SU434662A3 - Способ получения фибринолитическогофермента - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к ферментной промышленности , в частности к получению фибринолитических ферментов. Известны способы получени  фибринолитического фермента путем культивировани  его продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением фермента из культуральной жидкости. Предлагае.мый способ позвол ет получить более активный фермент. Дл  этого в качестве продуцента используют штамм Streptomyces venetus DS 24288 (NRRL) 3987. Способ получени  фибринолитического фермента , названного «Энзим 22750 RP, заключаетс  в том, что микроорганизм Streptomyces venetus DS 24288 или его мутанты выращивают поверхностным или глубинным методом в аэробных услови х на питательной среде , содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, стимул торы роста, сгустители . Перед выращиванием только штамма в производственном ферментере готов т посевную культуру по следующей схеме: хранение- выращивание вначале на агаре, затем во встр хиваемой колбе и в ферментере дл  получени  инокулума. В качестве ассимилируемых источников углерода могут быть использованы углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, декстрины , амидон, меласса или другие насыщенные углеводородами вещества, такие как сахарные спирты, например глицерин или манит , или некоторые органические кислоты: молочна , лимонна , винна . Некоторые животные или растительные масла, например масло шпига или соевое, могут с успехом заменить углеводородные источники или служить добавками. В качестве источника азота могут быть использованы простые химические вещества, например нитраты, минеральные соли или органические соли аммони , мочевины , аминокислоты, а также сложные вещества , содержащие в основном азот в виде протеидов - казеин, лакталебумин, глутен и их гидролизаты, соева  мука, арахидова  мука , рыбна  мука, м сной экстракт, дрожжевой экстракт, отходы пивоваренной промышленности , кукурузный экстракт. Среди дополнительных неорганических элементов некоторые могут иметь действие буферного раствора или нейтрализатора, например щелочные или щелочноземельные фосфаты или карбонаты кальци  или магни . В среду могут быть введены вещества, которые внос т необходимое ионное равновесие в развитие Streptomyces venetus DS 24288 и накопление фермента. Такими  вл ютс  хлориды и сульфаты щелочных или щелочноземельных металлов. Некоторые  вл ютс  активаторами метаболических реакций Streptomyces venetus DS 24288, например соли железа, кобальта . Что касаетс  сгустителей, то обычно используютс  амидон, карбоксиметилцеллюлоза , агар. Вначале выращивани  рН среды устанавливают 6,0-7,8, предпочтительно 6,4-7,5. Выращивание осуществл ют при температуре 23-40°С (25-28°С  вл етс  оптимальной) в течение 1-7 дней. Наиболее удовлетворительный процесс ферментации осуществл етс  при аэрации 0,3- 2 л воздуха на 1 л/мин среды. Энзим 22750 RP может быть выделен из ферментационного сусла и очищен с применением обычных методов выделени  и фракционировани  белковых материалов, при этом активность и степень чистоты продукта контролируетс  соответствующими способами, например определением активности на казеине и электрофорезе. Энзим 22750 RP может быть выделен из ферментационной среды фильтрованием последней в присутствии фильтрационной добавки , фильтрат концентрируют при приведенном давлении, подкисл ют при рН, близком к 4, вновь фильтруют, диализуют потоком дистиллированной воды, затем осаждают фермент добавлением ацетона в диализат. Фермент энзим 22750 RP, полученный гаким образом, может быть затем очищен с использованием обычных физико-химических методов. В .частности, примен емые методы очистки, заключаютс  в растворении фермента в дистиллированной воде, с последующим осаждением при добавлении агентов, в водных концентрированных растворах которых фермент малорастворим, например в средних сол х. Фермент может быть очищен хроматографией на различных основах, например алюминии , целлюлозе в порошке, гел х декстрина или полиакриламида, диализом или подготовительным электрофорезом. Фермент, полученный по данному способу, имеет следующую физико-химическую характеристику . Он очень легко раствор етс  в воде , в водно-спиртовых и водно-ацетоновых смес х, малорастворим в концентрированных растворах нейтральных солей (NaCl; (NH4)2SO4) или полиэтиленгликоле и нерастворим в безводных спиртах, ацетоне, гексане , этилацетате, эфире и хлорированных растворител х . Фермент 22750 RP  вл етс  протеином, вступающим в классические дл  протеина реакции (биуретова  реакци , реакци  Фолина , окращивание красным Нонсо, черным амидом 12 BN или голубым Гомасси). Фермент содержит углерод, водород, кислород , азот и серу. Его элементарный состав следующий, %; С 50,4; Н 7,35; N 17; S 0,50. Нри проведении хроматографии на геле декстрана или геле полиакриламида молекул рный вес фермента равен 40 000±5000. Проведение кислого гидролиза фермента энзим 22750 RP позвол ет вы вить следующие аминокислоты, на 10 г продукта ммоль: аспарагинова  кислота 11,6, треонин 8,5, серин 7, глутаминова  кислота 3,5, пролин 2,5, глицин 13, аланин 7, валин 4,5, метионин 1, изолейцин 2,5, лейцин 4, тирозин 5, фенилаланин 2, лизин 3, аргинин 2,5 и гистидин 2. Физические свойства фермента следующие. Внешний вид: белый порошок (после лиофилизации ) УФ-спектроскопи  (определение из раствора в воде 0,03%): абсорбци  210 нм; EicM 187; минимальна  абсорбци  250 нм; KICM 4,35; максимальна  абсорбци  278 нм; EjcM 13,35. ИК-спектроскопи  (определение на таблетках в смеси с КВЧ). На фиг. 1 изображен спектр, на котором по оси абсцисс с одной стороны отложены длины волн, мк (высша  шкала), с другой стороны число волн, (низша  шкала), на оси ординат представлена оптическа  плотность; на фиг. 2 дана диаграмма результатов, полученных с применением фермента энзем 22750 RP. Указанный спектр изображен на рис. 3, по абсциссе с одной стороны отложена длина волн, мк (верхн   шкала), с другой стороны число волн, (нижн   шкала), и на оси ординат представлена оптическа  плотность. Основные полосы поглощени  дл  данного продукта следующие. Вращательна  способность: (определение на растворе 0,5%-ном в воде). а 2 -14+0,5°; ,2+0,6°; Н -53,5+0,8°; Фермент 22750 RP можно также отличить по его поведению при электрофорезе на геле цетатцеллюлозы при использовании различных буферных растворов: имонна  кислота- вто- рН 2,2; мк 0,09 ричный фосфат натри  ксусна  кислота - аце- рН 4,0; мк 0,1 тат натри  иэтил - 5,5 - барбитуро- рН 8,6; мк 0,075 ва  кислота (барбитал) дкий натр - глицин рН 9,6; мк 0,1 мк-ионна  сила Индикаци  может быть осуществлена колоиметрическими методами или измерением на ротеолитическую активность. Например, при рН 4,0 активный фактор пеемещаетс  к катоду, происходит перемещеkHe 5 мм/2 час, при посто нном напр жении, равном 250 в (интенсивность измен етс  от 6 до 15 ма).

Фермент оказывает вли ние на большое число субстратов, нос щих белковый характер и, в частности на казеин, гемоглобин, фибрин. Очень незначительное воздействие оказывает на этиловый эфир бензоиларжинина (ВАЕЕ) и абсолютно не вли ет на этиловый эфир ацетилтирозина (АТЕЕ).

Воздействие на казеин определ етс  в соответствии с методом Кунитца, примен емой при дозировке трипсина.

Растворимые в трихлоруксусной кислоте пептиды, освобожденные во врем  гидролиза.

измер ютс  спектрофотометрией (измерение оптической плотности при 280 им). Энзиматическа  активность может быть выражена в единицах Кунитца (У, К). В соответствии с определением Кунитца, одна единица составл ет количество энзима, который освобождает достаточное количество растворимых пептидов дл  того, чтобы оптическа  плотность при 280 нм трихлоруксусного фильтрата возрастала до 1,000 в минуту.

В табл. 1 представлены результаты, полученные с применением фермента 22750 RP в сравнении с двум  протеолитическими кристаллизованными энзимами: трипсином и химотрипсином .

Таблица 1

Тромболитическа  и фибринолитическа  активность подтверждена испытани ми на лабораторных животных.

При дозе 0,5 мг/кг, введенной внутривенно, фермент 22750 RP весьма значительным образом предохран ет кролика против виутрисосудистой коагул ции, возникающей при проходе по шейной вене нейлоновой нити, импрегнированной коллагеном. Ускорение фибринолиза может быть вы влено у кролика при дозе 0,05 мг/кг, введенной внутривенно.

Токсичность фермента 22750 RP изучена на многих видах животных. У мыши летальна  доза определена при введении внутривенно 50% (ДЛзо): она составл ет 5 мг/кг; доза одна и та же при повтор ющемс  введении в течение 5 дней и при одноразовом введении. У кролика ДЛбо, введенна  внутривенно, составл ет 1,5 мг/кг.

Благодар  таким свойствам фермент, полученный предлагаемым способом, можно примен ть в терапии дл  профилактики и лечени  венозных тромбов, легочной закупорки

сосудов, тромбозов венечных артерий, артерий конечностей и мозговых артерий.

Микроорганизм - продуцент фермента 22750 RP - принадлежит к Streptomyces venetus DS 24288 (NRRL 3987).

Продуцент выделен из образца почвы, привезенной из Индии.

Выдел ют Streptomyces venetus DS 24288 по известной методике. Согласно последней в стерильную дистиллированную воду ввод т

небольшое количество почвы. Из полученной суспензии готов т пробы различной концентрации . Затем небольшой объем из каждой пробы нанос т на поверхность питательной среды с агаром, наход щейс  в чашке Петри. Осуществл ют выращивание колоний на поверхности среды в течение нескольких дней при температуре 25°С. Затем некоторые колонии изолируют и пересаживают на питательный агар - агар, наход щийс  в наклонном положении, дл  получени  более обильных культур. Streptomyces venetus DS 24288 образует овальные споры размером 0,4-6 мк (чаще 1-1,2 мк). Спорофоры содержат спиральные нити, Которые наматываютс  в 5-8 оборотов, но иногда превосход т это число. Часто встречаютс  спорофоры, располагающиес  на нит х , которые их держат, встречаютс  также спорофоры грозд ми из нескольких элементов . По своей манере спорул ции это начальное звено можно отнести к классу Spira классификации Придхама. Streptomyces venetus DS 24288 хорошо развиваетс  при температуре 25°С и 37°С, плохо при температуре 50°С. Он обладает способностью производить черный меланиновый пигмент в среде, нодход щей дл  тирози)1а. Штамм образует H2S. Нитраты восстанавливают в нитриты. Гидролизует амидон. Желатин сжижаег. Молоко пептонизирует без предварительной коагул ции. Использует целлюлозу. Окрашивание мицелиума происходит поэтапно , в зависимости от среды, в которой он находитс : от желтого к желто-коричневому, коричнево-желтого или темно-коричневого. Растворимые пигменты, которые он производит , имеют обычно коричнево-желтый тон, более или менее темный, в зависимости от среды , в некоторых случа х цвет может быть коричнево-черным. При наступлении спорул ции его воздушный мицелиум окрашиваетс  в голубой цвет. Культуральные и биохимические свойства Streptomyces venetus DS 24288 собраны в табл. 2. Представлены культуры, имеющие удовлетворительную стадию развити , т. е. выращенные в течение трех недель при 25°С. Качества продукта подвергнуты исследованию на питательных агарах и бульонах, которые обычно примен ютс  дл  определени  морфологической характеристики рода Streptomyces. Выращивание на твердых средах проводилось на агарах в наклонном состо нии. Некоторые среды приготовлены по формулам, указанным в «The Actinomycetes, А. О. Ваксман, стр. 193-197, «Chronica Sotanica Company, Waltham . США, 1950. В этом случае эти среды обозначены в табл. 2 буквой В с номером , который был ей присвоен в «The .Actinomycetes . Streptomyces venetus DS 24288 обладает признаками, которые точно не совпадают ни с одной характеристикой культур, ранее описанных и использованных в качестве основы. Фермент 24288 занимает место в известной серии Viridochromogenes, при этом принимаютс  во внимание его свойства производить меланиновый пигмент, обнаруживать воздушный спорулированный мицелий голубого цвета , растительный мицелий от светло-коричневого до темно-коричневого цвета, образовывать растворимые пигмепты от желто-коричневого цвета до коричнево-желтого или очень темного коричневого, в зависимости от среды (органической или синтетической), и представл ть собой спиральные спорофоры. Он не может быть приравнен ни к одному из трех видов, на которые ссылаетс  А. О. Ваксман, и составл ющие эту серию, а именно: Streptomyces Viridochromogenes, Streptomyces chartrensis и Streptomyces cyanens. С одной стороны , он не может быть отождествлен с Streptomyces cyanens, который образует на агаровых средах растительный мицелий, окрашенный в голубой цвет, этого никогда не происходит с ним; кроме того, в противовес S. venetus DS 24288, S. cyanens не использует целлюлозы и не восстанавливает нитраты в нитриты. С другой стороны, он не Jмoжeт быть отождествлен с S. chartrensis, который дает растворимый пигмент зеленовато-желтого цвета к черному на желатине и не дает растворимого пиг.мента на питательном агаре и картофеле, в то врем  как S. venetus DS 24288 дает растворимый пиг.мент коричнево-желтого цвета на желатине, а также на питательном агаре и черный растворимый пигмент на картофеле. Наконец, он существенно отличаетс  от S. Viridochromogenes тем, что последний образует на некоторых средах растительный мицелий , имеющий оттенок очень темно-зеленого цвета, иногда даже зелено-черноватого (в частности, на нитрированном синтетическом агаре с сахарозой, на желатине и на питательпом агаре). S. venetus DS 24288 образует растительный мицелий, который во всех случа х имеет цвет от желто-коричневого до коричнево-желтого и не имеет никогда зеленого оттенка , он также никогда не производит растворимого пигмента темно-зеленого цвета. S. Viridochromogenes не восстанавливает нитраты в нитриты, в то врем  как S. venetus DS 24288 восстанавливает их быстро и активно , как в синтетических, так и в органических средах. А. О. Ваксман относит также к группе «Viridochromogenes некоторое число основных культур, описываемых Гозом и др. (Zur Klassifizierung der Actinomycetes, G. Fischer, Вена, 1958): сравнива  его с последними, которые составл ют основную часть серии Gocrulescens , Гоза, S. venetus DS 24288 находилс  бы в последней группе, котора  включает се основные культуры, среди которых растиельный мицелий на агаре с амидонминеральым азотом Гоза имеет темный цвет и вклюает только два вида: Actinomyces (Streptoyces ) Viridochromogenes и Actinomyces (Streptomyces) coeruleofuscus, S. venetus DS 4288 отличаетс  от вида S. viridochromogees тем, что мицелий последнего на некотоых средах имеет темно-зеленую окраску.

11

12

15

Кроме того, в описании, приводимом Гозом и др., следует отметить, что S. viridochromogenes производит также растительпый мицелий, принимающий темно-зеленый оттенок на молоке , на агаре с амидоном, на картофеле, на агаре с амидонминеральным азотом Гоза и не производит в последней среде растворимого пигмента. По сравнению с ним S. venetus DS 24288 не дает никакого растительного мицели  темно-зеленого цвета в указанных средах и производит растворимый пигмент коричнево-желтого цвета на агаре с амидонминеральным азотом Гоза. Образование растворимого нигмента темно-зеленого цвета на желатине, которое приводитс  Гозом дл  S. viridochromogenes , отсутствует дл  S. venetus DS 24288. S. venetus DS 24288 не может быть отождествлен с 8. cocruleofuscus, который в противоположность ему не восстанавливает нитраты и не использует целлюлозу. Кроме того, 8. соссточники углерода

Использование

D-рибоза

Положительное D-ксилоза L-арабиноза L-рамноза D-глюкоза D-галактоза D-фруктоза 1 -маниоза

Отрицательное L-сарбоза Положител ь ное Лактоза Мальтоза Сахароза

Положительное Трегалоза

Целлобиоза

Рафиноза

Декстрин

Отрицательное

Инулин Положительное

Амидон

Гликоген

Глицерин

Отрицательное

Эритриол Положительное

Адонитол Отрицательное

Дульцит Положительное

D-.маннит Отрицательное

D-сорбитол Положительное

Инозитол

Положительное,

Салицин но медленное

Пример 1. Получение фермента.

200 смЗ культуры Streptomyces venetus DS 24288 рысевают в колбу Эрленмейера и осувдестм . ют культивирова {ие при температуре

16

ruleofuscus не дает растворимого пигмента в агаровой органической среде и на картофеле, в то врем  как 8. venefus D8 24288 регул рно дает на всех испытываемых

средах органического происхождени  растворимый пигмент коричнево-желтого цвета, а на картофеле дает растворимый пигмент черного цвета.

Способность 8. venetus DS 24288 использовать различные источники углерода и азота дл  обеспечени  своего развити  определена в соответствии с принципом метода Придхама и Готтлиба («J of Bacf, 56, 107-114, 1948). Степень развити  наблюдалась на основной

среде, указываемой в предлагаемом изобретении , с заменой глюкозы различными источниками углерода, либо ()2804 различными источниками азота.

Результаты привод тс  ниже.

сточники азота

Использование

NOjNa

Положительное NOsNa

(m,-),so,

(NH,)2HP04 Аденин Аденозин Мочевина L-аспаргин Гликоколль Саркозин

Отрицательное DL-аланин Положительное DL--валкн

L-аспарагинова 

Положительное кислота

L-глутаминова  кислота

L-аргинин|

L-лизин

DL-серин

DL-треонин

Таурин

Отрицательное

DL-фенилаланин Положительное L-тирозин DL-пролин L-гидроксипролин L-гистидин L-триптофан ретаин

26°С, перемешивании и аэрации в течение 28 час.

Выращенную культуру пересевают в фер ментер емкостью 170 л, содержащей стерильную охлажденную среду следующего соста600 Пентон 600 М сной экстракт глюкоза 1200 Гидратированна  120 смз Соевое масло 600 Хлористый натрий Вода дополнение до 110 л с рН 7,0. Перед стерилизацией рН среды устанавливают 7,5 добавлением 120 см 10 н. каустической соды. Стерилизацию среды осуществл ют барботированием пара нри 122°С в течение 40 мин. 40 л культуры нолученной предыдущим выращиванием , внос т в ферментер емкостью 800 л, содержащей среду следующего состава , кг: Кукурузный экстракт (50% сухого экстракта)8 Соевое масло6 л Сульфат аммони 0,8 Гексагидратированный хлорид кобальта0,008 Водадополнение до 360 л Перед введением культуры в указанную среду рН среды устанавливают на значении, равным 6,4 добавлением 450 см 10 н. каустической соды, после чего внос т карбонат кальци  в количестве 2 кг и стерилизуют барбатировацием пара при температуре 122°С в течение 40 мин и охлаждают. После охлаждени  объем среды составл ет 390 л. Объем среды довод т до 400 л добавлением 10 л водного стерильного раствора, содержащего 4 кг гидратированной глюкозы; рН среды становитс  6,6. Выращивание осуществл ют при температуре 26°С, перемещивании центрифугой, аэрации стерильным воздухом в объеме 35 в течение 116 час. В процессе выращивани  рН среды устанавливаетс  6,8. Протеолитическа  активность культуральной среды составл ет 0,4 УК/см. Выделение фермента из среды. В 360 л среды ввели фильтрационную добавку, перемешивают и профильтровывают на фильтрпрессе . Полученный осадок промывают 100 л воды . В результате получают 400 л фильтрата с активностью фермента 0,35 УК/см. Фильтрат концентрируют при 3°С и получают 30 л концентрата с активностью фермента 3,77 УК/смЗ; рП концентрата устанавливают 4,0 добавлением 450 слг 6 н. сол ной кислоты и затем ввод т 300 г фильтрующей добавки. Отфильтровывают , полученный осадок промывают 2 л воды. Осветленный концентрат охлаждают до 4°С, продиализовывают через мембрану из регенерированной целлюлозы в течение 7 час с противотоком дистиллированной воды при той же темпеоатуре. В приготовленный таким рбразом растзор медленно добавл ют при еремешивании 9,6 кг кристаллического сульата аммони  (количество, вычисленное дл  олучени  раствора с 30%-ным насыщением соли), перемешивают в течение 20 мин, затем тдел ют осадок центрифугированием, а в фугат при перемешивании добавл ют 5 кг ристаллического сульфата аммони  (количество , вычисленное дл  получени  52% насыщени ), перемешивают в течение 15 мин, полученный раствор выдерживают 15 мин и центрифугируют . Собирают полученные осадки, добавл ют 1 л дистиллированной воды и раствор подвергают диализу через мембрану из регенерированной целлюлозы в течение 24 час при 4°С в противотоке с 40 л дистиллированной воды. Диализат лиофильно сушат. Получают 70 г фермента активностью 1200 УК/г. После анализа на электрофорезе установлено, что он содержит около 13% активного фактора. Очистка фермента. Полученный вышеуказанным методом фермент раствор ют в 4100 см дистиллированной воды, рН раствора устанавливают 8,0 введением 66 см каустической соды. В полученный таким образом раствор медленно ввод т при перемешивании 1,25 кг полиэтиленгликол  1500, перемешивают еще в течение 15 мин. Раствор оставл ют на 15 мин, затем центрифугируют при температуре 4°С. Активный осадок ввод т в 700 см дистиллированной воды и полученный раствор (800 см) охлаждают до 4°С. При перемешивании в раствор ввод т 4 л изопропанола, охлажденного до -60°С. Собирают активный осадок центрифугированием, затем сушат при приведенном давлении (0,2 мм рт. ст.) в присутствии Р2О5 при температуре, близкой к 20°С Таким образом, получают 30,7 г продукта с активностью 1600 УК/г, содержащего после проведени  анализа на электрофорезе около 20% активного фактора. 10 г продукта, полученного при таких же услови х , ввод т в 400 см дистиллированной воды, и рН раствора устанавливают 8,0 добавлением 3 см каустической соды. В раствор меллеппо добавл ют при пepe тeIпивaнии 26,6 см водного 6%-ного раствора лактата диамино-6.9-этокси-2-акридина. После дополнительного переметиивани  в течение 15 мин и 1 час отсто  центрифугируют в течение 0 мин при 12000 g и температуре 4°С. Неактивный осадок, полученный таким образом , удал ют, а фугат концентрируют при давленщ 0.2 мм рт. ст. и температуре 25°С до объема 25 см. Затем раствор охлаждают до 4°С при перемещивании и добавл ют 250 см изопропапола, охлажденного до -60°С. Полученный активный осадок собирают центрифугированием в течение 15 мин при 12000 ,f и температуре -10°С, затем сушат при давлении 0,2 мм рт. ст. в присутствии Р2О5 и . Получают 4,7 г продукта с активностью 2240 УК/г, содержащего после проведени  электрофоретического анализа около 37% активного фактора. 200 мг, приготовленного в указанных выше услови х продукта, добавл ют в 3 см фосфатного буферного раствора 0,01 М с рН 6,5, 3 см изопропанола и 4 г целлюлозы в порошке дл  хроматографического анализа. Полученную таким образом пасту помещают ровным толстым слоем па верхушку целлюлозной колонки диаметром 3 см, содержащей 80 г целлюлозы в смеси объема к объему изопропанола и буферный фосфатный раствор 0,01 М с рН 6,5 (высота 39 см). Добавл ют буферную смесь фосфат - изопропанол , увеличива  линейное содержание буферного раствора в смеси от 50 до 100% в объемах (общий объем элюента с градиентом композиции составл ет 1,5 л); расход 35 . Элюат собирают фракци ми примерно по 20 см и измер ют оптическую плотность непрерывно при помощи анализатора «УВИКОРД Л.К.В. при 280 нм. Полученна  диаграмма имеет первый очень асимметричный пик, затем па рассто нии второй симметричный пик, соответствующий концентрации буферного раствора 78-92%. Электрофоретический анализ показывает, что второй пик содержит активный фактор. Собирают фракции, соответствующие второму пику (фракции 53-70°С, около 415 см), затем удал ют спирт выпариванием при давлении 2 мм рт. ст.. затем провод т диализ через мембрану из регенерированной целлюлозы с противотоком 10 л дистиллированной воды в течение 24 час при 4°С и сушат лиофильно . Таким образом, получают 43 мг продукта с активностью 6200 УК/г и в соответствии с электрофоретическим анализом, содержащим примерно 55% активного фактора. Пример 2. Зг продукта активностью 1600 УК/г, полученного при услови х, описанных в примере 1, раствор ют в 40 см буферного барбиталового раствора с рН 8,6 мк 0,0375 и этот раствор подвергают диализу через мембрану из регенерированной целлюлозы в течение 48 час с противотоком 10 л того же буферного раствора при 4°С. Раствор осветл ют центрифугированием в течение 15 мин при 12000 g и температуре 4°С, затем нанос т на верх колонки дл  подготовительного электрофореза, содержащей 1,3 кг целлюлозы в барбиталовом буферном растворе с рН 8,6, мк 0,075 (что дает высоту 66 см). Затем подают напр жение 500 в (анод вверху); сила тока 0,46 а; температура внутри колонки 20°С. Эту температуру поддерживают циркул цией в двойной стенке охлаждающей жидкости при 4°С. По истечении первого часа электрофореза окрашенные примеси переход т в анодный отсек. Окрашенный буферный раствор отдел ют и замен ют свежим раствоpo f , Эту бперйЦИЮ повтор ет несколько раз. Удаление пигментов достигнуто почти полностью по истечении 6 час электрофореза. Затем напр жение снижают до 400 в (1 0,32 а) и в нижней части колонны провод т элюирование при расходе 250 противотоком. Элюат собирают фракци ми примерно по 50 см п определ ют оптическую плотность непрерывно при помощи апализатора при 280 нм. По истечении 15 час такого режима напр жение повышают до 500 в (1 0,40 а) и скорость алюировани  противотоком 125 . Через 10 час после начала операции электрофорез прекращают. Затем в колонку сверху вливают барбиталовый буферный раствор из расчета 210 . Полученна  диаграмма представл ет первый маленький пик (к 23 час электрофореза), затем три больших пика, наход щихс  на значительном рассто нии друг от друга. Электрофоретический анализ показывает, что только в третьем пике содержитс  активный фактор . Группируют фракции, соответствующие указанному третьему пику (около 1425 см), концентрируют до 400 см выпариванием при давлении 2 мм рт. ст., затем трижды диализуют в течение 24 час каждый раз с 50 л дистиллированной воды при температуре 4°С. Диализовапный раствор концентрируют до 10 см выпариванием при давлении 2ммрт. ст., затем охлаждают до 4°С. В раствор при перемешивании медленно добавл ют 100 см изопропанола , охлажденного до -60°С. Собирают активный осадок центрифугированием в течение 10 мин при 12000 s и при -10°С, затем сугпат при давлении 0,2 мм рт. ст. в присутствии и температуре 20°С. Таким образом, получают 276 кг продукта с активностью 7000 УК/г и содержащего в соответствии с электрофоретическим анализом около 65% активного фактора. Продукт содержит углерод, водород, кислород , азот, фосфор и серу. Его состав по элементам близок к следующему, %; С 44,0; Н 6.5; N 12.5; Р 0.35; S 0.65. Кислый гидролиз позвол ет вы вить следующие аминокислоты с содержанием на 10 г продукта, ммоль: аспарагинова  кислота 8,5, треопип 7, серин 6.5. глутаминова  кислота 5, пролин 2, глицин 10,5, аланин 7.5. валин 5,5, изолейцин 2. лейцин 3, тирозин 3,5, фенилаланин 1, лизин 2, аргинин 2 и гистидин 1,5. Он обладает следующими физическими свойствами. Внешний вид -бежева  пудра (после лиофилизации ). УФ-спектроскопи  (определение по 0.02%ному раствору -в воде): абсорбци  при 210 нм; 1 205; минимальна  абсорбци  при 250 нм; Б{°С„ 7,8; максимальна  абсорбци  при 278 нм; ЕГсм 14,1. ИК-спектроскопи  (определение по таблет кам р смеси с КВЧ), Ниже даютс  основные полосы ИК-абсорбции дл  нродукта. Вращательна  способность: определение по раствору концентр а цпей 0,5% в воде;5

Реакци  ротеолиз

ибринолиз Эстеролиз

Пример 3. 22,8 г продукта, полученного при услови х по примеру 1 с активностью 2400 УК/г, добавл ют в 480 см дистиллированной воды; рН раствора равен 7,4. Последующие операции провод тс  при температуре + 4С.

Раствор нанос т сверху целлюлозной колонны диаметром 15 см, содержащей целлюлозу , импрегнированную дистиллированной водой на высоте 17 см. Оптическую плотность элюата измер ют непрерывно при помощи анализатора при 280 нм. Полученна  диаграмма представл ет собой асимметричный пик, содержащий энзим, в то врем  как следы диамино-6,9-этокси-2-акридина, содержащегос  в продукте, остаютс  на целлюлозе. Элюат, соответствующий абсорбирующ,им фракци м, собирают (например, 6,9 л) и концентрируют при температуре, не превышающей 25°С, при давлении 2 мм рт. ст. до 480 см.

475 см предыдущего концентрата разбавл ют 205 см изопропанола, охлажденного до -10°С, и полученный раствор нанос т сверху колонны из целлюлозы, импрегнированной смесью изопропанола и воды, содержащей 30 об.% спирта. Колонна диаметром 15 см содержит 600 г сухой целлюлозы (высота целлюлозы 7 см). Добавл ют ту же смесь из расчета 450 и измер ют непрерывно оптическую плотность элюата на 280 нм. Элюат собирают фракци ми по 20 см. Полученна  диаграмма представл ет собой асимметрические пики. После прохождени  второго пика (около 10 л элюата) пропорци  воды линейно возрастает до 100% в смеси (общий объем элюента с градиентом композиции примерно 22,5 л), затем разбавл ют дистиллированной водой до получени  фракций, поглощающих не более 280 нм (например, около 16 л). Последний абсорбирующий пик, разбавленный водой, находитс  между фракци ми 950 и 1150,

Эти фракции собирают (примерно 11,6 л), концентрируют при давлении 2 мм рт. ст, до объема 150 см , затем сушат лиофи,дьно,

Активность (УК/г)

Вещество

Казеин

7,000

азо-Казенн 15000 1000

Желатин

Сгусток бычьего фиб2500 рина

Сгусток плазмы кролика

4100 200000 Сгусток плазмы саба к и

ВАЕЕ

3000 АТЕЕ 500

Таким образОМ, получают 4,5 г продукта с активностью 6400 УК/г и содержащего по электрофоретическому анализу около 60% активного фактора. 1,5 г продукта, полученного при вьпиеописанных услови х и с 6400 УК/г, раствор ют в 15 см раствора хлорида натри  2 , охлажденного до +4°С. Раствор нанос т сверху колонны биогел  Р 60, диаметром 7,5 см, уравновещенной тем

же растворителем при и содержащей набухший гель на высоте 122 см (что соответствует примерно 280 г сухого гел ). Элюируют тем же растворителем из расчета 120 . Элюат собирают фракци ми примерно по 35 см и измер ют его оптическую плотность непрерывно при помощи анализатора при 280 нм. Полученна  диаграмма представл ет собой симметричный пик с выступом в основной части при начале элюировани , что доказывает наличие абсорбирующей примеси.

Абсорбирующие фракции соедин ют, удал   примеси соответствующие элюированной до элюировани  основного продукта, т. е.

фракции 65-80 (например 580 см); концентрируют при давлении 2 мм рт. ст, до объема 100 см и лиофилизируют.

Таким образом, получают 387 г продукта с активностью 11000 УК/г и содержаихего по

электрофоретическому анализу только белковый препарат fболее 95% активного фактора ) .

Предмет изобретени 

Способ получени  фибринолитического фермента путем культивировани  его продуцентов , на питательной среде, содержащей источНИКИ углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением фермента из полученной культуральной жидкости, отличающий с   тем, что, с целью повышени  активности (Фермента, в качестве продуцента используют Streptomyces venetus DS 24288 (NRRL 3987). -10,3+0,3°; -17,7±0,3 Активность продукта на различные вещества приведена ниже: 4 5 -1111111 WO ma 2000mo

2275U ЯР

+ Трипсин

0 )(UMOmpUt1CUH

9

. .

-f

L,-,-L7 8

i / 4 ...-/ 3 W15 20 50 50 11111111r woo500 CM

мк 2,55

fl

0,20 ,. 0,В

15 20 30 50 If

8 9 10

t I I I I

woo

2000

ftOOd

1500WOO

Фиг. 5