheinend.

Kolonien auf Bouillon-Agar : schwaches Wachstum, rund, glatt und flach, feucht, gelblich-itfeiß, glänzend.

Agar-Schrägröhrchen mit 2 Prozent Methanol und den anorganischen Salzen: mäßiges Wachstum, fadenartig, gelblich-weiß, glänzend, undurchsichtig.

2-Prozent Methanol enthaltendes Bouillon-Agar-Schrägröhrchen : gutes Wachstum, fadenartig, gelblich-weiß, undurchsichtig, keine Veränderung des Nährmediums. . , Bouillon-Agar-Schrägröhrchen: mäßiges Wachstum. Bouillon: gutes Wachstum, leicht trüb.

Physiologische Eigenschaften

Wachstumstemperatur: 20 bis 35°C, optimale Wachstumstemperatur:

25 bis 30⁰C.

Wachstum bei pH-Wert: 5,0 bis 9,0, kein Wachstum bei 4,0.

Sauerstoffbedarf: aerob.

Lackmus-Hilch: keine Veränderung oder leicht alkalisch.

BCP-Milch: keine Veränderung oder leicht alkalisch.

Gelatine : keine Verflüssigung.

Schwefelwasserstoff : keine Bildung

Indol: keine Bildung

Stärke: keine Hydrolyse

Nitrat : wird reduziert

Nitrat-Respiration: schwach
Catalase-Reaktion : positiv
Oxidase-Reaktion: positiv

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Urease-Reaktion: negativ
Pigment : keine Bildung

Voges-Proskauer-Test: negativ (kein Methanolzusatz) Methylrot-Test: negativ (kein Methanolzusatz) Citratverwertung: negativ
p-Hydroxybenzoatverwertung: negativ.

Verwertung von Kohlenstoffquellen: gute Methanolverwertung; folgende Kohlenstoffquellen werden im allgemeinen nicht verwertet : Äthanol, Propanol, Butanol, Ameisensäure, Essigsäure, Oxalsäure, Brenztraubensäure, Bernsteinsäure; Monomethylamin, Glucose, fructose, Arabinose, Xylose, Mannose, Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose, Sorbit, Mannit, Inosit, Glycerin und Stärke.

Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika: empfindlich gegen Penieillin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Erythromycin und SuIfaisoxazol; nicht empfindlich gegen Oleandomycin.

Herkunft : aus Bodenproben isoliert.

Nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7· Auflage, lassen sich die genannten Mikroorganismen in die Gattung Pseudomonas einordnen, da sie gram-negative, aerobe, bewegliche Bazillen mit polaren Geißeln sind und nur Methanol als Kohlenstoff quelle verwerten. Sie können jedoch nicht einer der dort beschriebenen Arten zugeordnet werden. Außerdem bilden die vor-genannten Mikroorganismen kein rotes'Pigment, was für die meisten der bekannten, Methanol.verwertenden Mikroorganismen charakteristisch ist. Unter den verschiedenen Arten der Gattung Pseudo-

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monas scheinen sie der Art Pseudomonas insueta (vgl. JA-AS 25 273/197Ο) und Pseudomonas methylotropha (JA-OS 14- 389/1972) relativ ähnlich zu sein. Von Pseudomonas insueta unterscheiden sich jedoch die vorgenannten, erfindungsgemaß verwendeten Stämme in der Färbung ihrer Kolonien und im Wachstum auf einem Methanol und anorganische Salze enthaltenden Agar-Medium. Von Pseudomonas. met.hylotropha unterscheiden sie sich in der Färbung der Kolonien, der Indolbildung, der Wachsturnstemperatur und der Verxvertung von Kohlenstoff quellen. Die genannten Stämme werden daher einer neuen "Art zugeordnet und als Pseudomonas utilis bezeichnet.

Die taxonomischen Eigenschaften von Pseudomonas inaudita Hr. 200, 3OO und Nr. 400 sind in Tabelle II zusammengestellt. In Bezug auf die Zusammensetzung des Nährmediums, die Pigmentbildung und die Verwertung von Kohlenstoffquellen wird auf Tabelle I verwiesen.

Tabelle II Morphologische Eigenschaften

bei 3O⁰C

Nach 24— bis 48stündiger Züchtung/auf einem 2 Prozent Methanol und die genannten anorganischen Salze enthaltendem Agar-Schrägröhrchen lassen sich Bazillen von 0,4- bis 0,6,,U χ 1,0 bis 1,5/u. Größe beobachten. Sie sind beweglich und v/eisen polare Geißeln auf. Ferner sind sie gram-negativ. Sporen- und Kapselbildv.ng werden nicht beobachtet.

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Züchtunj^seigenschaften

Kolonien auf einem 2 Prozent Methanol und anorganische Salze enthaltenden Agar-Medium: rund, flach und glatt, glattrandig, flach konvex, milchig weiß, glänzend, durchscheinend.

Kolonien auf Bouillon-Agar : leichtes Wachstum in Form von Flecken, die nach einigen Tagen verschwinden.

2 Prozent Methanol und die anorganischen Salze enthaltendes Agar-Schrägröhrchen: gutes Wachstum, fadenförmig, milchig-weiß, glänzend, durchscheinend.

Bouillon-Agar-Schrägröhrchen: sehr geringes Wachstum, Bouillon: kein Wachstum.

Physiologische Eigenschaften

V/achstumstemperatur : optimum 25 "bis 35°C; sehr geringes .oder kein Wachstum "bei 42°C Wachstum bei pH-Wert: 5,0 "bis 9,0; kein Wachstum "bei 4,0 Sauerstoffbedarf : aerob Lackmus-Milch: keine Veränderung oder leicht alkalisch BCP-Milch: 2-ceine Veränderung oder leicht alkalisch Gelatine : keine Verflüssigung Schwefelwasserstoff.: keine Bildung Indol: keine Bildung Stärke : keine Hydrolyse Nitrat : wird reduziert Nitrat-Respiration: positiv Catalase-Reaktion: positiv Oxidase-Reaktion:' positiv

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Urease-ßeaktion : positiv
Pigment: keine Bildung

Voges-Proskauer-Test: negativ (kein Methano3.zusatz ) Methylrot-Test: negativ (kein Methanolzusatz) Citratverwertung: negativ

p-Hydroxybenzoatverwertung: schwach positiv.

Verwertung von Kohlensto ff quellen : gute "Verwertung von Methanol; im allgemeinen keine Verwertung von Äthanol, Propanol, Buta* nol, Ameisensäure, Essigsäure, Oxalsäure, Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, Monomethylamin, Glucose, Fructose, Arabinose, Xylose, Mannose, Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose, Sorbit, Mannit, Inosit, Glycerin und Stärke. Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika; empfindlich gegen Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Erythromycin und SuIfaisoxazol; nicht empfindlich gegen Penicillin und Öleandomycin.

Herkunft:

aus Bodenproben isoliert.

Unter Bnrücksiotjt;igung von Bergey ' s Manual of Determinative Bacteriology, 7» Auflage, lassen sich die genannten Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas zuordnen, da sie gram-negatjve, aerobe, bewegliche Bazillen mit polaren Geißeln sind und nur Methanol als Kohlenstoffquelle verwerten» Sie können jedoch nicht einer der dort beschriebenen Arten zugeordnet v/erden. Außerdem bilden nie koin rotes Pigment, wie es die meisten der bekannten,Methanol verwertenden Mikroorganismen tun. Unter den verschiedenen Arten dor Gattung Pseudomonan r. ehe inen nie den

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vorgenannten Arten Pseudomonas insueta und Pseudomonas methylotropba relativ ähnlich, zu sein. Von Pseudomonas incueta unterscheiden sie sich jedoch in der Färbung der Kolonien, dem Wachstum auf Methanol und anorganische Salze enthaltendem Agar und der Verwertung von Kohlenstoffquellen. Von Pseudomonas methylotropha unterscheiden sie sich in der Indolbildung, dem Verhalten gegenüber Lackmus-Milch und der Verwertung von Kohlenstoffquellen. Außerdem sind die. vorgenannten Stämme der Art Methylomonas albus (vgl. Journal of General Microbiology, Bd. 61 (1970 )■> S. 205)ähnlich. Durch den großen Unterschied der entsprechenden Mindestverdopplungszeiten ergibt sich jedoch eine klare Unterscheidungsmöglichkeit. Die vorgenannten, erfindungsgemäß verwendeten Stämme v/erden deshalb als neue Art erachtet und als Pseudomonas inaudita bezeichnet.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können wäßrige Nährmedien, die Methanol als Kohlenstoffquelle und außerdem Stickstoffquellen und anorganische Salze und vorzugsv/eise wachstumsfordernde Substanzen, wie Vitamine,' enthalten, verwendet werden. Da Methanol in gewissem Umfang bacter.icid wirkt, d.h. eine antibiotische Wirkung entfaltet, muß auf die Konzentration des Methanols im'Nährmedium die entsprechende Sorgfalt gelegt werden. Beispielsweise wird bei absatzweiser Züchtung die Anfangskonzentration unter etwa 5 Gewichtsprozent gehalten. Mit fortschreitender Züchtung kann das Methanol von Zeit zu Zeit ergänzt werden. Bei einer kontinuierlichen Züchtung wird die Methanolkonzentrat iön in Abhängigkeit von der Bakterienkonzentration, der Konzentration der anderen Nährstoffquellen und dem Verdün-

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- ίο -

mingsgrad festgesetzt.

Beispiele für Stickstoffquellen sind anorganische -Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumphosphat, Ainmoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumnitrat sowie Harnstoff. Diese Stickstoff quellen v/erden im allgemeinen in Konzentrationen von etwa 0,1 bis 3 Gewichtsprozent verwendet. Wird'zur Einstellung des pH-Wertes Ammoniak verwendet, so kann es gleichzeitig als Stickstoffquelle dienen. Beispiele für anorganische Salze sind Salze von Phosphor, Kalium, Magnesium, Eisen, Natrium, Calcium, Mangan, Kobalt, Zink, Molybdän und Kupfer. Gegebenenfalls kann das Nährmedium auch weitere synthetische oder natürliche organische Substanzen, wie Vitamine, Aminosäuren, Maisquellflüssigkeit und Hefeextrakt enthalten.

Die Züchtung wird vorzugsweise-bei Temperaturen von etwa 20 bis

Bereich
40⁰C und in einem pH- / von etwa 5 bis 9 durchgeführt.

Die Züchtung kann unter Schütteln oder Belüftung absatzweise oder kontinuierlich durchgeführt v/erden. Bei der absatzweisen Züchtung wird das größte Mikroorganismenwachstum innerhalb von 12 bis 24 Stunden nach Züchtungsbeginn erreicht. Im Verlauf der absatzweisen Züchtung kann während der logarithmischen Wachs- tumsphase des Mikroorganismus auf ein kontinuierliches Verfah-

sgrad

ren mit einen: Verdünnung/von etwa 0,05 bis 0,6 umgestellt v/erden.

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Nach beendeter Züchtung wird die Zellmasse nach üblichen Verfahren, wie Zentrifugieren, Filtrieren oder Fällen, aus der Garmaische gewonnen. Gegebenenfalls kann die Zellmasse mit Wasser gewaschen und/oder zur Extraktion der Proteine weiter behandelt werden.

Die erhaltene Zellmasse -kann sterilisiert und anschließend nach üblichen Verfahren getrocknet werden, beispielsweise durch Trocknen unter vermindertem Druck, Sprühtrocknen oder Lyophilisieren*

Die feuchte oder trockene Zellmasse kann beispielsweise als Futterzusat-z verwendet werden·. Ferner kann die Zellmasse auch für alle weiteren üblichen "Verw endung s ζ wecke für Proteinmateria-Iieil eingesetzt werden»

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Pro ze nt angabe η auf das Gewicht-,

'Beispiel 1

*? g Diammoniumlxydrogenphosphat, 3 G Kaliumchlorid, 0,4 g Magnesiumsulfat, 0,2 £ Kaliumchlorid, 0,04 g Eisen(IJ)--sulfat, 0,02 g Mangansulfat, 0,01 g Calciumchlorid, 0,01 g Kobaltnitrat, 0,01 g Kupfersulfat und 0,01 g Zinksulfat werden in Wasser gelöst und auf ein Volumen von 1 Liter, gebracht. Die erhaltene Lösung wird in einen 2 Liter fassenden Glasfermenter gegeben, sterilisiert und bis zu einer Konzentration von 1 Prozent (Ge-

icht/Volumen) mit vorher sterilisiertem Hothanoi versetzt. Dn:j erhaltene Nährmedium wird mit Pseudombnas utilis Hr. 22 ino3-.n-

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liert und anschließend 16 Stunden bei 3O⁰C unter Einhaltung einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1 Liter/Liter/min gezüchtet, wobei der"pH-Wert mit 5p£ozentiger Ammoniaklösung auf 7,0 gehalten wird. Da mit fortschreitendem Wachstum des Mikroorganismus Methanol verbraucht wird, werden von Zeit zu Zeit jeweils 5 g Methanol zugesetzt. Die gesamte Methanolzugabe bis zur Beendigung der Züchtung beträgt 30 g. Die Zellmasse wird von der Gärmaische abzentrifugiert, sterilisiert und lyophilisiert. Man erhält 12,0 g getrocknete Zellmasse pro 1 Liter Nährmedium, was einer Ausbeute von 40 Prozent, bezogen -auf die zugesetzte Methanolmenge beträgt. Die Aminosäurezusammensetzung ist in Tabelle III angegeben.

Beispiel 2

Gemäß Beispiel 1 wird Pseudomonas utilis Nr. 135 gezüchtet. Man erhält 11,4 g getrocknete Zellmasse pro 1 Liter Nährmedium, was einer Ausbeute von 38 Prozent, bezogen auf die eingesetzte Metliano!menge entspricht. Der Rohproteingehalt (N χ 6,25) in den Zellen beträgt 73 >6 Prozent, Die Aminosäurezusammensetzung ist in Tabelle III aufgeführt.

Beispiel 3

Gemäß Beispiel 1 wird Pseudomonas inaudita Nr. 200 gezüchtet. Man erhält 12,5 g getrocknete Zellmasse pro 1 Liter Näh^medium, was einer Ausbeute von 42 Prozent, bezogen auf die eingesetzte Mefchanolmenge entspricht. Der Rohproteingehalt (N χ 6,25) in den Zellen beträgt 78,1 Prozent.

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Beispiel 4

Gemäß Beispiel 1 wird Pseudomonas inaudita Nr. 300 gezüchtet. Man erhält 12,3 g getrocknete Zellmasse pro 1 Liter N^hrmedlum, was einer Ausbeute von 41 Prozent, "bezogen auf die eingesetzte Methanolmenge entspricht. Der Rohproteingehalt ( Nx 6,25) in den Zellen beträgt 73 ί 8 Prozent.

Beispiel5

Gemäß Beispiel 1 wird Pseudomonas inaudita Nr. 400 gezüchtet. Man erhält 11,8 g getrocknete Zellmasse pro 1 Liter.Nährmedium, was einer Ausbeute von 39 Prozent', bezogen auf die eingesetzte Methanolmenge entspricht. Der Rohproteingehalt (N χ 6,25) in den Zellen beträgt 75,0 Prozent.

Beispielö

3 g Diammoniumhydrogenphosphat, 1 g Kaliumchlorid, 0,5 g Ammoniumsulfat, 0,5 g Magnesiumsulfat, 0,25 g Eisen(II)-sulfat, 0,1 g Natriumchlorid, 0,01 g Mangansulfat,0,01gCalciumchlorid, 0,01 g Kobaltnitrat, 0',01 g Kupfer sulfat und 0,01 g Zinksulfat werden in Waseer gelöst und auf ein Volumen von 1 Liter aufgefüllt. Diese Lösung wird in einen 2 Liter fassenden Glasfermenter gegeben, sterilisiert und bis zu einer Konzentration von 2 Prozent (Gewicht/Volumen) mit vorher sterilisiertem Methanol versetzt. Das erhaltene Nährmedium wird mit einer Anzuchtkultur von Pseudomonas inaudita Nr. 200 (hergestellt durch lOstündiges Züchten unter Schütteln .von 10 Prozent) inokuliert und anschließend unte'r Rühren und Belüften bei 34°C gezüchtet. Dabei wird die Sauerstoffkonzentration im Nähr-

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medium über 0,5 ppm und der pH-Wert durch Zusatz von lOprozentiger Ammoniaklösung auf 7,0 gehalten. Sobald das Methanol im Nährmedium verbraucht ist, d.h. wenn sich gaschromatographisch praktisch kein Methanol im Nährmedium nachweisen läßt, wird Methanol bis zu einer Konzentration von 0,2 Prozent (Gewicht/ Volumen) zugegeben. Ferner' wird während der Züchtung von Zeit zu Zeit portionsweise Magnesiumsulfat und Eisen(II)-sulfat zugegeben, wobei die Gesamtmengen dieser Salze bis zur Beendigung der Züchtung 1,5 bzw. 0,5 g betragen. Nach 16 Stunden wird die Züchtung unterbrochen. Die Gärmaische wird gemäß Bei-

spiel 1 aufgearbeitet. Man erhält' 35 > 5 g getrocknete Zellmasse pro 1 Liter Gärmaische, was einer Ausbeute von 36 Prozent, bezogen auf die eingesetzte Methanolmenge, entspricht.

Beispiel7

Gemäß Beispiel 6 wird Pseudomonas inaudita Nr. 200 absatzweise gezüchtet. Wenn die Konzentration der Zellen.(X) im Nährmedium 23 g/Liter erreicht, wird das absatzweise Verfahren auf ein kontinuierliches Verfahren umgestellt, wobei ein 5,5 Prozent (Volumen/Volumen) Methanol enthaltendes-.Nährmedium der folgenden Zusammensetzung kontinuierlich mit einer Verdünnung (D) von 0,3 zugesetzt wird: 4 ml Phosphorsäure, 2 g Kaliumchlorid, 0,5 g Ammoniumsulfat, 2 g Magnesiumsulfat, 0,2 g Natriumchlorid, 0,5 g Eisen(II)-sulfat, 0,01 g Mangansulfat, 0,01 gKobaltsulfat, 0,01 g Kaliumsulfat, 0,01 g Kupfersulfat, 0,01 g Zinksulfat und 55 ml Methanol, mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt. Entsprechend der Menge des zugesetzten Nährmediums wird kontinuierlich Gärmaische, entnommen, wobei der pH-Wert mit lOprozentiger Ammoniak-

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lösung bei 6,8 bis 7,2 gehalten wird. Bei dieser kontinuierlichen Züchtung ergibt sich eine Produktivität von DX = 6,9 g/Liter χ Std. Der Rohproteingehalt in der getrockneten Zellmasse beträgt 78,5 Prozent.'

Beispiel 8

Gemäß Beispiel 7 wird kontinuierlich mit einer Methanolkonzentration (d.h. dem Höchstwert) von 8,5 Prozent (Yolumen/Volumen) und einer Verdünnung (D) von 0,3 gezüchtet. Die Zellkonzentration (X) beträgt 25,5 g/Liter und die Ausbeute, bezogen auf

Methanol, 41 Prozent. Die erhalte'ne getrocknete Zellmasse enthält 78,5 Prozent Rohprotein, 6,12 Prozent rohes Fett, 3,18 Prorohe zent rohes faserartiges Material, 10 Prozent/Asche und 4,85 Prozent Wasser. Die Aminosäurezusammensetzung ist in Tabelle III aufgeführt.

Beispiel9

Gemäß Beispiel 7 wird Pseudomonas inaudita ITr. 300 gezüchtet. Die Züchtung wird zuerst absatzweise und anschließend kontinuierlich (D = 0,3, X = 21 g/Liter) durchgeführt, wobei eine getrocknete Zellmasse mit einem Rohproteingehalt von 78,2 Prozent erhalten wird. Die Aminosäurezusammensetzung ist in Tabelle III aufgeführt.

Beispiel 10

Gemäß·Beispiel 7 wird Pseudomonas inaudita Nr. 400 zuerst absatzweise und anschließend kontinuierlich (D = 0,3, X = 20,5 g/ Liter) gezüchtet, wobei eine getrocknete Zellmasse mit einem

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Rohproteingehalt von 80,1 Prozent erhalten wird. Die Aminosäurezusammensetzung ist in Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III

■.vBeispiel	■ 1 ·	2	8	9 ,	10
. Aminosäure
Tryptophan--	1,51	1,65	1,56	1,43	1.62
Lysin·	6-, 25	6,43	5,1	5,22	5,35
Histidin	2.,IO	2,51	1,36	1,42	1,51
Arginin	4,52	4,88	4,6	5,01	4,23
Asparaginsäure	9,31	9,57-	10,72	10,86	9j86
Threonin	4,91	4,58	4,02	3,96	4.10
Serin	4,72	3,62	3,02	3,52	4,00
Glutaminsäure	11,32	10,27	11,86	11,97	ll._f87
Prolin	4,01	3,55	3,50	3,23	3,22
Glycin	4,52	5,57	6_?58	5,97	5,92
Alanin·	7,89	6,70	8,05	8,22	8.31
Cystin	1,1 .	1,27	1,42	1,62	l.,58
Valin	5,40	5,32	5,38	5,40	5,72
Methionin.	l_f78	2,21	1,97	1,86	Ij99
Isoleucin	4,72	4,32	6,69	5,77	5,82
Leucin	6,91	6,93	6,02	6,31	6 ,11
Tyrosin«		2,92	2,60	2.56	2,86
Phenylalanin	4,50	3;64		3_:.42	3,47

Beispiel 11

4-0 drei Wochen alte Mäuse vom ICR-Stamm werden in zwei Gruppen, d.h. in eine Testgruppe und eine Kontrollgruppe eingeteilt. Beide Gruppen erhalten 5 Tage lang eine Diät, die aus 38 Prozent

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Maisstärke, 25 Prozent vitaminfreiern Casein, 10 Prozent ol-Weizenstärke, 8 Prozent pulverisierten Filterpapier, 6 Prozent Linolöl, 6 Prozent anorganischen Salzai, 5 Prozent granuliertem

besteht.

Zucker und 2 Prozent Vitaminen/Anschließend erhält die Kontrollgruppe weiterhin die vorgenannte Diät, während die Testgruppe mit einer Diät weiter gefüttert wird, die anstelle von 25 Prozent vitaminfreiern Casein nur 10 Prozent vitaminfreies Casein und zusätzlich 15 Prozent der nach dem erfindungsgemäßen Ver-

von Pseudomonas inaudita Nr.200 fahren hergestellten getrockneten Zellmasse/erfthält., Nach 2wöchiger Fütterung wird die Gewichtszunahme der Mäuse festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV

' Tage nach "Züch tung sbe ginn	durchschnitt.'L.Kör.per.gev/ichtszunahiiie	Testgruppe
0 2 4 8 12 14	Kontrollgruppe	' - 18,3 20,5 24,0 27,2 29,8 30,8
18,5 20,4 23,8 27,3 29,8 30.7

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß sich zwischen der Testgruppe und der Kontrollgruppe im wesentlichen keine Unterschiede in der Körpergewichtszunahme ergeben. Außerdem zeigen die beiden Gruppen keine Unterschiede in Bezug auf Glanz der Haare und den Zustand der Haut. Nach der Fütterung werden die Mäuse der Testgruppo seziert. Es lassen sich keine organischen Veränderungen fe..st st eilen.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von Proteinmaterial durch Züchtung von Methanol verwertenden Mikroorganismen in einem · , Methanol als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium und Abtrennen des angereicherten Proteinmaterials, dadurch gekennzeichnet , daß man als Mikroorganismen Stämme von Pseudomonas utilis oder Pseudomonas inaudita verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Pseudomonas utilis Hr. 22 FERM-P 1690, Pseudomonas utilis Nr. 133 .PERM-P 1691, Pseudomonas inaudita Nr. 200 FERM-P 1692, Pseudomonas inaudita Nr. 300 FERM-P 1693 oder'Pseudomonas inaudita Nr. 4-00 FERM-P 1694- verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem wäßrigen Nährmedium durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, das zusätzlich ein wachstumforderndes Mittel enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anfangskonzentration des Methanols im Nährmedium unter etwa 5 Gewichtsprozent liegt.

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6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen von etwa 20 bis 40⁰C durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einem pH-Wert von etwa 5 "bis 9 durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung absatzweise durchführt.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung kontinuierlich durchführt.

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