DE2236772A1 - Neues thrombolytisches enzym und seine herstellung durch fermentation eines streptomyces - Google Patents

Description

Neues throjnbolytisch.es Enzym und seine Herstellung
durch Fermentation eines Streptomyces

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Enzym, das im folgenden mit der Nummer 22 750 RP bezeichnet wird, und sein Herstellungsverfahren.

Dieses neue Enzym weist ein ganz besonderes Interesse als
thrombolytisches. Mittel auf und kann in vitro durch eine allgemeine proteolytische Aktivität charakterisiert werden.

Das Enzym 22 750 RP kann durch Züchtung' eines im folgenden vollständiger identifizierten Mikroorganismus, der zum Genus Streptomyces gehört und mit "Streptomyces venetus DS 24288"
(NRRL 3987) bezeichnet wird, in geeigneten Medien erhalten werden.

Das erfindungsgemässe Enzym 22 750 RP weist die folgenden phy·^ sikalisch-chemischen Eigenschaften auf:

Das Enzym 22 750 RP ist in Wasser sehr löslich, in wässrigalkoholischen und wässrig-acetonischen Gemischen löslich, in

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konzentrierten Lösungen von Neutralsalzen [_ NaCl ; (NH.)_? SO oder Polyäthylenglykol sehr wenig löslich und in wasserfreien Alkoholen, Aceton, Hexan, Äthylacetat, Äther und den chlorierten Lösungsmitteln unlöslich.

Das Enzym 22 750 RP ist ein Protein, das die üblichen Proteinreaktionen liefert (Biuret-Reaktion, Reaktion nach Folin, Färbung durch Ponceau-RotjAmidoschwarz 12 B N oder Coomassie-Blau).

Das Enzym 22 750 RP enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel. Seine Elementarzusammensetzung beträgt etwa:

C = 50,4 1» H = 7,35 # N = 17 i> S = 0,50 #.

Nach seinem Verhalten bei der Chromatographie an Dextrangel oder Polyacrylamidgel besitzt das 22 750 RP ein Molekulargewicht von 40000 + 5000.

Die saure Hydrolyse des Enzyms 22 750 RP ermöglichte, die genden Aminosäuren nachzuweisen, für die der Gehalt in Millimol je 10 g Produkt angegeben ist!Asparaginsäure (11,5)» Threonin (8,5), Serin (7), Glutaminsäure (3,5), Prolin (2,5), Glycin (13), Alanin (7), Valin (4,5), Methionin (1), Isoleucin (2,5), Leucin (4), Tyrosin (5), Phenylalanin (2), Lysin (3), Arginin (2,5) und Histidin (2).

Das Enzym 22 750 RP ist durch die im nachfolgenden angegebenen physikalischen Eigenschaften gekennzeichnet:

Aussehen: Weisses Pulver (nach Lyophilisation) Ultraviolett-Spektrum (bestimmt mit einer Lösung mit 0,03 $ in Wasser)

1* Absorption bei 210 nra J

Absorptionsminimum bei 250 nm Absorptionsmaximum bei 278 nm

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	cm	* 187	35
	7° cm	= 4,	,55
E1	cm	= 13

Infrarot-Spektrum (die Bestimmung wurde an mit Kaliumbromid verpresstem Produkt vorgenommen):

Dieses Spektrum ist in Fig. 1 gezeigt, in der als Abszisse einerseits die Y/ellenlängen in Mikron (oberer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm (unterer Maßstab) und als Ordinate die optische Dichte aufgetragen sind.

In der nachfolgenden Tabelle I sind die Hauptabsorptionsbanden für dieses Produkt angegeben.

	sst	1515	m	Tabelle ]	C	Seh	1040	ssch	etwa	m und breit
3280	Sch	1490	Sch	1365	ssch	927	ssch	600	sch
3200	m	1465	ssch	1330	sch	920	ssch	530	Sch
3060	ssen	1455	ssch	- 1303	Sch	825	ssch	470	sch
3040	Seh	1445	m	1280	m	735	ssch	430	nittel
2980	m	1435	Sch	1235	sch	695	sch	m = ι
2960	seh	1418	Sch	1165	s s ch .		-
2935	Sch	1405	sch	1145	m
2880	Sch	1398	Sch	1110	•m
2650	sst	1385	m ·	1075	ssch
1650	sst	1375	Sch	1055
1535	= sehr		schwach		sch = schwach
s sch	= sehr	stark	Sch = Schulter
sst

Drehvermögen (Bestimmung mit einer Lösung mit 0,5 $ in Wasser)

-O

= - 14■+ 0,5 = - 29,2 + 0,6° = - 53,5 + 0,8°

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Das Enzym 22 750 RP kann durch sein Verhalten bei der Elektrophorese an Celluloseacetatgel ("Cellogel" N.D. Chemetron) unter Verwendung verschiedener Puffer charakterisiert werden:

Zitronensäure - Dinatriumphosphat pH = 2,2 μ - 0,09

Essigsäure - Natriumacetat pH =4,0 /u = 0,1

5,5-Diäthylbarbitursäure (Barbital) pH = 8,6 μ = 0,075

Natriumhydroxyd - Glycin pH = 9,6 /u = 0,1

( /u = Ionenstärke) ·

Der Nachweis kann durch colorimetrische Methoden oder durch Messung der proteolytischen Aktivität erfolgen.

Bei pH 4,0 beispielsweise wandert der aktive Faktor nach der Kathode hin. Es findet eine Verschiebung von 5 mm/2 Stunden bei einer konstanten Spannung von 250 Volt (die Stromstärke variiert von 6 bis 15 Milliampere) statt.

Die enzymatische Aktivität von 22 750 RP tritt bei einer grossen Zahl von Substraten proteinischer Natur und insbesondere bei Casein, Hämoglobin und Fibrin in Erscheinung. Sie ist bei dem Äthylester des Benzoylarginins (BAEE) nur sehr schwach und tritt bei dem Äthylester von Acetyltyrosin (ATEE) überhaupt nicht auf.

Die Aktivität bei Casein wird nach einer Technik bestimmt, die von derjenigen abgeleitet ist, die Kunitz für die Bestimmung von Trypsin entwickelt hat /""H. Kunitz, J. Gen. Physiol., 30t 291 (1947)_7· Die im Verlaufe der Hydrolyse freigesetzten, in Trichloressigsäure löslichen Peptide werden durch Spektrophotometrie (Messung der optischen Dichte bei 280 mn) bestimmt. Die enzymatische Aktivität kann in Kunitz-Einheiten (K.E.) ausgedrückt werden: Nach der Definition von Kunitz ist eine Einheit die Enzymmenge, die ausreichend lösliche Peptide in Freiheit setzt, um eine Erhöhung der optischen Dichte des Trichloressigsäurefiltrats bei 280 mn in 1 Minute um 1,000 zu erhalten,

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In der nachfolgenden Tabelle II sind die Ergebnisse zusammengestellt, die mit dem erfindungsgemässen Enzym 22 750 RP im Vergleich zu zwei kristallisierten proteolytischen Enzymen, näm-Trypsin und Chymotrypsin, erhalten wurden.

Tabelle II

Reaktion	Substrat	-	(a)	22 750 RP	Aktivität E/g	Chymo trypsin
	Casein	0>)	11 000	Trypsin	4 800
Proteolyse	Azocasein	(c)	28 800	4 000	3 250
	Gelatine-	(d)	800	13 300	100
	Rind erfibrin- koagulat	(e)	6 780	4 000	4 000
PibVinolyse	Kaninchenplas- makoagulat	(f)	3 800	29 000	2 700
	Hundeplasma- koagulat	(g)	500 000	2 000	10 000
	menschlicher Plasmakoagulat	(H)	200 000	20 000	4 000
	BAEE	(D	17	10 000	300
Esterolyse	ATEE		0	34 000 -	116 000
		2 000 .

Pip:« 2 sind diese Ergebnisse in Form eines Diagramms dargestellt.

(a) Reaktion bei pH = 8,0 bei 37⁰C - Substratkonzentration =

. 5 g / 1

(b) Reaktion bei pH = 7,5 bei 37⁰C - Substratkonzentration =

12,5 g / 1 = 7,5 bei 3-7⁰C -mit Gelatinefilm .

(c) Reaktion bei pH

(d) Reaktion bei pH = 7,4 bei 37°C -

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Pibrinogenkonzentration 10 g / 1

(β) Reaktion bei pH = 7,5 bei 37⁰C - Plasmakonzentration :

400 ecm / 1

(f) Reaktion bei pH = 7,4 bei 37⁰G - Plasmakonzentration :

200 ecm / 1

(g) Reaktion bei pH = 7,4 bei 37⁰G - Plasmakonzentration :

200 ecm / 1 (h) Reaktion bei pH = 7,7 bei 25⁰O - Substratkonzentration:

5.10 m

(i) Reaktion bei pH = 7,0 bei 25°G - Substratkonzentration:

5 . 10"⁴m

Die thrombolytische und fibrinolytische Aktivität wurde bei Versuchstieren bestätigt.

Bei einer auf intravenösem Wege verabreichten Dosis von 0,5 mg/kg schützt das Enzym 22 750 RP in hochgradig signifikanter Weise Kaninchen gegenüber der intravasculären Koagulation, die durch Einführung eines mit Kollagen imprägnierten Nylonfadens in die Jugularis induziert wurde ^""eine Technik, die von iderjenigen von J.L. David u. Mitarb., C.R. Soc, Biol., 162, 1763 (1968) abgeleitet ist_7· Eie Beschleunigung der Fibrinolyse kann beim Kaninchen ab einer Dosis von 0,05 mg/kg bei Verabreichung auf intravenösem Wege nachgewiesen werden.

Die Toxizität des Enzyms 22 750 RP wurde bei mehreren Tierarten untersucht. Bei der Maus wurde die 50$ige letale Dosis (DLcq) auf intravenösem Wege bestimmt. Sie beträgt 5 mg/kg; sie ist die gleiche nach wiederholter Verabreichung während 5 Tagen wie nach einmaliger Verabreichung. Beim Kaninchen beträgt die auf intravenösem Wege bestimmte DL₁-Q 1,5 mg/kg.

Diese Eigenschaften ermöglichen die Verwendung des erfindungsgemässen Produkts in der Humantherapie bei der Verhütung und der Behandlung von venösen Thrombosen, Pulmonalembolien und der Thrombosen der Koronararterien, der Arterien der Extremitäten und der Gerebralarterien.

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Der das Enzym 22 750 RP erzeugende Organismus gehört zum Genus Streptomyces und wird mit "Streptomyces venetus DS 24 288" (EHR! 3987) bezeichnet.■Er kann vom Ministerium der Landwirtschaft der Vereinigten Staaten, Laboratorium von Peoria (Illinois) erhalten werden.

Dieser-Organismus wurde aus einer in'Indien entnommenen Erdprobe isoliert.

Die Isolierung von Streptomyces venetus' DS 24 288 wurde nach der allgemeinen Methode durchgeführt, die darin besteht, eine kleine Erdprobe in sterilem destilliertem Wasser zu suspendieren, die Suspension auf verschiedene Konzentrationen zu verdünnen und ein kleines Volumen von jeder Verdünnung auf die Oberfläche von Petrischalen, die ein Nähragarmedium enthalten, zu verteilen. Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 26⁰C, die die Entwicklung des Mikroorganismus ermöglicht, werden die Kolonien, die man für das weitere Studium isolieren will, entnommen und auf Schrägnähragar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten.

Streptomyces venetus DS 24 288 bildet ovale· Sporen mit Abmessungen von 0,4 bis 0,6/u/ 1 bis 1,2/u. Die Sporophoren weisen spiralige Sporenfäden auf, deren Aufwicklung zumeist 5 bis 8 Windungen besitzt, jedoch manchmal etwas grosser sein kann. Sie sind recht häufig isoliert auf den Fäden, die sie tragen, angeordnet, doch kann man auch Sporophoren in Trauben form von einigen Elementen beobachten. Durch seine Sporulationsart fällt dieser Stamm in die Sektion Spira der Klassifikation nach Pridham.

Streptomyces venetus DS 24 288' entwickelt sich gut bei 25⁰O und bei 37°C, jedoch schlecht bei 50⁰C. Er besitzt die Eigenschaft, schwarzes Melaninpigment auf geeignetem Medium mit Tyrosin zu erzeugen, erzeugt HgS, reduziert Nitrate stark zu Nitriten, hydrolysiert Stärke, verflüssigt Gelatine, peptonisiert Milch ohne vorhergehende Koagulation und verwertät Cellulose. Die

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Färbung seines vegetativen Mycele geht je nach den Medien von gelb zu gelbbraun, braungelb oder dunkelbraun. Die löslichen Pigmente, die er produziert, haben im allgemeinen eine mehr oder weniger dunkle Braungelbtönung je nach den Medien und können in gewissen Fällen eine braunschwärzliche .Färbung erreichen. Sein Luft-ausgesetztes Mycel färbt sich während des Auftretens der Sporulation blau.

Die Züchtungscharakteristiken und die biochemischen Eigenschaften von Streptomyces venetus DS 24 288 sind in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt. Es sind dies diejenigen von Kulturen, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben, d.h. Kulturen von etwa 3 Wochen bei 25⁰C, falls es nicht anders angegeben ist. Diese Eigenschaften wurden auf Nähragar und Bouillons beobachtet, die üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Stämmen von Streptomyces verwendet v/erden, wobei die Kulturen auf Agarmedien auf Schrägagar durchgeführt wurden. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Kulturmedien wurde nach den Rezepturen hergestellt, die in "The Actinomycetes", S.A. Waksman, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950, Seite 193 bis 197, angegeben sind. In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W, dem die Nummer folgt, die ihnen in "The Actinomycetes" gegeben wurde, bezeichnet. Die Literaturstellen für die anderen Züchtungsmedien oder die Zusammensetzungen derselben eind die folgenden:

Anm. A: "Hickey and Tresner's Agar", T.ß. Pridham u. Mitarb,, Antibiotics Annual, 1956-1957, Seit© 950;

Anm. B: K.L, Jones, Journal of Bacteriology, ££, 142| 1949; Anm. C: Rezeptur W-23, versetzt mit 2 fo Agar;

Anm. D: "Yeast Extract Agar", T.G. Pridham u, Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950;

Anm, E: "Tomato Paste Oatmeal Agar", T.G. Pridham u, Mitarb,, Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950;

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Anm. F: "Melanin formation medium", The Actinomycetes, Band 2_:, Seite 33,3, Nr. 42, S.A. V/aksman, The "Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961; .

Anm. G-: 1>Y.E. Grundy u. Mitarb., Antibiotics and Ohem. ,2, 401, 1952; ■ ' -

Anm. H: "Inorganic Salts - Starch Agar", T.G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 951;

Anm. I: "Substrat 1 mit mineralischer Stickstoffquelle",

Seite 14, G.P. Gause u. Mitarb., Zur Klassifizierung der Actinomyceten, YEB Gustav Fischer Verlag, Jena 1958;

Anm. J: Entspricht der Rezeptur W-1, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind;

Anm·. K: Entspricht der Rezeptur W-1, wobei 30 g Saccharose durch 15g Glycerin ersetzt sind;

Anm.' L:· Entspricht der Rezeptur W-18, wobei 30 g Saccharose durch 15g Glucose ersetzt sind;

Anm. M: Entspricht der Rezeptur W-18, wobei die Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapierstreifen ersetzt ist, die teilweise in-die Flüssigkeit eintauchen ; ^N

Anm, N: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der'-ßociety of American Bacteriologists, Geneva, ET.Y., II₅₀-18; - ' _

Anm. P: "Plain gelatin", hergestellt nach den Angaben im "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Soe/iety of American Bacteriologists, Geneva, Ή.Y., H₅₀-IS₅ ■

Anm. Q: Handelsübliches Magermilchpulver, nach den Angaben des Herstellers zubereitet;

Anm. R: Für die Untersuchung der Produktion von HpS von

H.D. Tresner und F. Danga, Journal of Bacteriology, 76, 239-244, 1958, angegebenes Medium.

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Tabelle III

Kulturmedium !	Entwick lungs grad	vegetatives llycel (v.M.) oder Un terseite der Kultur	Luft-ausgesetzter Teil (umfasst Gesamtheit von Luft-aus ge s e t ζt em Mycel und Sporula- tion)	lösliches Pigment	Beobachtungen und bioche mische Eigen schaften
(D	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)
Agar nach Hickey und Tresner (Anm. A)	sehr gut	braunschwärzli che Unterseite	hellgräulich- blau; gut ent wickelt	dunkel braun nach braun- schwärz lich gehend	Ovale Sporen mit Abmessun gen von 0,4 - 0,6 / 1 - 1,2/u; spiralige, nicht-ver zweigte Sporo- phoren ode.r Spo- rophoren in kurzen Traubeni
Agar nach Bennett (Anm. B)	gut	braungelbe Unterseite	weisslich bis hellblau	braun gelb
Agar nach ijmerson (Anm. C)					Ni
Agar mit Kefeextrakt nach Pridham (Anm.. D)	gut	dickes und ge faltetes v.M., braungelb	weisslich; in Form von Spuren	.braun gelb	3677
gut	dickes und ge faltetes v.M., braungelb	weisslich bis hellblau	orange braun	fsj 1 1

(D	(2)	(3)	(4)	(H	(6)	V	■
Agar mit	gut	dickes und ge	weisslich bis	braun		«·	1
Hafermehl		faltetes 'v.M.,	hellblau	gelb			X I
und Tomaten-		iDraungelb				Bildung von Mela
extrakt nach						nin: positiv
Pridham		•				(nach den Angaben
(Anm. S)						des Autors durch
Glucose-	ziem	dickes und ge	weiss-	braun		geführte Ab-'
Pepton-	lich	faltetes v.M.,	gräulich.; sehr	gelb		lesungen)
Agar	■ gut	"braungelb	spärlich ent			Löslichmachung j^
(W-6)			wickelt		von Malat: ^
Mhr&gar	mittel	braungelbes	keiner	braun	positiv» gut ου
(W-5)		v.M.		gelb	CD
Tyrosin-1	massig	brauns chwärz-	graublau	schwarz
Hefeextrakt-		liche			—J
Agar zur		Unterseite			ro
Bildung von
Melanin
(Anm. P)
Agar mit	mäs Big	zitronengelbes	weisslich; in	keines
CaIcrum-		y.M.	Form von
ma! at nach			Spuren
Krainsky
(Anm. G)
	■
Agar mit ·	spärlich	ungefärbtes bis	weisslich; in	schwach
Ovarbumin		bräunliches	lorm von	bräunlich
(W-12)		v.IvI-, f spärlich	Spuren	gelb
		entwickelt

(D	(2)	(3)	(4)	(5)	(6) .	t I
Glueöse- Asparagin- Ag ar (W-2)	ziemlich gut	dickes unä ge faltetes v.M., gelbbraun bis braungelb	weisslich bis bläulich; ziemlich schlecht ent wickelt	braun gelb
Glycerin- Asparagin- Agar (TM)	ziemlich gut	dickes v.M., braungelb	weisslich bis bläulich; sehr schlecht ent wickelt	braun gelb
Stärke- Mineralsalz- Agar nach Pridham (Anm. H)	ziemlich gut	braungelbe Unterseite	hellgräulich- blau	keines	Ovale Sporen mit Abmessungen von 0,4 - 0,6/1 - 1,2/u; spiralige nicht-verzweig te oder in kurzen Trauben angeord nete Sporophoren; Hydrolyse von Stärke tpositiv
Starke- Kitrat- Agar (W-10)	massig	teraungeXbe Unterseite	weisslich bis hellblau	braun gelb	Hydrolyse von Stärkeϊ positiv
Stärke- Mineral- stickstoff- Agar nach liause (Ana. T)	gut	äickes und ge faltetes v.M. f braungelb	hellgräulich- blau	dunkel- gelbbraun, nach saüigra- liehgeheid

(D

synthetischer Agar nach Czapek mit Saccharose

synthetischer Agar nach Czapek mit ü-lucose (Anm. J)

synthetischer Agar nach Czapek mit Glycerin (Anm. K)

Stärke-Nitrat-Bouillon. (W-19) ·

Bouillon nach Czapek mit Saccharose (W-18)-

(2)

gut

gut

mittel

gut

massig

(3)

dickes und gefaltetes v.M., braungelb

dickes und gefaltetes v.M., gelbbraun

hellbräunlich-'gelbes v.M.

dicker

Schleier; gelbbraune bis. braungelbe Unterseite

weiss-gelblicher Schleier (4)

weisslich; sehr
schlecht entwickelt

weisslich; in
Form von
Spuren

keiner

weiss

keiner

(5)

braungelb

hellgelb braun

hellbräunlichgelb

bräunlich- , gelb

keines oder zögernd,

schwachgelb

(6)

Produktion von "Nitriten: stark Oositiv

Produktion von Nitriten: stark positiv

(D	ι i	(2)	(3)	(4)	■	(5)	(6)
Bouillon nach	massig	weiss-gelb-	keiner	keines oder	Produktion von
Czapek mit		Iieher		zögernd,	Fitriten:
Glucose		Schleier		schwach-	stark positiv
(Anm. L)				gelb
Bouillon nach	massig	weisslicher	hellgräulich-	keines	Produktion von
Czapek mit		Schleier;	blau; massig		Nitriten:
Cellulose		massig ent	entwickelt		stark positiv;
(Anm. LI)		wickelt	auf dem		Verwertung der
			Schleier und		Cellulose:
			auf dem aus		positiv
			der Bouillon
			ratend en
			Papier
Nitratnahr-	gut	gut ent	we issIich; in	bräunlich	Produktion von
bouillon		wickelter	Form von		Nitriten:
(Anm. K)		Ring,	Spuren		stark positiv
		gelblich
Kultur auf	gut	sehr dickes	weisslieh;	schwarz
Kartoffeln		und stark ■	in Porm von
07-27)		gefaltetes	Spuren
		v.M., dunkel-
	.gelbbraun		I 1 , r

K) Ca)

reine Gelatine mit 12 #
(Anm. P)

Magermilch ^
1.) bei 25 δ

(Ami. Q) .

2,} bei 37°C

Agar nach
Tresner und

Banga
(u 1}

gut

gut

gut

gut

(3)

dicke' zentrale Kolonie an der Oberfläche;, ge Tbbraunes ν. Μ,,

hellgelbbrauner Ring

dttnkelbraiiner Ring ■

sehwärzlichbr atme s
v.M.

(4)

Vf ei s s Ii ch;

spärlich

entwickelt

keiner

keiner

keiner

(5)

gelbbraun
bis braungelb

schwarz,
reichlich

(6)

Rasche Verflüssigung der Gelatine

Pe ρt oni s ation ohne Koagulation; pH geht von 6,2 auf 6,6

in 1 Monat

Peptonisation ohne Koagulation; pH geht von 6,2 auf 6,8

in 1 Monat

Produktion von HgS: positiv

(nach den Angaben der Autoren durchgeführte Ablesungen)

Streptomyces venetus DS 24 288 weist eine Gesamtheit von Eigenschaften auf, die mit keiner derjenigen der bereite "beschriebenen Stämme genau übereinstimmt·

Betrachtet man die Species, deren Beschreibung von S.A. Waksiaan in "The Actinomycetes" (Band 2, The Williams and Wllkins Company, Baltimore, 1961) gegeben ist, so ordnet sich S, venetus DS 24 288 in der "Serie Viridochromogenes" ein, die auf Seite 149 dieses Werks beschrieben ist, und zwar unter Berücksichtigung seiner Eigenschaften, Melaninpigment zu produzieren, ein blaues sporuliertes luft-ausgesetztes läycel zu zeigen, ein hellbraunes bis dunkelbraunes vegetatives Mycel auf ausreisen, lösliche Pigmente, die von gelbbraun bis braungelb oder sehr dunkelbraun je nach dem Fall auf synthetischen oder organischen Medien gehen, zu bilden und spiralige Sporophoren aufzuweisen. Er kann jedoch mit keinem der drei von S.A. Waksman als Glieder dieser Reihe genannten Species, nämlich Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces ehartreusis und Streptomyces cyaneus, gleichgesetzt werden.

Einerseits kann er nicht mit S. cyaneus identifiziert werden, der auf Agarmedien ein blaugefärbtes vegetatives Mycel bildet, was er niemals tu"t. Ausserdem verwertet im Gegensatz zu S. venetus DS 24 288 S. cyaneus Cellulose nieht und reduziert nicht Nitrate zu Nitriten.

Andererseits kann er nicht mit S. ehartreusis gleichgesetzt werden, der ein grün-gelbes bis schwarzes lösliches Pigment auf Gelatine bildet und kein lösliches Pigment auf Nahragar sowie Kartoffeln liefert, während S. venetus DS 24 288 ein braungelbes lösliches Pigment auf Gelatine sowie auf Nahragar und ein schwarzes lösliches Pigment auf Kartoffeln ergibt,

Schliesslich unterscheidet er sich wesentlich von S. viridochromogenes durch die Tatsache, dass dieser letztere in charakteristischer Weise auf einer gewissen Zahl von Medien ein vegetatives Mycel bildet, das eine sehr dunkelgrüne Färbung

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annimmt, die grünschwärzlich erreichen kann (insbesondere auf synthetischem Nitrat-Agar mit Saccharose, auf Gelatine und auf Nähragar). S. venetus DS 24-288 bildet ein vegetatives Mycel, das in allen !Fällen in. der.Tönungsskala bleibt, die von gelbbraun bis braungelb geht, und sich niemals grün färbt, sowie niemals ein dunkelgrünes lösliches Pigment bildet. Ausserdem reduziert S. viridochromogenes !Titrate nicht zu Nitriten, während S. venetus DS 24 288 in besonders starker und rascher V/eise Hitrate zu Hitriten reduziert, und zwar sowohl auf -syn~ thetischen Medien als auch auf organischen Medien.

S.A. Waksman schreibt auch eine gewisse Anzahl von Stämmen, die von Gause u. Mitarb, (zur Klassifizierung der Actinomyceten₉ G, Fischer, Jena, 1958) beschrieben sind, der'Uruppe viridochromogenes" zu. Wenn man mit diesen letzteren, die den grössten Teil der Serie Coerulescens nach. G-ause ausmachen, ver-. gleicht, so liegt S. veneijus DS 24 288 in dieser letzteren Gruppe, die die Stämme umfasst, deren vegetatives Mycel auf "Stärke-Mineralstickstoff -Agar nach Gause dunkel gefärbt ist und die nur die beiden Species Actinomyces (Streptomyces) viridochromogenes und Aotinomyces (Streptomyces) coeruleofuscus umfassen,,

S. venetus DS 24 288 unterscheidet sich von der Species Se viridochromogenes wesentlich durch die dunkelgrüne Färbung;, die das vegetative Mycel dieses letzteren auf einer gewissen Zahl von Medien, die S.A. Waksman in seiner Beschreibung genannt hat, annehmen kann. Ausserdem kann man der von. G-ause u_o Mitarb, gegebenen Beschreibung entnehmen_s dass S₀ viridochromogenes auch ein vegetatives Mycel, das eine dunkelgrüne Far·= bung annimmt, auf Milch, Agar mit Stärke, Kartoffeln und Stärke-Mineralstickstoff-Agar nach Gause produziert und auf diesem letzteren Medium kein lösliches Pigment bildet« Im Vergleich hiermit bildet S. venetus' DS 24 288 in keinem Falle ein dunkelgrünes vegetatives Mycel auf diesen Medien und produziert Gunkelbraungelbes lösliches Pigment auf Stärke-Hineralstickst ο ff- Agar nach Gause α Die yotl Sause im Pal Ie. von S₀ viridochromogenes genannte. Bildung eines dunkelgrünen löslichen Pig-

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ments auf Gelatine tritt im Falle von S. venetus DS 24 288 nicht auf.

S. venetus DS 24 288 kann nicht mit S. coeruleofuscus identifiziert werden, der im Gegensatz zu ihm Nitrate nicht reduziert und Cellulose nicht verwertet. Ausserdem ergibt S. coeruleofuscus weder auf organischem Agarmedium noch auf Kartoffeln ein lösliches Pigment, während S. venetus DS 24 288 regelmässig auf allen geprüften organischen Medien ein braungelbes lösliches Pigment und auf Kartoffeln ein schwarzes lösliches Pigment liefert. ■

Die Fähigkeit von S. venetus DS 24 288, verschiedene Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen zur Gewährleistung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode nach Pridham und Gottlieb (J. of Bact. 5j5, 107-114, 1948), bestimmt. Der Entwicklungsgrad wurde auf dem von diesen Autoren angegebenen Grundmedium beobachtet, wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweils untersuchten Kohlenstoffquellen oder das (Μ*)2^0ί durch die verschiedenen jeweils untersuchter Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

geprüfte Kohlenstoff quellen	Verwertung	geprüfte Stickstoff quellen	Verwertung
D-Ribose	positiv	NaNO5	positiv
D-XyIöse	positiv	NaNO2	positiv
L-Arabinose	positiv	(NH4)2SO4	positiv
L-Rhamnose	positiv	(NH4)2HP04	positiv
D-Glucose	positiv	Adenin	• positiv
B-Galactose	positiv	Adenosin	positiv

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- 19 Tabelle IV (Fortsetzung)

geprüfte Kolilenstoff- ' quellen	Verwertung	• geprüfte Stickstoff- quellen -	-	Verwertung
B-lructose	positiv	Harnstoff	positiv
B-IJannose	positiv	I- Asparagin	positiv
!-Sorbose ■	negativ	• Glykokoll	positiv
lactose	positiv	Sarcosin '	negativ
Maltose	positiv	DIi-Alanin	positiv
Saccharose	positiv	DL-Valin	positiv
Trehalose	positiv	DIi-Aspara- ginsäure	positiv
GelloMose	positiv	L-Glutamin- säure	positiv
Haffinose	positiv	!-Arginin	positiv
Dextrin	positiv	L-Iiysin	positiv
Inulin	negativ	DL-Serin	positiv
Stärke	positiv	Dl-Threonin	positiv
Giykogen	positiv	Taurin	negativ
Glycerin	positiv	DL-^henyl- alanin	positiv
Brythrit	negativ	!-Tyrosin	-positiv
Adonit	positiv	DL-Prolin	positiv
Dulcit	negativ	L-Hydroxy- prolin	positiv
D-Hannit	positiv	Ii-Histidin	positiv
D-Sorhit	negativ	!-Tryptophan	positiv
Inosit	positiv	Betain	positiv
Salicin	positiv, jedoch langsam

12Ö3

Das Verfahren zur Herstellung des Enzyms 22 750 RP besteht im wesentlichen darin, Streptomyces venetus DS 24 288 oder seine Mutanten in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Enzym 22 750 RP abzutrennen.

Die Züchtung von Streptomyces venetus DS 24 288 kann nach jeder "beliebigen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder Submere ziich tungsme thod e erfolgen, doch ist diese letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der Fermentationsindustrie verwendet werden.

Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

Streptomyces venetus DS 24 288 - Stammansatz

Kultur auf Agar

Kultur im Kolben unter Bewegung

Impfkultur im Fermenter

Produktionskultur im Fermenter

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren und Verdickungsmittel enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, lactose, Dextrine,

20S386/12 03

Stärke, Melassen, oder andere Kohlehydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, z.B. Glycerin oder Mannit, oder 'wie gewisse organische Säuren, z.B. Milchsäure, Citronensäure, Weinsäure, verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche Öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können mit Vorteil diese verschiedenen Kohlehydratquellen-ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind ausserordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische -Substanzen, wie beispielsweise Nitrate, anorganische oder organische Ammoniumsalze, Harnstoff oder Aminosäuren, sein. Sie körinen auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in protidischer form enthalten, zu~ geführt werden, wie beispielsweise in form von Casein, Laetalbumin, Gluten und deren Hydrolysaten, Sojamehls Arachismehl, Fischmehl, fleischextrakt, Hefeextrakt, Distillers' Solubles und Maisquellwasser.

Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen; wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Calcium- oder Magnesiumcarbonate

Andere führen zu dem zur Entwicklung von Streptomyces venetus DS 24 288 und zur Erzeugung des Enzyms 22 750 RP .erforderlichen lonengleichgewicht, wie beispielsweise Alkali-' und Erdalkalichloride und -sulfate» Schliesslich v/erden gewisse in spezieller Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen von Streptomyces venetus DS 24· 288. Es sind dies die Eisen-.und Kobaltsalze.

Unter den Verdickungsmittel·!! sind die am häufigsten verwendeten Stärke, Carboxymethylcellulose und Agar.

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BAO ORIGINAL

Der pH-Wert des Fermentationsmediuras sollte zu Beginn der Züchtung zwischen 6,0 und 7»8, vorzugsweise zwischen 6,4 und 7,5, liegen. Die zur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 28⁰C, doch wird auch eine zufriedenstellende Produktion bei Temperaturen zwischen 25 und 40⁰C erhalten. Die Belüftung der Züchtung kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Es wurde jedoch gefunden, dass Belüftungen von 0,3 bis 2 liter Luft je Liter Bouillon und je Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an Enzym 22 750 RP wird nach 1~ bis 7-tägiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.

Das Enzym 22 750 RP kann aus der Fermentationsmaische extrahiert und durch Anwendung üblicher Methoden zur Isolierung und Fraktionierung von Proteinmaterialien isoliert werden, wobei die Aktivität und die Reinheit des Produkts nach geeigneten Methoden, beispielsweise Bestimmung der Aktivität gegenüber Casein und Elektrophorese, geprüft werden.

Das Enzym 22 750 RP kann aus den Fermentationsmaischen durch Filtrieren der Maische in Anwesenheit einer Filtrierhilfe, Einengen des Filtrats unter vermindertem Druck, Ansäuern des Piitrats auf einen pH-Wert in der Nähe von 4» Filtrieren, anschliessende Dialyse des Filtrats im Gegenstrom zu destilliertem Wasser und Ausfällung des Enzyms 22 750 RP durch Zugabe von Aceton zu dem Dialysat isoliert werden.'

Das so erhaltene Enzym 22 750 RP kann anschliessend durch übliche physikalisch-chemische Methoden gereinigt werden. Insbesondere bestehen die verwendeten Reinigungsmethoden darin, das Enzym in destilliertem Wasser zu lösen und dann das Enzym durch Zugabe von Mitteln, in deren konzentrierten wässrigen Lösungen das Enzym sehr wenig löslich ist, wie beispielsweise Neutralsalzen, auszufällen.

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SAO ORiQiNAL

—' 23 —

Das Enzym 22 750 RP kann auch durch Chromatographie an verschiedenen Trägern, wie beispielsweise Aluminiumoxyd, Cellulosepulver oder Dextran- oder Polyaerylamidgelen, durch Dialyse oder durch präparative Elektrophorese gereinigt werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ·

Beispiel 1

A ) Fermentation .

In einen 170 Liter-Fermenter "bringt man die folgenden Bestandteile, ein:.

Pepton · 600 g

Fleischextrakt - . 600 g

hydratisierte Glucose 1200 g

Sojaöl 120 cm⁵

Natriumchlorid 600 g

Leitungswasser ad 110 1

rz

Der pH-Wert wird durch Zugabe von 12Ό cm 1On-Hatronläuge auf 7,50 eingestellt. Man. sterilisiert das Medium durch Einleiten von Dampf von 122⁰G während 40 Minuten. Mach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 120 1 infolge der Kondensation von Dampf während der Sterilisation und der pH-Wert 7»0. Man be-

impft mit 200 cm einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur von Streptomyces vehetus DS 24 288. Die Kultur wird bei 26⁰G während 28 Stunden unter Bewegen und unter Belüften mit sterilisierter Luft zur Anlegung der Produktionskultur belüftet. -

Die Produktionskultur wird in einem 800 liter-Permenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

2ti8tf/12f3

2236772	kg
8	1
6	kg
0,8	kg
O1008	1
ad 360

lläiBquellv/asser (50 $ Trockenextrakt) Sojaöl Ammoniumsulfat Robaltchlorid-Hexahydrat Leitungswasser '

Nach Einstellen des pH-Werts auf 6,40 durch Zugabe von 450 cm. 1On-Natronlauge setzt man 2 kg Üälciumcarbonat zu und sterilisiert dann das Medium durch Durchleiten von Dampf iron 122⁰C während 40 Minuten* Hach Abkühlen beträgt dae Volumen der Bouillon 390 1 infolge der Kondensation von Wasserdampf während der Sterilisation. Man bringt das Volumen durch ÄUgabö von 10 1 einer sterilen wässrigen Lösung, die 4 kg hydratisierte Glucose enthält, auf 400 1» Der pH-Wert beträgt dann 6,60.

Man beimpft mit 40 1 der oben beschriebenen iiapfkulturiia 170 Liter-Fermenter. Die Züchtung wird bei 26⁰G während 116 Stunden unter Rühren mittels einer turbine mit 260 U/min unter Belüften mit einem Volumen an sterilisierter Luft von 35 nr/Stunde durchgeführt. Der endgültige pH-Wert des Mediums beträgt 6,80 und das Volumen der Maische 380 1. Die proteolyiische Aktivität der Maische beträgt 0,4 K.E./cnr⁵.

B ) Extraktion

360 1 dieser Maische werden in einen mit einem Rührer ausgestatteten Bottich eingebracht. Man gibt 18 kg Filtrierhilfe »u» DaB Gemisch wird auf einer Filterpresse filtriert und der filterkuchen mit 100 1 Wasser gewaschen. Man erhält so 400 1 filtrat mit einem Gehalt von 0,35 K.S^

"Um Filtrat wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 35⁰C eingeengt. Ui
Gehalt von 3,77 K.E»/onr%

tür von 35⁰C eingeengt. Man erhält JO 1 Konzentrat mit einem'

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Der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zugabe von 450 cnr 6n-Salzsäure auf 4t0 eingestellt. Dann setzt man 300 g Filtrierhilfe zu. Man filtriert und wäscht dann den Filterkuchen mit 2 1 Wasser.

Das geklärte Konzentrat wird auf 4⁰C abgekühlt und durch eine Membran aus regenerierter Cellulose 7 Stunden gegen einen Strom van destilliertem Wasser bei dieser Temperatur dialysiert.

Zu dem so erhaltenen, bei 4°0 gehaltenen Dialysat"(37 1) setzt man unter Rühren 111 Liter zuvor auf -10^QC abgekühltes Aceton zu und rührt dann noch 10 bis 15 Minuten nach beendeter Zugabe des Lösungsmittels.

Der aktive Niederschlag wird durch Filtrieren gewonrien, mit kaltem Aceton gewaschen und unter vermindertem Druck (20 mm. Hg) 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 3O⁰C getrocknet*

Man erhält so 997 g Produkt mit einem Gehalt von 97 K.E./g.

C ) Reinigung, Stufe 1

1915 g unter den oben beschriebenen Bedingungen hergestelltes Rohprodukt mit einem Gehalt von 97 KJC/g v/erden in 40 1 destilliertem Wasser gelöst.

Zu der so hergestellten Lösung setzt man langsam unter Rühren 9_t6 kg kristallisiertes Ammoniumsulfat (zur Erzielung einer Lösung mit 38$i-ger Sättigung an Salz berechnete Menge) zu. Man setzt das Rühren 20 Minuten nach beendeter Zugabe des Salzes fort und zentrifugiert dann mit 1800 g. Der erhaltene Niederschlag wird entfernt.

Zu der überstehenden Flüssigkeit setzt man langsam unter .Rühren 5 kg kristallisiertes Ammonium sulfat (zur Erzielung einer Lösung mit b2$iger Sättigung an Salz berechnete Menge) zu. Man rührt noch 15 Minuten nach beendeter Zugabe des Salzes

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- ■ ■ ■■■■■; -<ί'.>§ und lässt dann 1 Stunde stehen. Man zentrifugiert mit

1800 g. , -,:

Der aktive Niederschlag wird gesammelt und in 1 Eiter destil- ^! liertera Wasser aufgenommen, und die erhaltene Lösung wird durch eine Membran aus regenerierter Cellulose 24 Stunden bei 4°ö gegen 40 1 destilliertes Wasser dialysiert.

Das Dialysat wird lyophilisiert. Man erhält 70 g Produkt mit einem Gehalt von 1200 KJS./g. Nach der elektrophoretischen Analyse enthält dieses Produkt etwa 13 "/> aktiven Faktor.

D ) Reinigung, Stufe 2

102 g des unter den vorhergehenden Bedingungen hergestellten Produkts mit einem Gehalt von 1200 KJü/g werden in 4100 car destilliertem Wasser gelöst, und der pH-Wert der Lösung wird durch Zugabe von 66 cm 1n-Natronlauge auf 8,0 eingestellt.

Zu der so erhaltenen lösung setzt man langsam unter Kühren 1,25 kg Polyäthylenglykol 1500 zu. Man rührt noch 15 Minuten nach beendeter Zugabe des Fällungsmittels. Man läast aft—.. schliessend 15 Minuten stehen und zentrifugiert dann 15 KtßW*· ten mit 12000 g bei 4⁰C

.Der aktive Niederschlag v/ird in 700 cm destilliertem Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung (800 cm ) wird auf 4°0 abgekühlt. Man setzt langsam unter Rühren 4 1 auf -60⁰G abgekühltes Isopropanol zu.

Der aktive Niederschlag wird durch 15minütiges Zentrifugieren mit 3000 g bei -1O⁰G gewonnen und dann unter vermindertem Druck (0,2 mm Hg) in Anwesenheit von'¹PgOe' bei einer Temperatur von etwa 20⁰C getrocknet.

Man erhält so 30,7 g Produkt mit einem Gehalt von 1600 K.E./&, das nach der elektrophoretischen Analyse ,etwa 20 '/<> aktiven Pak-

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tor enthält.

E ) Reinigung, Stufe 3

10g des unter den obigen Bedingungen hergestellten Produkts mit einem Gehalt von 1600 K.E/g werden in 4-00 cm destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird durch Zu-

gäbe von 3 cm . In-Natronlauge auf 8,0 eingestellt* ·

Zu der so erhaltenen lösung setzt man langsam unter Eühren 26,6 cm einer wässrigen öligen Lösung ,von 6,9^taDiaminö-2--äthöXy·* acridinlactat zu* Nach zusätzlichem I5minütigem Rühren und anschilessendem 1-stündigem Stehenlassen bei 4°ö zentrifugiert man 10 Minuten mit 12Ό00 g bei 4⁰C.

Der erhaltene inaktive Niederschlag wird entfernt. Die überstehende Lösung wird unter vermindertem Druck (0,2 mm Hg) ■ bei 25⁰C auf ein Volumen von 25 cm eingeengt. Man kühlt dann auf 4°C ab und setzt langsam unter Rühren 250 cm auf -60⁰C abgekühltes Isopropahol zu.

Der aktive Niederschlag wird durch Zentrifugieren während 15 Minuten mit 12000 g bei -1O⁰C gewonnen und dann unter vermindertem Druck (0,2 mm Hg) in Anwesenheit von PpÖe bei einer Temperatur von etwa 20⁰C getrocknet»

Man erhält so 4,7 g Produkt mit einem Gehalt von 2240 K.E,/g> das nach der elektrophoretischen Analyse etwa 37 $ aktiven Faktor enthält.

P ) Reinigung, Stufe 4

200 mg des unter den obigen Bedingungen hergestellten Produkts mit einem Gehalt von 2240 K.E./g werden in 3 cnr O,01m-Phosphät-

- ■ ■ - ■ '· 3

puffer von pH 6,5 gelost". Man setzt 3 cnr Isppropanol und 4 g.

Cellulosepulver zur Chromatographie zu.

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'- 28 -

Der so erhaltene Brei wird in regelmässiger Dicke auf das obere Ende einer Cellulosesäule gegeben. Die Säule besitzt einen Durchmesser von 3 cm und enthält 80 g Cellulose in einem Gemisch gleicher Volumina Isopropanol und O,01m-Phosphatpuffer von pH 6,5 (was eine Höhe von 39 cm darstellt). Man eluiert mit einem Phosphatpuffer-Isopropanol-Gemisch, wobei man in linearer Weise den Mengenanteil des Puffere in dem Gemisch von 50 auf 100 Vol.$ erhöht (Gesamtvolumen des Elutionemittele mit Zusamnensetzungsgradient: 1,5 1). Der Durchsatz beträgt · 35 cm je Stunde. Das Eluat wird in Fraktionen von etwa 20 cm gesammelt und seine optische Dichte kontinuierlich mittels eines UVICORD L.K.B,-Analysators bei 280 nm gemessen. Das erhaltene Diagramm weist eine erste sehr asymmetrische Spitze und dann, gut getrennt, eine zweite symmetrische Spitze, die einer Konzentration an Puffer zwischen 78 und 92 $> entspricht, auf. Die elektrophoretische Analyse zeigt, dass nur diese zweite Spitze den aktiven Faktor enthält.

Man vereinigt die dieser zweiten Spitze entsprechenden Fraktionen (Fraktionen 53 bis 70, entsprechend 415 em ),. ent-" fernt den Alkohol durch Verdampfen unter vermindertem Druck. (2 mm Hg), dialysiert dann durch eine Membran aus regenerierter Cellulose gegen·10 1 destilliertes Wasser während 24 Stunden bei 4-⁰C und lyophilisierti

Man erhält so 43 mg Produkt mit einem Gehalt von 6400 K.E./g, das nach der elektrophoretischen Analyse etwa 55 $ aktiven Faktor enthält.

Beispiel 2

3 g des unter den in Beispiel 1-D beschriebenen Bedingungen 'hergestellten Produkts mit einem Gehalt von 1600 YUEJr werden in 40 cnr Barbitalpuffer von pH 8,6, /u = 0,0375, gelöst, und diese Lösung wird durch eine Membran aus regenerierter Cellulose 48 Stunden gegen 10 1 dieses gleichen Puffers bei 4⁰C dialysiert.

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Die Lösung wird, dann durch 15-minütiges Zentrifugieren mit 12000 g bei 4°0 geklärt und auf das obere Ende einer L.K.B.-'Säule vom Typ PORATH zur präparativen Elektrophorese, die 1,3 kg Cellulose in Barbitalpuffer von pH 8,6, /u = 0,075, enthält (was eine Höhe von 66 cm ausmacht) aufgebracht.

Man legt dann an die Klemmen der Vorrichtung eine Spannung von 500 Volt (Anode oben) an. Die Stromstärke beträgt etwa 0,46 A. Die Temperatur im Inneren der Säule wird bei etwa 20⁰C durch ständige Zirkulation einer Kühlflüssigkeit Von 4⁰C in dem Mantel gehalten. Von der ersten Stunde der Elektrophorese an wandern gefärbte Verunreinigungen in die Anodenkammer. Man entfernt den gefärbten Puffer und ersetzt ihn durch frischen Puffer, wobei man diesen Arbeitsgang so oft wie notwendig wiederholt. Die Entfernung dieser Pigmente ist nach 6-stünda.ger Elektrophorese fast vollständig. Man setzt dann die Spannung auf 400 Volt -(I = 0,32 A) herab und setzt eine Gegenstromeluticn im unteren Teil der Säule mit einem Durchsatz von 250 cm /Stunde in Gang. Das Eluat wird in Fraktionen von. etwa 50 cm gesammelt und seine optische Dichte kontinuierlich mittels eines TJVICORD L.K.B.-Analysators bei 280 nm gemessen» Nach 15-stündigem Betrieb .unter diesen Bedingungen erhöht man die Spannung auf 500 Volt (I = 0,40 A) _? wobei man den Durchsatz der Gegenstromelution auf 125 cnr/Stunde einstellte Nach 10 Stunden, d.h. 31 Stunden nach Beginn des Arbeitsgangs₉ "bricht man die Elektrophorese ab und eluiert direkt von oben nach unten mit dem Barbitalpuffer mit einem Durchsatz von 210 V

Das erhaltene Diagramm weist eine erste kleine Spitze (etwa die 23. Elektrophoresestunde) und dann 3 unvollständig getrenn te beträchtliche Spitzen auf. Die elektrophoretische Analyse £0igtj dass nur die dritte Spitze den aktiven Faktor enthält«, Man vereinigt die dieser dritten Spitze entsprechenden Fraktionen (1425 cm ), engt auf 400 cm durch-Verdampfen unter ver mindertem Druck (2 mm Hg) ein und dialysiert dann dreimal während 24 Stunden gegen jeweils 50 1 destilliertes Wasser von

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BAD ORIGINAL

Die dialysierte Lösung wird durch Eindampfen unter vermindertem Druck (2 mm Hg) auf 10 cm eingeengt und dann auf 4⁰C abgekühlt. Man setzt langsam unter Rühren 100 cm auf -6O⁰C abgekühltes Isopropanol zu. Der aktive Niederschlag wird durch 10-minütiges Zentrifugieren mit 12000 g bei -10⁰C gewonnen und dann unter vermindertem Druck (0,2 mm Hg) in Anwesenheit von £2^5 ^^ei einer Temperatur in der Nähe von 20⁰C getrocknet.

Man erhält so 276 mg Produkt mit einem Gehalt von 7000 K.E./g, das nach der elektrophore tis chen Analyse etwa 65 ^cß> aktiven Paktor enthält.

Dieses Produkt enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Phosphor und Schwefel. Seine Elementarzusammensetzung liegt in der Nähe von:

C = 44,0 $ H = 6,5 ίο N= 12,5 °ß> P = 0,35 # S = 0,65 $>

Seine saure Hydrolyse ermöglicht, die"folgenden Aminosäuren nachzuweisen, für welche der Gehalt in I.lillimol je 10 g Produkt angegeben ist: Asparaginsäure (8,5), Threonin (7), Serin (6,5), Glutaminsäure (5), Prolin (2), Glycin (10,5), Alanin (7,5), Valin (5,5), Isoleucin (2), Leucin (3), Tyrosin (3,5), Phenylalanin (1), Lysin (2), Arginin (2) und Histidin "(1,5).

Das Produkt weist die folgenden physikalischen Eigenschaften

auf: . '

Aussehen: beiges Pulver (nach Lyophilisation)

Ultraviolett-Spektrum (Bestimmung mit einer 0,02?£igen Lösung

in Wasser):

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BAD ORIGINAL

Absorption bei 210 nm . ^\tm- ⁼

1°6

Absorptionsminimum bei 250 nm Ε.Λ = 7»8 -

Absorptionsmaximum bei 278 nm ^C₁' ⁼ 14» 1

I CXu

Infratrot-Spektrum (Bestimmung an mit Kaliumbromid verpresstern

Produkt):

Dieses Spektrum ist in .Fig. 3 gezeigt, in der als Abzisse einerseits die Wellenlänge in Mikron (oberer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm"" (unterer Maßstab) und als Ordinate die optische Dichte aufgetragen sind.

In der nachfolgenden Tabelle sind die Hauptinfratrotabsοrp~ tionsbanden für dieses Produkt angegeben:

3410 sst 1445 m 940 m

3300 Sch 1385 m 810 sch

3070 Seh 1330 ssch 735 Sch

3015 Sch 1300 seh 690.Sch

2950 m 1235 m . 650 Sch

2920 m 1145 sch ' 610 Sch

2860 sch 1120 ssch 550 st

2840 Sch 1090 Sch 480 Sch

1645 sst 1070 st 460 Sch

1535 sst 1045 m " 420 Sch

sst = sehr stark m = mittel ssch = sehr schwach st = stark ■ sch = schwach Sch = Schulter

Drehvermögen (Bestimmung mit einer 0,5$igen Lösung in Wasser):

= -10,5 + 0,5
= -17,7 + 0,3° ' .

2Q988B/120 3

Die Aktivität dieses Produkts bei verschiedenen Substraten ist in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

Reaktion	Substrat	Aktivität " (E/g)
Proteolyse	Casein	7000
	Azo-casein	15700
	Gelatine	1000
Fibrinolyse	Rinderfibrinkoagulat	2500
	Kaninchenplasmakoagulat	4100
	Hundeplasmakoagulat	200000
Esterolyse	BAEE	3000
	ATEE	500

Beispiel 5

22_t8 g unter den in Beispiel 1» Stufen A bis E, beschriebenen Bedingungen hergestelltes Produkt, jedoch mit einem Gehalt von 2400 K£/s> werd'en in 480 cm destilliertem Wasser gelöst. Der

pH -Wert der Lösung beträgt 7,4·. Die folgenden Arbeitsgänge

werden bei +4⁰C durchgeführt.

Die obige Lösung wird am oberen Ende einer Cellulosesäule . mit einen Durchmesser von 15 cm, die mit destilliertem Wasser imprägnierte Cellulose über eine Höhe von 17 cm enthält, aufgegeben» Han eluiert mit destilliertem \7asser mit einem Durchsatz von 950 cm /Stunde. Die optische Dichte des Eluats wird kontinuierlich mit einem UVICORD-L.K.B.-Analysator bei 280 nm gemessen. Das erhaltene Diagramm weist eine asymmetrische Spitze, die das Enzym enthält, auf, während die in dem Produkt enthaltenen Spuren 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin-lactat an der Cellulose gebunden bleiben. Das den absorbierenden Fraktionen entsprechende Eluat wird gesammelt (6,9 1) und unter vermin-

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d.ertem Druck (2 mm Hg) ohne Überschreitung von 25 C auf 480 cm eingeengt, . ·

475 cm des obigen Konzentrats werden mit 205 cm auf -10⁰O abgekühltem Isopropanol verdünnt, und die erhaltene Lösung wird am oberen Ende einer Säule von Cellulose, die mit einem Gemisch Ύ0Ά Isopropanol und Wasser mit einem Gehalt von 30 .YoI.$ des Alkohols imprägniert ist, aufgegeben. Die Säule hat einen Durchmesser von 15 cm und enthält 600 g trockene Cellulose (Höhe der Cellulose 7 cm)₀ Man eluiert mit dem gl'eichen Gemisch mit einem Durchsatz von 450 cm /Stunde, wobei man ständig die optische Dichte des Eluats bei 280 nm mittels eines TJVICOBD-L. K. B,-Analysators misst. Das.Eluat wird in Fraktionen von etwa 20 cm gesammelt,, Das erhaltene Diagramm weisst zwei asymmetrische Spitzen auf. Nach Durchgang der zweiten Spitze (etwa 10 1 Eluat) steigert man in linearer Weise den Mengenanteil Wasser bis auf 100 °/o in dem Gemisch (Gesamtvolumen des Eluats mit Zusammensetzungsgradienten; etwa 22,5 1 ) und beendet dann die Elution mit destilliertem Wasser, bis Fraktionen, die bei 280 nm praktisch nicht mehr absorbieren, erhalten sind (etwa 16 I)₈ Die letzte mit Wasser eluierte absor~ bierende Spitze liegt zwischen den-Fraktionen 950 und 115O₀

Diese Fraktionen v/erden vereinigt (11*61), unter vermindertem Brück (2 mm Hg) auf ein Volumen von 150 cnr eingeengt und darm Xyophilisiert.

!fen erhält so 4,5 g Produkt mit einem Gehalt von 6400 K₀E₀Zg₅ aas nach der elektrophoretischen Analyse etwa 60 ^aß> aktiven !Faktor enthält. ■

•|₉5 g des unter den oben beschriebenen Bedingungen hergestellten Produkts mit einem Gehalt von 6400 KcE./g werden in 15 cnr² einer auf +4⁰C abgekühlten 2 ο Λθ"^ m-Natriumchloridlösung ge«

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Diese Lösung wird am oberen Ende einer Säule von Biogel-P.60, die bei +4 C mit dem gleichen Lösungsmittel ins Gleichgewicht gebracht ist, aufgegeben. Die Säule hat einen Durchmesser von 7,5 cm und enthält gequollenes Gel über eine Höhe von 122 cm, ivas etwa 280 g Trockengel entspricht). Man eluiert mit dem gleichen Lösungsmittel mit einem Durchsatz von 120 cm /Stunde.

•5

Das Eluat wird in Fraktionen von etwa 35 cm gesammelt und seine optische Dichte kontinuierlich mittels eines UVICOED-L.K.B,-Analysators bei 280 nm gemessen. Das erhaltene Diagramm weist eine symmetrische Spitze in seinem Hauptteil mit einer Schulter zu Elutionsbeginn, die das Vorhandensein einer absorbierenden Verunreinigung zeigt, auf.

Man vereinigt die absorbierenden Fraktionen, wobei man diejenigen entfernt, die der eluierten Verunreinigung vor dem

Hauptprodukt entsprechen, d.h. die Fraktionen 65 bis 80

(580 cm ). Man engt unter vermindertem Druck (2 mm Hg) auf

3 ein Volumen von 100 cm ein und lyophilisiert.

ll&iL erhält so 387 mg Produkt mit einem Gehalt von 11000 K.E/g, das nach der elektrophoretischen Analyse nur einen einzigen proteinischen Bestandteil enthält (über 95 ^ch an aktivem Faktor).

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Die medizinisclien Zusammensetzungen, die das erfindungsgemässe Produkt in Anwesenheit von einem oder mehreren Verdünnungsmitteln enthalten und auf intravenösem oder percutanem Y/ege verwendet v/erden können, stellen einen weiteren Gegenstand der Erfindung dar.

Die Zusammensetzungen zur percutanen Anwendung können insbesondere Cremes oder Emulsionen sein»

Die Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung können sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen sein* Als lösungsmittel oder Träger kann man verdünnte wässrige Lösungen von Propylenglykol, Polyäthylenglykol oder Glucose verwenden. Die Sterilisation kann auf verschiedene Weise vorgenommen werden,- beispielsweise mittels eines bakteriologischen Filters oder durch Einbringen von sterilisierenden Mitteln in die Zusammensetzung.

Sie können auch in form von sterilen Zusammensetzungen hergestellt werden, die zum Zeitpunkt' des Gebrauchs in sterilem Wasser oder jedem anderen injizierbaren sterilen Medium gelöst werden können»

Die zu verwendenden Dosen hängen von der gewünschten therapeutischen Wirkung und der Behandlungsdauer ab<, Sie können swi~ sehen 1 und 50 mg Wirksubstanz je Tag für einen Erwachsenen in einer oder mehreren Injektionen betragen«,

Allgemein bestimmt der Arzt die Posologie,die ihm in Anbetracht des Alters, des Gewichts und verschiedener dem Patienten eigener Faktoren, am geeignetsten erscheint«

Das folgende Beispiel dient zur weiteren Erläuterung einer erfindungsgemässen Zusammensetzung:

Beispiel 4

Man löst 1 g Enzym 22 750 RP in 500 cm^ V/asser. Die erhaltene Lösung wird über ein bakteriologisches Filter filtriert. Man verteilt sie aseptisch in Ampullen in einer Menge von 5 cm je Ampulle und lyophilisiert dann. Zum Zeitpunkt des Gebrauchs löst man den Inhalt der Ampulle in 5 cm auf intravenösem Y/ege injizierbarem Lösungsmittel.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   iTbrinolytiscb.es Enzym 22 750 RP₉ dadurch gekennzeichnet₉ dass es ein weisses Pulver ist, das in Wasser sehr löslich, in konzentrierten Lösungen von Neutralsalzen oder Polyäthylenglykol sehr wenig löslich und in wasserfreien Alkoholen und wasserfreiem Aceton, Hexan, Äthylacetat, Äther und den chlorierten Lösungsmitteln unlöslich ist, dass es eine proteinische Substanz ist₉ die Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel enthält und deren Elementarziisammensetzung etwa

   C = 50,4 $> H = 7,35 ^c/o N = 17 & und S = 0,50 f

   ist, dass es im Ultravioletten in wässriger Lösung bei . ·

   210 nm (E^_n. = 187), 250 nm (E₁ ¹^_n = 4„35) absorbiert und

   ι LfUL I Olli

   •I of

   278 nm (E₁.' = 13₉55)_s und dass es ein spezifisches Dreh=

   I Olli

   vermögen von /ßij^ = - 14 + 0^5° (ο = 0,02 fo in Wasser) besitzt.

   Verfahren zur Herstellung des Enzyms nach Anspruch T₉ dadurch gekennzeichnet, dass man aerob Streptomyces yenetus DS 24 288 (IRRL 3987) oder seine Mutanten in einem für diese Art von Züchtung üblichen Medium unter den für diese Art von Züchtung üblichen Bedingungen züchtet und dann das im Verlaufe der Züchtung gebildete Enzym abtrennt und reinigt. '

   In der Humantherapie verwendbare pharmazeutische Zusammensetzungen,- gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem Produkt nach Anspruch 1 als Wirksubstanz₉ zusammen mit einem anderen selbstinerten oder- physiologisch wirksamen Produkt,

   209886/1203 _{BAD 0Rie},_NA_L

   3*

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