DE2239650A1

DE2239650A1 - Neues proteolytisches enzym und seine herstellung

Info

Publication number: DE2239650A1
Application number: DE2239650A
Authority: DE
Inventors: Andre Belloc; Jean Florent; Geb Courtillet Denise Mancy; Jean Verrier
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1971-08-12
Filing date: 1972-08-11
Publication date: 1973-02-22
Also published as: CH542925A; JPS4826980A; DK131514B; FR2149004A5; IT1001506B; US3875006A; DK131514C; SE387958B; GB1377105A; NL7210735A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues proteolytisches Enzym, das im folgenden mit der Nummer 25 462 RP bezeichnet wird, sowie sein Herstellungsverfahren.

Dieses neue Enzym kann durch Züchtung eines Mikroorganismus, der dem Genus Streptomyces angehört und mit "Streptomyces hygroscopicus DS 14 649" (NRRL 3999) bezeichnet wird, in künstlichen Medien erhalten werden.

Das Enzym 25 462 RP ist eine Proteinsubstanz, die in Form eines grauen amorphen Pulvers vorliegt. Dieses Produkt ist in Wasser sehr löslich, in konzentrierten Lösungen von Neutralsalzen (z.B. Ämmoniumsulfat) und in wässrig-alkoholischen oder wässrig-acetonischen Gemischen wenig löslich und in wasserfreien Alkoholen und Ketonen unlöslich.

Die proteolytische Aktivität des Enzyms 25 462 RP tritt bei einer grossen Zahl von Substraten protjeinischer Natur, wie beispielsweise Casein, Hämoglobin, Fibrin (Lyse von Blutgerinsel) und Milch (Koagulation), in Erscheinung..

Die Aktivität bei Casein wird nach einer Technik bestimmt, die von derjenigen abgeleitet ist, die Kunitz für die Bestimmung von

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Trypsin entwickelt hat /M. Kunitz, J. Gen. Physiol., 3K), 291 (1947.)7. Die im Verlaufe der Hydrolyse freigesetzten, in Trichloressigsäure löslichen Peptide werden durch Spektrophotometrie (optische Dichte bei 280 nm) bestimmt und in Tyrosin-Äquivalenten ausgedrückt. Die enzymatische Aktivität kann in Kunitz-Einheiten (K.E.) ausgedrückt werden: nach der Definition von Kunitz ist eine Einheit die Enzymmenge, die ausreichend lösliche Peptide in Freiheit setzt, um eine Erhöhung der optischen Dichte des Trichloressigsäurefiltrats bei 280 nm in 1 Minute um 1,0 zu erhalten.

In den nachfolgenden Tabellen I und II sind die für die Hydrolyse von Casein mit dem Enzym 25 462 RP bei verschiedenen pH-Werten und bei verschiedenen Temperaturen erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt. Für jeden Versuch wurden 22/Ug Enzym mit einem Gehalt von 2250 K.E./g_vd.h. 0,05 K.E. verwendet.

Tabelle I

Hydrolyse von Casein	bei 30°C durch das des pH-Werts	Il	Puffers	25 462 RP - Einfluss
pH des Reaktionsmediums	Art des	Il	0,1 m	in 20 Minuten freige setzte Peptide (mg Tyrosin-Äquivalente)
5,5	Phosphat	Il		0,230
6,0		It		0,288
6,5		Il		0,435
6,8				0,455
7,0				0,365
7,5			0,2 m	0,148
8,0	Borat			0,100
8,5	Il		0,085
9,0	M		0,060
9,5	Il		0,060

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Tabelle

II

Hydrolyse von Casein bei fluss	pH = 6,8 durch das 25 462 RP - Ein- der Temperatur
Temperatur ⁰C
25
30
35
40
45
50
55
60
in 20 Minuten freigesetzte Pep tide (mg-Äquivalente Tyrosin) .
0,460
0,455
0,400 ■
0,135
0,060
0,055
0,050
0,005

Das Enzym 25 462 RP ist somit in einem ziemlich breiten pH-Bereich wirksam. Der optimale pH-Wert beträgt 6,8, und das Enzym behält eine Aktivität über 50 % seiner maximalen Aktivität in dem Bereich von 5,5 bis 7»0 bei.

Bei pH = 6,8 beträgt die optimale Temperatur 25 bis 30°C. Bei 40°C hat das Enzym nur noch etwa 30 % seiner maximalen Aktivität.

In der nachfolgenden Tabelle III sind die Kinetiken der Ereisetzuig von Peptiden aus Casein durch das Enzym 25 462 RP und durch Trypsin angeführt.

Man stellt fest, dass das Enzym 25 462 RP nicht mehr Bindungen als das Trypsin bei diesem Substrat spaltet.

309808/12?9

Tabelle III

Vergleich der Hydrolyse von Casein bei pH =7,0 und 37°C durch das Enzym 25 162 RP und durch Trypsin	Freigesetzte Peptide	(mg-Äquivalente Tyrosin)
Reaktionszeit	das Enzym 25 162 RP	+ dui
(Minuten)	0,078
1	0,191
3	0,270
5	0,130
10	0,185
15	0,560
20	0,705
no	0,780
60	25 162 RP mit einem Gehalt	*^ch Trypsin⁺⁺
^f 17 /ig Enzym K.E.)	0,050
	0,130
	0,221
	0,312
	0,100
	0,500
	0,635
	0,770
	von 2250 K.E./g (0,103
	^f+ 23/ig kristallisiertes Trypsin mit einem Gehalt von 1500 K.E./ g (0,103 K.E.)

Das neue Enzym kann mit Vorteil in den Nahrungsmittelindustrien, insbesondere als Hilfsmittel bei der Brotherstellung, verwendet werden: zu Mehl in einer Menge von 5 bis 10 mg/kg zugesetzt, erleichtert das Enzym die Teigbearbeitung, setzt die zur Gärung erforderliche Zeit ganz erheblich herab und verbessert die Qualitäten des erhaltenen Brots (insbesondere regelmässigere Krumenporenbildung). Es kann in der Bäckerei, bei der Biskuitherstellung und bei der Zwiebackherstellung verwendet werden.

Für diese Verwendungen wird das Enzym vorteilhafterweise in Form von Zusammensetzungen eingesetzt, in denen es zusammen mit verträglichen Verdünnungsmitteln vorliegt, die seine Dosierung und sein Einbringen leichter machen. Beispielsweise kann das Enzym 25 162 RP in den Nahrungsmittelindustrien in pulverförmigen Produkten, insbesondere solchen auf der Basis von Kohlehydraten oder

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Mineralsalzen, wie beispielsweise Getreidemehl, Stärke, Saccharose, Glucose, Lactose und Calciumcarbonat, entweder allein oder zusammen mit anderen in geringen Mengen¹ verwendeten Bestandteilen (wie Aromastoffen, Farbstoffen und dgl.) verdünnt werden. In diesen Zusammensetzungen kann das Enzym 0,005 bis 99 Gew.-^ und vorzugsweise 1 bis 10 Gew.-% ausmachen. Gewünschtenfalls können die Enzymteilchen durch eine unter den Gebrauchsbedingungen labile und beispielsweise wasserlösliche Umhüllung isoliert werden.

Der das Enzym 2'5 462 RP erzeugende Organismus gehört dem Genus Streptomyces an und wird mit "Streptomyces hygroscopicus DS 14 649" (NRRL 3999) bezeichnet.

Dieser Organismus wurde aus einer in der Bretagne (Prankreich) entnommenen Erdprobe isoliert. Er wurde im Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois (USA) unter der Nummer NRRL 3999 hinterlegt und kann dort erhalten werden.

Die Isolierungsmethode ist die folgende: Die Erdprobe wird in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension wird dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Ein kleines Volumen jeder Verdünnung wird auf die Oberfläche von Petri-Schalen verteilt, die ein Agar-Nährmedium enthalten. Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 26°C werden die Kolonien von Mikroorganismen, die man isolieren will, auf Schräg-Agar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten.

Der Stamm Streptomyces hygroscopicus DS 14 649 steht mit der Species Streptomyces hygroscopicus in Zusammenhang, deren Haupteigenschaften von H.D. Tresner und E.J. Backus (Applied Microbiology, H, 243 - 250, 1956) und von S.A. Waksman (The Actinomycetes, II, the Williams and Wilkins Company, Baltimore, I96I, Seite 230 bis 231) definiert wurden. -

S. hygroscopicus DS 14 649 weist die drei folgenden Merkmale auf, die den drei Merkmalen entsprechen, durch die H.D. Tresner und E.J. Backus sowie S.A. Waksman die Species S.hygroscopicus definiere haben= 309808/1229

a) seine Sporophoren enden in allgemeiner Weise in dichten Spiralen mit einer Wicklung von einigen Drehungen; diese spiraligen Sporophoren sind üblicherweise längs eines Hauptfadens unter Bildung von mehr oder weniger länglichen Trauben angeordnet;

b) sein sporuliertes Luft-ausgesetztes Mycel zeigt, wenn es ein gutes Entwicklungsstadium erreicht hat, eine dunkelgraue Färbung, die der von der Species S. hygroscopicus gezeigten entspricht;

c) auf gewissen Züchtungsmedien, die eine gute Entwicklung des Luft-ausgesetzten Mycels ermöglichen, treten durch Alterung in den sporulierten Oberflächen schwarze, glänzende, nass aussehende Zonen auf, die für die Species S. hygroscopicus charakteristisch sind. Im Falle von S. hygroscopicus DS l'J 6^9 erfolgt die Bildung von besonderen schwarzen Zonen nur in ziemlich unauffälliger Weise, eher beschränkt auf kleine Stellen oder kleine Zonen, die stellenweise in dem Luft-ausgesetzten Mycel verteilt sind, statt über die gesamte Oberfläche aufzutreten. Sie tritt jedoch auf und kann insbesondere auf Agar nach Hickey und Tresher, Agar nach Bennett, Agar mit Hefeextrakt nach Pridham, Agar mit Hafer und Tomate nach Pridham und Stärke-Mineralsalz-Agar nach Pridham beobachtet werden.

H.D. Tresner und E.J. Backus weisen auf die Produktion von weinfarbenem löslichem Pigment auf gewissen, je nach dem Fall variablen Medien durch eine gewisse Anzahl der Stämme der Species S. hygroscopicus hin. S. hygroscopicus DS Ik 6^9 weist seinerseits diese Eigenschaft auch auf. Obgleich er ein weinfarbenes lösliches Pigment bilden kann, zeigt er diese Eigenschaft nur in geringem Grade, da für die Gesamtheit der Medien, für die die Beschreibung seiner morphologischen Charakteristiken im folgenden gegeben ist, die Bildung von weinfarbenem löslichem Pigment nur auf Agar nach Hickey und Tresner und auf synthetischem Agar nach Czapek mit Glycerin beobachter, wird, wo sie insbesondere zu Beginn der Kulturen sichtbar ist und in ziemlich geringer Menge auftritt.

Der als Referenz von S.A. Waksman in "The Actinomycetes" genannte

309808/1229

Stamm S. hygroscopicus zeigt auf den Züchtungsmedien, auf denen sein morphologisches Aussehen beschrieben ist, kleine Unterschiede zu dem Stamm DS 1*1 649 > von denen die bemerkenswertesten darin bestehen, dass er Gelatine langsam verflüssigt, auf Glucose-Asparagin-Agar ein gutentwickeltes Luft-ausgesetztes Mycel bildet, das nach Sporulation ein für die Species S. hygroscopicus charakteristisches glänzendes schwärzliches Aussehen annimmt, und ausser-dem eine gutentwickelte Kultur auf Nitrat-Agar mit Saccharose ergibt, während der Stamm DS 14 649 Gelatine rasch verflüssigt, auf Glucose-Asparagin-Agar fast kein Luft-ausgesetztes Mycel, das auf einige weissliche Spuren beschränkt ist, bildet und ausserdem Saccharose nicht verwertet und sich auf Nitrat-Agar mit Saccharose nicht entwickelt. Diese Unterschiede sind jedoch zu unbedeutend, um zu erlauben, den Stamm DS 14 649 als eine Species anzusehen,die von der Species S. hygroscopicus verschieden ist, deren übrige Haupteigenschaften, die zu deren Definition dienen, er aufweist.

S. hygroscopicus DS 14 649 bildet Sporenfäden, die im allgemeinen in dichten Spiralen mit 2 b^Jis 5 Windungen enden,obgleich man gelegentlich Spiralen, die eine grössere Anzahl von Windungen bilden, oder auch einige einfach gekrümmte Sporenfäden, deren Endteil keine vollständige Windung bildet, oder auch mehr oder weni- ger lockere und aufgerollte Spiralen beobachten kann. Der Sporenteil weist eine Traubenstruktur auf, wobei die spiraligen Sporophoren, die selbst einige Verzweigungen aufweisen können, längs eines Hauptfadens angeordnet sind, der eine ziemlich grosse Länge erreichen kann. Die Sporen sind oval mit Abmessungen von O,4 bis 0,6 μ/0,8 bis 1,0/u. Mikroskopische Prüfungen zeigen eine identische Organisation des Sporenteils auf Agar nach Hickey und Tresner und auf Stärke-Mineralsalz-Agar nach Pridham. Durch seine Sporulationsart ordnet sich S. hygroscopicus DS 14 649 in die Sektion Spira der Klassifikation nach Pridham ein.

S. Hygroscopicus DS Ik 649 entwickelt sich gut bei 26⁰C, etwas weniger gut bei 37°C und nicht bei 50⁰C. Seine Züchtungscharakteristiken und seine biochemischen Eigenschaften sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt. Ohne genauere Angaben sind

3 0 9808/1229

dies diejenigen von Kulturen, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben, d.h. Kulturen von etwa 3 Wochen bei 26⁰C. Diese Eigenschaften wurden auf Nähragar und Bouillons beobachtet, die üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Stämmen von Streptomyces verwendet werden, wobei die Kulturen auf Agarmedien auf Schrägagar durchgeführt wurden. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Züchtungsmedien wurde nach den Rezepturen hergestellt, die in "The Actinomycetes" (S.A. Waksman, Seite 193 - 197j Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950) angegeben sind. In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W, dem die Nummer folgt, die ihnen in "The Actinomycetes" gegeben wurden, bezeichnet. Die Literaturstellen für die anderen Züchtungsmedien oder die Zusammensetzungen derselben sind die folgenden:

Anm. A: "Hickey and Tresner^!s Agar", T.G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956 - 1957, Seite 950 K.L. Jones, Journal of Bacteriology, J57, 142, 1949 Rezeptur W-23, versetzt mit 2 % Agar "Yeast Extract Agar", T.G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956 - 1957, Seite 950

Anm. E: "Tomato Paste Oatmeal Agar", T.G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956 - 1957, S. 950

Anm. P: "Melanin formation medium", The Actinomycetes, Band 2, Seite 333, No. 42, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, I96I

Anm. G: W.E. Grundy u. Mitarb., Antibiotics and Chem., 2, 401, 1952

Anm. H: "inorganic Salts - Starch Agar", T.G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, I950 - 1957, Seite 951

Arim. I: entspricht der Rezeptur W-1, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind

Anm. J: entspricht der Rezeptur W-1, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glycerin ersetzt sind

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Anm.	B
Anm.	C
Anm.	D

Anm. K: "Synthetic medium of Dimmick" (ohne Agar), "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y.,

Anm. L: entspricht der Rezeptur W-18, wobei J50 g Saccharose durch 15 S Glucose ersetzt sind

Anm. M: entspricht der Rezeptur W-18, wobei die Saccharose weggelassen und durch kleine Pilterpapierstreifen ersetzt ist, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen

Anm. N: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y.,

"so"¹⁸-

Anm. P: "Plain gelatin", hergestellt nach den Angaben im "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y.,

H₅₀-¹S

Anm. Q: handelsübliches Magermilchpulver, nach der Angabe des

Herstellers zubereitet
Anm. R: für die Untersuchung der Produktion von HpS von H.D.

Tresner und F. Danga, Journal of Bacteriology," 76, - 244, 1958, angegebenes Medium.

09808/12 2

Kulturmedium Entwicklungs grad

(D

(2)

vegetatives Mycel (v.M.)

oder Unterseite der

Kultur

(3)

Luft-ausgesetzter Teil (umfaßt Gesamtheit von Luftausgesetztem Mycel und Sporulation)

(4)

lösliches
Pigment

(5)

Beobachtungen und biochemische Eigenschaften

(6)

Agar nach Hickey und Tresner (Anm. A)

gut

O CO CO O OO

Agar nach Bennett (Anm. B)

gut

Agar nach Emerson (Anm. C)

gut

dickes und gefaltetes v.M., braungelb bis orangebraun

dickes und gefaltetes v.M., braun· gelb

dickes und gefaltetes v.M., braungelb

gräulich-weiß bis grau mit einigen kleinen Zonen, die das charakteristische schwarze Aussehen von "Hygroscopicus" haben; Exsudation von einigen sehr kleinen rosenfarbenen Tröpfchen zu Beginn der Entwicklung

weißlich bis grau mit einigen kleinen Zonen, die das charakteristische schwarze Aussehen von "Hygroscopicus" haben

weiß-gräulich bis grau

zu Beginn
der Kultur
schwach
weinfarbenrosa, dann
rosabraun

Sporenteil in Trauben, Sporenfäden enden in dichten

Spiralen mit' 2 bis 5 Windungen; ovale Sporen mit Abmessungen von 0,4 bis O,6/0,S bis 1 /U

braungelb

ISJ GJ

(2)

(3)

(5)

(6)

	Agar mit	gut .	dickes und	graulich mit eini	.	keiner
	Hefeextrakt		gefaltetes	gen Zonen, die das
	nach Pri'dham		v.M., braun-	charakteristische
	(Anm. D)		gelb	schwarze Aussehen
				von "Hygroscopicus"	weiß-gräulich;
				haben	sehr schlecht
	Agar mit	gut	dickes und	hellgrau bis dun-	entwickelt
	Hafermehl		gefaltetes	kelgrau mit eini	weißlich; in Form
	und Tomaten		v.M., braun-!·	gen kleinen Zonen,	von Spuren
CO	extrakt		gelb	die das charakteri
CO	nach Prid-			stische schwarze
co	ham			Aussehen von
O	(Anm. E)			"Hygroscopieus"
03				haben; spärlich
■>«.				entwickelt
NJ
KJ co	Glucose-	ziemlich	dickes und
	pe pt on-	gut	gefaltetes
	Agar		v.M., Chrom
	(W-6) .		gelb
	Nähragär	mäßig	braungelbes
	(W-5) ■		v.M.

	Tyrosin-	schlecht	hellgelbe
	Hefeextrakt-		Unterseite
	agar zur
	Bildung von
	Melanin
	(Anm. F)

braungelb

gelbbraun

keines

sehr schwach
gelblich

Bildung von Melanin: negativ
(nach den Angaben des Autors
durchgeführte
Ablesungen)

ro ro co

(D

(2)

(3) (5)

(6)

	Agar nit	sehr	ungefärbtes
	Ca lc i um -	schlecht	bis weißliches
	maiat nach		v.M.; sehr
	Krainsky		schlecht ent
	(Anm. G)		wickelt
	Agar nit	sehr	weißlich bis
	Ovalbunin	mäßig	gelbbräunli
	(W-12)		ches v.M.;
			schlecht ent
O			wickelt
cr> CS	Glucose-	mäßig	gelbes v.M.
O	Asparagin-
OO	Agar
"ν.	(W-2)
ro	Glycerin-	ziemlich	hellbräun
(£>	Asparagin-	gut	liches v.M.
	Agar
	(w-3)
	Stärke-	ziemlich	dickes und
	Mineralsalz-	gut	gefaltetes
	Agar nach		v.M., braun
	Pridham		gelb
	(Anm. H)

weißlich; in Form von Spuren

weißlich bis gräulich; sehr mäßig entwickelt

weiß-gräulich bis grau mit einigen kleinen Zonen, die das charakteristische schwarze Aussehen vdn "Hygroscopicus" haben

keines

keine merkliche Löslichmachung von Calciummalat

schwach

gräulich

gelbbraun

he1IgeIbbraun

sehr schwach
bräunlich

Sporenteil in Trauben, Sporen fäden enden in dichten Spiralen mit 2 bis 5 Windungen; ovale Sporen mit Abmessungen von ^ 0,4 bis 0,6/0,δ u> bis 1/u; CD Hydrolyse von cr> Stärke: positiv,cn gut O

(1)

(2)

(3)

(5)

■(fr)

	. Stärke-	mäßig	braungelbes	weißlich; in Form	graulich
	Nitrat-Agar		v.M.	von Spuren	gelbbraun
	(W-10)
	syntheti	praktisch			keines
	scher Agar	keiner		-
	nach Czapek
	mit Saccharo
	se
	(W-1)
co
O	synthetischer	gut	dickes und	weißlich bis grau;	braungelb
co	Agar nach		gefaltetes	in Form von Spuren
00	Czapek mit		v.M., braun
O	Glucose		gelb
00	(Anm. I)
K>	synthetischer	gut	dickes und	. weißlich bis	zu Beginn
K)	Agar nach		gefaltetes	hellgräulich;	der Kultur
co	. Czapek mit		v.M., braun	sehr mäßig	sehr schwach
	Glycerin		gelb	entwickelt	weinfarben-
	(Anm. J)				rosa, dann
					leicht rosa-
					braungelb
	. Stärke-	mäßig	weiß-gelb	"weiß; in Form	schwach
	'·, Nitrat-		licher	von Spuren	bräunlich
	Bouillon		Schleier		gelb
	(W-19)
	Glucose-	sehr	sedimentier-	. keiner	keines
	Nitrat-	mäßig	te weiße.
	Bouillon		flockige
	nach		Kultur
	Dimmick
	(Anm. K)

Hydrolyse von Stärke: positiv, jedoch schwach

Produktion von Nitriten aus Nitraten: positiv, jedoch schwach

Produktion von Nitriten aus Nitraten: schwach, zu Beginn der ' cn Kultur . cn

(D

(2)

O)

(4)

(5)

(6)

CD OO O 00

synthetische sehr Bouillon mäßig nach Czapek rait Glucose (Anm. L)

synthetische keiner Bouillon nach Czapek mit Cellulose (Anm. M)

Nitrat- sehr Nährbouillon mäßig (Anm. N)

sedimentierte weiße flockige Kultur

keiner keines

keine Verwertung von Cellulose

weiße flockige keiner Kultur

Kultur auf Kartoffeln (W-27)

reine Gelatine mit 12 % (Anm. P)

sehr gut

mäßig

dickes und gefaltetes v.M., braungelb

gelblichgraue zentrale Kolonie an der Oberfläche um die Impfstelle herum

weiß-gräulich; in Form von Spuren

keiner

meines	Produktion von Nitriten aus Nitraten: negativ	CP
hell gelbbraun		cn O
keines	rasche Ver flüssigung

(D

(2)

(5)

(6)

Magermilch mittel 1.) bei 2O⁰C (Anm. Q)

2.) bei 37°C schlecht

hellbräunlichgelber Ring

keiner

Fragmente von

braungelbem

Ring

keiner

Agar nach Tresner und Danga (Anm. R)

gut

gräulich gelb- keiner

braun schwach
gelbbraun

keine Koagulation; rasche Peptonisation; pH geht von 6,2 auf 6; 5 in · 1 Monat

Koagulation mit anschließender sehr langsamer Peptonisation; pH geht von 6,2 auf 5,8 in 1 Monat

Produktion von H₂S: negativ (nach den Angaben der Autoren durchgeführte Ablesungen)

K) Ca)

Die Fähigkeit von Streptomyces hygroscopicus, Stamm DS 14 649, verschiedene Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen zur Gewährleistung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode nach Pridham und Gottlieb (J. of Bact.,-56, 107 - 1H, 1948) bestimmt. Der Entwicklungsgrad wurde nach einer geeigneten Zeitspanne der Inkubation bei 26⁰C auf dem von diesen Autoren angegebenen Grundmedium beobachtet, wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweils untersuchten Kohlenstoffquellen oder das (NH₄J₂SO₄ durch die verschiedenen jeweils untersuchten Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

geprüfte Kohlenstoff quellen	Verwertung	negativ	geprüfte Stickstoff quellen	Verwertung	negativ	positiv	negativ
D-Ribose	positiv		NaNO₃	positiv	positiv
D-Xylose	positiv		NaNO₂	positiv	positiv
L-Arabinose	positiv		(NH₄J₂SO₄	positiv	positiv jedoch langsam
L-Rhamnose			(NH₄J₂HPO₄	positiv	positiv
D-Glucose	positiv	negativ	Adenin	positiv	positiv
D-Galactose	positiv		Adenosin	positiv	positiv
D-Fructose	positiv		Uracil	positiv
D-Mannose	positiv	negativ	Harnstoff	positiv
L-Sorbose			L-Asparagin	positiv
Lactose	positiv	negativ	Glykokoll	positiv
Maltose	positiv		Sarcosin	positiv
Saccharose			DL-Alanin
Trehalose	positiv	negativ	DL-Va Hn
Cellobiose			DL-Aspara- ginsäure
Raffinose	positiv		L-Glutamin- säure
Dextrin	positiv		L-Arginin
Inulin		?. D 9 8 0:	L-Lysin
St^:irke	positiv	DL-S.erin
Glykogen	positiv	DL-Threonin
Glycerin	pofij ti ν	DL-Metliionin
		B/1279

	- 17	Verwertung	positiv	negativ	positiv	negativ	-	2239650	positiv
geprüfte Kohlenstoff quellen	negativ		geprüfte Stickstoff quellen	Verwertung	positiv
Erythrit	negativ	Taurin	negativ	positiv
Adonit	negativ	DL-Phenyl alanin	positiv
Dulcit	L-Tyrosin	positiv
D-Mannit	DL-Prolin	positiv
D-Sorbit	L-Hydroxy- prolin	positiv
Inosit	L-Histidin
Salicin	L-Tryptophan
	Be tain

Die Herstellung des Enzyms 25 462 RP besteht im wesentlichen darin, Streptomyces hygroscopicus DS 14 649 oder seinen Mutanten in ' einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Produkt abzutrennen.

Die Züchtung von Streptomyces hygroscopicus DS 14 649 kann nach jeder beliebigen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder' Submerszüehtungsmethode erfolgen, doch ist diese letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der Fermentationsindustrie verwendet werden.

Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

309 8 0 8/1229

Streptomyces hygroscopicus DS 14 649 - Stammansatz

Kultur auf Agar Kultur im Kolben unter Bewegung

Impfkultur im Fermenter

Produktionskultur im Fermenter

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Maltose, Dextrine, Stärke, oder andere Kohlehydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, z.B. Glycerin, Mannit, oder wie gewisse organische Säuren, z.B. Milchsäure, verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können mit Vorteil diese verschiedenen Kohlehydratquellen ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise anorganische odor organische Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumsulfat, oder· gewinne Aminosäuren, sein. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in protidischer Form enthalten,

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zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Laotalbumin, Gluten und deren Hydrolysates Sojamehl, Arachismehl, Fischmehl, Pepton, Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distiller's Solubles und Maisquellwasser.

Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsiMeise die Alkali- oder. Erdalkaliphosphate oder Calcium- oder Magnesiumcarbonat.

Andere tragen zudem zur Entwicklung von Streptomyces hygroscopicus DS 14 649 und zur Erzeugung von 25 462 RP erforderlichen Ionengleichgewicht bei, wie beispielsweise Alkalioder Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in spezieller Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen von Streptomyces hygroscopicus DS 14 649· Es sind dies insbesondere die Kobaltsalze.

Der pH-Wert des Fermentationsmediums sollte zu Beginn der Züchtung zwischen 6,O.und 7*8* vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5* liegen. Die zur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 30⁰C, doch wird auch eine zufriedenstellende' Produktion bei Temperaturen zwischen 23 und 33 °C erhalten. Die Belüftung der Züchtung kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Es wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,3 bis 3 1 Luft je Liter Bouillon und je Minute besonders gut geeignet sind. Die max-imimale Ausbeute an 25 462 RP wird nach 3- bis 7-tägiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.

Das 25 462 RP kann aus den Fermentationsmaischen in folgender Weise isoliert werden:

V, 0 9 R 0 8 / 1

Man kann die Permentationsmaische bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 7*5 und vorzugsweise bei pH 7 filtrieren, dann das so erhaltene Filtrat auf ein Volumen zwischen ein Viertel und ein Achtel des Anfangsvolumens konzentrieren und in der Kälte ein schlechtes Lösungsmittel für 25 462 RP, wie beispielsweise Aceton, zugeben, um die Ausfällung des Rohprodukts zu bewirken.

Das Rohprodukt kann nach einer der folgenden Methoden gereinigt werden:

Fraktionierte Ausfällung mittels Mineralsalzen, wie beispielsweise Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid (kristallisiert oder in konzentrierten wässrigen Lösungen) und/oder schlechten Lösungsmitteln für 25 462 RP, wie beispielsweise Isopropanol oder Aceton;

Dialyse durch eine Membran, vorzugsweise eine Membran aus regenerierter Cellulose, gegen Wasser zur Entfernung der Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht;

Chromatographie einer wässrigen Lösung von 25 462 RP an verschiedene Adsorbentien: Man verwendet vorzugsweise Gele von Kieselsäure, Dextran oder Polyacrylamid.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung. Die Aktivität der Produkte ist in Kunitz-Einheiten (KJS.)» wie oben definiert, ausgedrückt. Diese Aktivität ist in Κ,Ε,όπτ ausgedrückt, wenn es sich urn ein Produkt in Lösung handelt, oder in K.E./g, wenn es sich um ein festes Produkt handelt.

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Beispiel 1 Fermentation

Man bringt in einen 170 1-Fermenter die folgenden Bestandteile ein:

Pepton 1200 g

Fleischextrakt 600 g

hydratisierte Glucose 1200 g

teilweise hydrolysierte Stärke 2400 g

Leitungswasser ad 110 1

Der pH-Wert wird durch Zugabe von 120 cm 10 n-Natronlauge auf 7,30 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch Durchleiten von Dampf von 122⁰C während 40 Minuten. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon infolge der Kondensation von Dampf im Verlaufe der Sterilisation 120 1. Der pH-Wert beträgt 6,65. Man beimpft mit 200 cm einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur von Streptornyces hygroscopicus DS 14 649. Die Kultur wird bei 26⁰C 28 Stunden lang unter Bewegen und unter Belüften mit steriler Luft entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.

Die Produkt!onskultür wird in einem 800 1-Fermenter vorgenommen, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

Maisquellwasser (mit 50 % Trockenmaterial) 8 kg

teilweise hydrolysierte Stärke 4 kg

Sojaöl 6l

Calciumcarbonat 2 kg

Ammoniumsulfat 0,8 kg

Kobaltchlorid-hexahydrat 8g

Leitungswasser ad 370 1

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Der pH-Wert wird durch Zugabe von 570 cm 10 n-Natronlauge auf 6,40 eingestellt. Dann sterilisiert man das Medium bei 122⁰C während 40 Minuten. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon infolge der Kondensation von Dampf im Verlaufe der Sterilisation 400 1. Der pH-Wert beträgt 6,95.

Man beimpft mit 4o 1 der oben beschriebenen Impfkultur im 170 1-Fermenter. Die Kultur wird bei -26⁰C 88 Stunden unter Rühren mittels einer Turbine mit 205 U/min, und unter Belüftung mit steriler Luft mit einem Volumen von 15 nr/Stunde entwickelt. Der pH-Wert der Kultur beträgt dann 7 und das Volumen der Maische 410 1. Die proteolytische Aktivität bei neutralem pH-Wert beträgt dann 2,7 K.E./cnr Bouillon.

Extraktion und Reinigung

200 1 einer unter den oben beschriebenen Bedingungen hergestellten Kulturmaische, die jedoch einen Gehalt von 2,5 K.E./cnr aufweist, werden in einen mit einem Rührer ausgestatteten Bottich eingebracht. Man setzt dann 10 kg Filtrierhilfe zu. Das Gemisch wird auf einer Filterpresse filtriert und der Filterkuchen mit 40 1 Wasser gewaschen. Man erhält so 200 Filtrat.

Das Filtrat wird unter vermindertem Druck (2 mm Hg) bei 3O⁰C auf ein Fünftel seines Volumens eingeengt.

Das Konzentrat wird auf 4⁰C abgekühlt und dann durch eine Membran aus regenerierter Cellulose bei 4⁰C während 7 Stunden gegen einen Strom von destilliertem Wasser dialysiert.

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Zu der bei 4⁰C gehaltenen dialysierten Lösung setzt man langsam unter ständigem Rühren 2,5 Volumina auf -1O°C abgekühltes Aceton zu. Man zentrifugiert mit 2850 G. Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt. Der Niederschlag wird in 8 1 destilliertem Wasser von 4⁰C suspendiert, und der unlösliche Bestandteil wird durch Zentrifugieren mit 2850 G entfernt. Die überstehende Lösung besitzt einen Gehalt von 51 K.E./cm .

Zu dieser Lösung setzt man langsam unter ständigem Rühren kristallisiertes Ammoniumsulfat in einer Menge von 56I g/l zu. Nach 1-stündigem Stehenlassen bei 4⁰C zentrifugiert man mit 2850 G und entfernt die überstehende Flüssigkeit. Der Niederschlag wird in 1 1 destilliertem Wasser von 4⁰C gelöst, und die so erhaltene Lösung wird durch eine Membran aus regenerierter Cellulose bei 4⁰C während 24 Stunden gegen 40 1 destilliertes Wasser dialysiert. Man erhält 2,9 1 dialysierte Lösung mit einem Gehalt von 55 K.E./cm .

Zu der bei 4⁰C gehaltenen dialysierten Lösung setzt man langsam unter ständigem Rühren 2 Volumina auf -10⁰C abgekühltes Isopropanol zu. Man zentrifugiert mit 2850 G. Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt. Der Niederschlag wird mit kaltem Isopropanol gewaschen und unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 20⁰C getrocknet. Man erhält so 41 g Produkt mit einem Gehalt von 2250 K.E./g.

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Beispiel 2

Man stellt einen Brotteig mit dem folgenden Gemisch her:

Getreidemehl 1000 g

Hefe 20 g

Salz 22 g

Wasser 640 cm

Parallel stellt man einen Brotteig mit einem identischen Gemisch her, zu dem man 5 mg Enzym 25 462 RP mit einem Gehalt von 1150 K.Eyg in Form eines Konzentrats mit 0,1 Gew.-% in Getreidemehl zugibt.

Nach intensivem Kneten und einer ersten Gärung von 60 Minuten formt man den Teig und stellt fest, daß in Anwesenheit des Enzyms die Bearbeitung des Teigs erheblich erleichtert ist: Der Teig ist viel streckbarer und viel weniger elastisch als der Vergleichsteig.

Die Aufgehzeit (2. Gärung) ist in Anwesenheit des Enzyms mit derjenigen des Vergleichs identisch (135 Minuten), und der erhaltene Teig weist eine Kohlendioxyd-Retension auf, die mit der des Vergleichsteigs identisch ist (mit einem Chopin-Zymotachygraph durchgeführte Bestimmungen). Die Toleranz des Teigs ist jedoch gering. Wenn man diese zweite Gärung zu sehr verlängert, beobachtet man eine Diffusion von Kohlendioxydgas.

Nach dem Backen erhält man bei dem Versuch mit dem Enzym ein Brot, das das gleiche Volumen wie das Vergleichsbrot aufweist, jedoch eine viel gleichmäßigere Krumenporenbildung besitzt.

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Beispiel

Man stellt durch Trockenverkneten ein Konzentrat für industrielle Biskuitherstellung her, das 1000 g Stärke und. 100 g Enzym 25 462 RP (mit 1150 K.E./s) enthält.

Dieses Konzentrat kann zu trockenen Bestandteilen oder flüssi gen Bestandteilen in einer Menge von 5 bis 10 g je Charge von 100 kg Mehl zugegeben werden.

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Claims

Patentansprüche

iii Proteolytisches Enzym, das mit der Nummer 25 462 RP bezeichnet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Proteinsubstanz ist, die in Wasser sehr löslich, in konzentrierten Lösungen von Neutralsalzen und in wässrig-alkoholischen oder wässrig-acetonischen Gemischen wenig löslich ist und in wasser-.freien Alkoholen und Ketonen unlöslich ist, gegenüber Casein bei 25 bis 30⁰C eine maximale Aktivität bei pH 6,8 aufweist und zumindest 50 % dieser Aktivität bei pH 5,5 bis 1,0 beibehält.
2. Verfahren zur Herstellung des Enzyms 25 462 RP, dadurch gekennzeichnet, daß man aerob in einem assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Medium Streptomyces hygroscopicus DS 14 649 NRRL(3999) unter üblichen Bedingungen züchtet und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Enzym abtrennt.
j5· Proteolytische enzymatische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch einen Gehalt von 0,0005 bis 99 Gew.-^ Enzym 25 462 RP, zusammen mit verträglichen Verdünnungsmitteln.
4. Zusammensetzung nach Anspruch ~3, dadurch gekennzeichnet, daß sie 1 bis 10 Gew.-^o Enzym 25 462 RP zusammen mit zumindest einem Kohlehydrat oder Mineralsalz enthält.

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