DE1922601A1 - Neue Enzyminhibitoren und ihre Herstellung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Enzyninhibitor, der »it der Nummer 19 042 HP bezeichnet wird, seine Hauptbestandteile, die mit den Nummern 21 052 RP und 21 05? RP bezeichnet werden, und ihre Salze, ein Verfahren zur Herstellung von 19 042 RP, ein Verfahren zur Isolierung von 21 052 RP und 21 053 RP aus dem 19 042 RP und die Medikamente, die zumindest eines dieser Produkte als Wirksubstanz enthalten»

Die neuen Produkte weisen ein gang besonderes Interesse als Hemmstoffe für Trypsin auf* Ausserdem besitzen sie interessante antifibrinolytisohe und antlkoagulierende Eigenschaften.

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Der Enzyoinhibitor 19 042 Rp kann durch Züchtung ©ines Mikroorganismus, der dem Genus Streptoroyces angehört und mit "Streptomyces hygrosaopicus DS 10 4ö8^H bezeichnet wird« in künstlichen Medien erhalten und durch physikalischchemisch« Methoden in seine Bestandteile getrennt werden_β

Der Enzyminhibitor 19 042 RP 1st, so wie er nach dem flndungsgemSssen Verfahren erhalten wird, ein Gemisch von ^ mehreren Bestandteilen, von denen gewisse in Form von SaI-* ' sen mit Mineralsäuren, wie beispielsweise den Hydrochloric den und den Sulfaten, vorliegen

Der Enzyminhibitor 19 042 RP und sein® beiden Hauptbestandteile 21 052 RP und 21 05? RP sind in Form des Sulfats und Hydrochloride in Wasser und in verdünnten Säuren sehr löslich, in wässrig-alkoholischen Gemischen (wässriges Methanol und Ethanol) und in Wasser Aeetoäi-Gemischen löslich und in wässrigen konzentrierten Lösungen von Neutralsalzen {natrium·» Chlorid, Ammoniumsulf&v), iimsserfrelen Alkoholen* Aceton, Hexan, Xthylacetat, Xther und chlorierten Lösungsmitteln (Chloroform) sehr wenig löslich*

19 042 RP, 21 052 RP und 21 053 RP liefern mit den folgenden Reagentien positive Teste: Biuret-Reagens, Reagens nach Po3Lis_£ Reagens nach Relndel (Hypochlorit und o-Tolldin)« Reagens nach Ehrlich (p-Dlmethylaminobenzaldehyd), mit dem sie ©in© gelbe Färbung ergeben, Reagens nach Sakagunhi (Hypobromlt und α-naphthol), Reagens nach Milko und Jones (Nitroprussld und Ftrricyanid), Reagens nach Loring (Pikrinsäure in alkalischem Medium), mit welchem sie eine orange Färbung erge» ben, Reagens nach Wolfrom und Miller (Perjodsäure, Permanganat und Benzidin), Reagens nach Orönwall und Koiw (Perjodsäur« und Fuchsin), Nlnhydrln-Reagens nach Hydro; Si©

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liefern sit den folgenden Beagentlen negativ· Testet leagens nach Oerngross {a~tfitroso~e-naphthol und Salpetersäure >_t Reagens n&eh Pauly Cdlasatierte SulfsnllsMure), Reagens nach Toenniea und KoIb (Jodplatlnat oder Vtropruaaid), Reagens nach Sanger und Tuppy (p-Aniaidin), !tsag*sr: nach Bial (Orcin); Reagens nach Partridge (Naphthoreso ^ln) und Reagens nach Morgan und Bison (Acetylaceton und p-Dleethylamlnobensaldehyd).

Die saure Hydrolyse dea Siizyminhibitore 19 042 RP oraugliohte, die folgenden Aminosäuren nachzuweisen: Arglniin« alanin, Prolin und Valin und sieben Guanidine.

Das 21 052 BP enthält in Pom des Sulfats Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stlokstoff und Schwefel. Seine EIe mentarzusamnensetzung 1st etwa die folgendet

C - 43,3 % H - 6,0 Jt 0 - 18,2 % M- 21,2 % und

S - 4,5 %.

Dieses Produkt als Sulfat kann durch Einwirkung von Baryu»- ohlorld In das Hydrochlorid übergeführt werden.

Das 21 053 HP enthält in Pom dea Hydrochloride Kohlen*toff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Chlor. Seine lleaeotar· zusammensetzung ist etwa die folgende:

C - 49,5 % H - 7,1 % 0 » 17,5 % N- 21,8 % Cl · 4,9 Jl.

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Dieses Produkt als Hydrochloric! kann durch Einwirkung von Silbersulfat in das Sulfat Übergeführt werden.

Die Hydrolyse von 21 052 RP und 21 053 RP hat ermöglicht, die folgenden Aminosäuren nachzuweisen? Arginin, Phenylalanin, Prolin und Valin in einem Verhältnis von 1s1s 1 s5 und sieben Guanidine. Ausserdem liefert das 21 052 RP ein Produkt, das in der modifizierten Reaktion nach Siphonelli eine für a-Diole charakteristisohe Färbung liefert.

Das 21 052 RP in Form des Sulfats und das 21 053 RP in Form des Hydrochloride zeichnen sich durch die folgenden physikalischen Eigenschaften aus:

Aussehen; Weissliche amorphe Pulver

Ultraviolett-Spektren (Bestimmung mit Lösungen mit 0_p05 %

in Wasser)

Wellenlängen	JS 1 * E 1 cm	21 052 RP	21 053 RP
200 nm 243 nm (Absorptions minimum} 257 nm (Absorptions- tnaximum)	435 4,5 5/25	530 2,9 3,4

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Infrarot -Spektren

(Die Bestimmung iturde an mit Kaliumbromid verpressten Produkten vorgenommen)

Diese Spektren sind in Fig. 2 (21 052 RP) und 3 (21 053 gezeigt« in denen als Abszissen einerseits die Wellenlängen in Mikron (oberer Massstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm" (unterer Massstab) und als Ordinatsn die optische Dichte aufgetragen sind.

Zn der nachfolgenden Tabelle I sind die Hauptbanden der Infrarot-Absorption dieser beiden Produkte angegeben»

	St	21 052	RP	Tabelle	St	I	St	21 <	)53 RP	1175	sch
	St	1525	Sch		Sch		Sch	1525	Sch	1125	sch
3350	ra	1505	Sch	1115	sch	3340	m	1505	Sch	1100	m
3200	Sch	1495	Sch	1030	sch	3260	m	1495	Sch	1030	Sch
2960	sch	1470	sch	995	Sch	3190	Sch	1465	sch	995	R
29*0	Sch	1450	m	970	ssch	2960	m	1450	m	945	sch
2875	Sch	1445	ssch	945	sch	2940	Sch	1430	Sch	910	sch
27*0	Sch	1435	Sch	910	m	2880	Sch	1390	m	860	sch
1730	8St	1390	m	860	Sch	2750	Sch	I33O	sch	740	Sch
1715	m	138O	ssch	740	m	1735	SSt	1295	sch	720	Sch
1655	et	1250	sch	715	St	1720	St	1230	m	695	η
1640		1220	Sch	695		1645		1225	m	630	Sch
1545				615		1545				590	St

SSt

sehr stark st * stark m » mittel

sch · schwach

ssch

sehr schwach

Sch * Schulter

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Drehvermcjgen (Bestimmung nit einer Lösung mit O«9 % in

Wasser}

	Wellenlängen	21 052	RP	[«]20	21	053	RP
		- 22° +	1		- 23,	5° ±	1°
589	nm (D-Linie von Natrium)	- 45,5°			- 46,	5° ±	1,5°
436	nm	- 71° ♦	2»	1,5°	- 71,	5° +	2°
365	nm

Bei der aufsteigenden Papierchromatographie (Papier Arches 302) verhalten sich der Ensyminhibltor 19 042 RP und seine beiden Hauptbestandteile 21 052 RP und 21 053 RP in identischer Weise. Die mit verschiedenen Entwicklungelösungsmitteln erhaltenen Rf-Werte sind in der nachfolgenden Tabelle IZ angegeben (Entwicklung bei 2O⁰C, Nachweis durch kolorimetrisch« Methoden oder durch Messung der Antitrypsinwirkung oder dwsder antikoagullerenden Wirkung).

Tabelle II

Entwicklungslösungsmittel	Rf
Butanol-Essigsäure-Wasser (4:2*4 Volumina) Bu tanol - Py r id in-.Esa ige 8u re »Wasser (30§20x6:24 Volumina)	0,80

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Der Enzyminhibitor 19 042 HP und seine Bestandteile verhalten sich bei der Elektrophorese in identischer Weise, und sie können durch elektrophoretisch© Wanderung auf Cellulose« acetatraerabran unter Verwendung verschiedener Puffer identifiziert werdens

Citronensäure-Dinatriumphosphat pH « 2,2 μ · O_PO9

E&slgsäure»Natriumacetat pH » 4 μ »0,1

5,5°Biäthylbarbitursäure pH * 8,6 μ * 0,075

Nat ronlauge-Glycin pH « 9*6 μ, * 0_s1

Die Nachweismethoden sind die gleichen« wie sie für die Chromatographie verwendet werdenο

Gleichgültig welcher Puffer verwendet wird, wandert der grössere Teil des Produkts nach der Kathode hin. Beispielsweise findet bei pH » 8_C6 eine Verschiebung von 30 bis 32 mm/30 min bei einer konstanten Spannung v&n 250 Volfc (Stromstärke variierend von 4 bis 6 BiA) auf*

Die antlenzymatieche Aktivität von 19 042 HP und seinen Bestandteilen kann durch ihre GXrqi die Konzentration, die unter den Bedingungen der gegebenen enzymatlschen Reaktion die Aktivität des vorhandenen Enzyms zu 50 % Inhibiert» charakterisiert werden (Tabelle XIX).

Die ant!enzymatisch« Aktivität wird nach den folgenden bestimmtι

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8 -

Anns, At I, TRAUTSCHOLD und £. WBRLE, "Methods of Enzymatic Analysis"» H. U. BSRSMEYBR Ed₀, Aoad, Press., Seite 880 (1963)

Ann. B: W. RICK, "Methods of Enzymatic Analysis"« H.U„ BERQMEYER Ed., Acad. Press,, Seite 815 (1963)

Anm. Ct idem, Seite 311 Anm. Os idem, Seite 800 Anm. E: idem, Seite 819 Anm. Pi F. MARKWARDT, KoOo HAÜSTEX13 und H₀P.

Arch. Intern. Pharmacodynara», V%2,

Os L.R, CHRISTENSEN, J. Ciin, Invest.,

Anm, Hs D.L₀ KLINE, "Methods in EBsyeiology⁸"_e S₆Fo e©2,@öä@k und NoO. Kaplan Ed .„ Aesß₀ Press „«, (1955).

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Tabelle III

i	O	! *	__-	Reaktion	Reaktions- bedingungen	Tempe ratur	50 % Hemmkonrentration in mg/1	21 052 RP	21 053 RP
	O ta es»	B		PH	25*C	19 042 RP	35	29
	cn	C	B®£®i?©iys® VOK BASE durch K&mkraln (a)	8.0	25*C	26,5	0.4	0.43
	«** w>	D	K^ ^ £*o Iyate von BASE durch Tsfpsiiü (b)	7.7	37#C	0,4	0.15	0e15
	E	pFS'teolys® von Casein durch Tpyp«in (c)	7.6	37PC	0,16	135	185
	F	Proteolys« von Casein durch Ctifa&trypsin (d)	7.6	25*C	2.05	>400	>400
@ H	Prsteelyse von Haemoglobin cUsreia Pepsin (e)	1,8	37*C	>400	10	9
PibrSnolyse eines aus Kaninehen- pl«s»a gebildeten Qerinsels durch Streptokinase (f)	7,5	37*C 37*C	4.5	35 34	21 35
FIbrinolyse ^inea aus gereinig ten Binderflbrinogen gebildeten Cteriaaels durch Urokinase (g) gereinigtem Koagulation von/Rinderflbrinoeen durch Thrombin (h)	7.4 7.4	21 32

Fortsetzung Tabelle III

co co ω cn

Kopsen trat ionen an Bnzye und an Substrat»

(a) Eallikretai 700 £/1

(b) kristallisiertes Trypsin: 2,5 mg/1 (β) &rietallisiertes Trypsin: 1,5 ng/1

Cd} kristallisiertes Chymotrypsinι 2,5 rag/1 Ce) kristallisiertes Pepsins 1*66 mg/1 Cf) Streptokinase s 10⁵ B/l

Urokinase 14 000 £/1

!gereinigtes Hinder plasminogen: 175 rag/1

Thrm&WiM 5000 E/l BAJSE:

5*10

m (Xthyleeter des Benzoy larglnlns )

BAEE:	5·	10**4 m
Casein:	5	g/1
Casein:	5	g/1

Haemoglobin: 16,6 g/1 Kaninchenplasmas 4θΟ ml/1

gereinigtes Rinderfibrinogen: 3*6 g/1 gereinigtes RinderfIbrinogen: 10 g/1

Di« antlensyaatlsehen, antIfIbrinolytIschen und llsrenden Eigenschaften wurden bei LaboratoriuMuieren be-

So seist sich dl« Aktivität auf die

gegenüber einer Trypalnlnjektion auf intravenös«» Ute· der Ratte durch eine OE₅₀ In der Nähe von 20

Die antiflorinolytisohe Wirksamkeit bei Kanister ist Jenigen der £ -Anlnoeaprone&ure bei intravenöses* shung !Äquivalent [p. MARICWARDT u. Mltartu_e Avzfo

225 (1964)3.

antikoaguXlerende Wirkung wird beia Hma <Sni*@li ¥®i*abrei·

aisf irtrav*n^?.eK Wege beetimt, Sie- SSiitesg ?Mf die l©wtll-Seit und mt ui% Ppothrrabin-Zeit !»trist «fewm 1/10

۩fJenigen von

sff äE.^

dea Rme f^^S&c-äl. ιριρ® die

το»

M0RD8XNDN, DIXSCiK und

(1965)].

Haut

Die letale &@»i« 5C^ % oder SIW «^^@ tei fer*bauf intraperltoneale« Weee beatlBBt, gi# liegt swlcehen JSOO und 1000 og/kg. Bei oraler Vem&reietaig t&t das 19 042 RP bis sti einer Dosis w@a 100€

In der fSueantharapie sind 19 042 RP und seine Bestandteile besonders als Antifibrlnolytioa intereesemt. ~$$iv Stoasobsn kaxm ssiUE bei Verabrelohuiss auf intraveausee

009835/ 19811 8AD original

Wege tägliche Dosen zwischen 5 und 50 mg/kg verwenden; bei Verabreichung auf oralem Wege kann man tägliche Dosen zwischen 50 und 500 mg/kg verwenden*

Der den Enzyminhibitor 19 0^2 RP erzeugende Organismus gehört zum Oenus Streptomyees und wird mit "streptomyces hygroseopieus DS 10 *K>8" (NBRL 3286) bezeichnete

Dieser Organismus wurde aus einer in Frankreich In der Normendie entnommenen Erdprobe isoliert.

Die Isolierungsmethode ist die folgendes Die entnommene Erdprobe wird in sterilem destilliertem Wasser suspendlert^ ηηύ die Suspension wird dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Sine kleine Menge von jeder Verdünnung wird auf die Oberfläche von Petrischalen aufgebracht» Ulm ein geeignetes Nähragamedlum enthalten« Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 26°C werden die Kolonien der Mikroorganismen» di® man isolieren will, auf Sohrägagar versetzt« um reichlichere Kulturen zu erhalten.

Dieser Organismus gehört zum Genus Streptomyees nsnd sehlioset sich im spezielleren an die Species S. hygroscoplcus an» deren wesentliche Charakteristiken von H₀D₀ TRESNEH und E,Jc BACKUS (Applied Microbiology, 4, 24>250, 1956) und von S.A. WAKSMAN (The Actinomyeetes, II, The Williams and Vfilkins Company» Baltimore» 1961» Seite 230 - 25t) definiert wurden. Aus diesem Grund wird der das 19 042 RP erzeugende Organis·» mus als zu dieser Species gehörend angesehen und Streptomyees hygrosoopicus DS 10 408 genannt«

S. hygroecoplcue DS 10 4θδ weist die drei Charakteristiken der Species S. hygroacopious» die von H.D. TRSSNBR und S,J. BACKUS und von S.A. WAKSMAN definiert wurde«, aufs

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a) Seine Sporenfäden enden im allgemeinen in dichten Spiralen mit einer Aufwicklung mit einer variablen Anzahl von Windungen, zumeist 1 bis 5, obgleich man gelegentlich auch längere Spiralen beobachtet, die eine grussere Anzahl von Windungen aufweisen; diese spiralförmigen Sporenfäden sind auf den Fäden, die sie tragen, manchmal isoliert, häufiger jedoch In Form von Trauben angeordnet$

b) der sporullerte Luft«auegesetzte Teil zeigt, wenn er ein gutes Entwieklungestadium erreicht hat, eine dunkelgraue Färbung, die derjenigen entspricht, eile die Species S* hygroscoplous zeigt}

o) auf gewiesen Züchtungsmedien, die eine gute Sporulatlon ermöglichen, treten durch Alterung in den sporn Her ten Zonen schwarze9 glänzende, feucht®, für die Speclee S. hygrosoopious charakteristische Oberfliehen auf, Bel S. hygroseoplcus OS 10 4O8 wird die Umwandlung des dunkelgrauen Sporentepplohs zu» schwarzen überzug insbesondere auf Agar nach HZCXBY und TRBSNER, Agar Kit Hafer nach CARVAJAX,* Agar mit Stärke nach FRZDHAM und Agar ait Stärke nach ORUHDY beobachtet.

Die von den Kulturen von S. hygrosoopleus CS 10 4o8 gezeigten morphologischen Charakteristiken sind insgesamt denjeni- * gen der Beschreibung von 3, hygrosoopicus sehr ähnlich, die in The Aotinomyoetes (S.A. WAXSMAN) gegeben ist; die einzigen merklichen Unterschiede, die festgestellt werden können, bestehen darin, dass S. hygroscopic^** DS 10 4o8 im Gegensatz sts dem in The Aetlnomyeetes beschriebenen Stamm «in hellgelbe» lösliches Pigaenfe auf Gelatine liefert, keil?,® AnsXuerung von Ki'iah hervorruft und auf Bouillon nach Czapek mit Saccharose Nitrate zu Mifcpä&en reduziert« Diese Unterschiede sind jedoch nach den Eggi*£ff«n von HD. TRSSNER und 8. J. BACKUS nicht ausreichend gross, um diesen Organismus als eine

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Species anzusehen, die von der Species S. hygrosoopicus verschieden 1st, deren Hauptmerkmale, die zu ihrer Definition dienen, dieser Organismus im übrigen aufweist.

So hygroBcopioua DS 10 408 bildet Sporenfäden, die reeist ens In dichten Spiralen enden, die im allgemeinen 1 bis 5 Win» düngen aufweisen, obgleich man gelegentlich Spiralen beobachtet, die eine grussere Anzahl von Windungen bilden, oder auch gelegentlich SporenfBden, dl® einfach an Ihrem Endteil gekrümmt sind, ohne eine vollständige Windung zu bilden, auch manchmal mehr oder weniger schlaffe und auseinander wickelte Spiralen» Der Sporenteil mist raeisttne eine zierte Struktur auf: LKngs des Haup&sipor@nf&tans₉ cter «ta© ziemlich grosse LMnge haben kann, sisst SpöFsaflMeii dia ihrerseits mehr oder weniger verzweigt ssiis feH§m®is ₀ tel das Ganze eine Traube bildet. Bis Spore» sind oval haben Abmessungen von etwa 0?% big Q₀(S p/@_g6 S»ls ö_£p ^ skopisohe Prüfungen, haben eine Idesfesseti« örgesisafeloa Sporenteile auf Agar nach BEMNETf mmü auf Agar mit stärke nach PRZDHAM gezeigt.

Die Züohtungeoh&ritltt^ietikdn und di@ schäften des S. iit^reäsopieus BS 1© koB wurden Welse zur Prüfung ms Auasetens von Stämmen von verwendeten NKhragar und NXhrbouillons geprüft, wobei die Eni< türen auf Agarmedien auf Schrfigagar durchgeführt wurd©n» Die Beobachtungen sind in der nachfolgenden Tabelle IV ange·» geben. Ohne genaue Angaben betreffen sie Kulturen, die etwa ein Alter von 3 Wochen bei 26⁹C haben und ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben. Zahlreiche der verwende* ten Zttohtungsmedlen wurden nach den Rezepturen hergestellt, die in "The Aotinoaycetea*, S.A. WAKSMAN,.Seite 19? - 197, Chronloa Botanioa Company, Waltham, Mass. ₉ U.S.A., 1950,

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angegeben sind, in diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W, dem die Nummer folgt, die ihnen in "The Actlnonycetes" gegeben wurde, bezeichnet. Die Literaturstellen für die anderen Züchtungsmedien oder die Zusammensetzungen derselben sind die folgenden:

Anm. A« K„L_a JOHES - Journal of Bacteriology, Jg£, 142, 1949

An¹TJ₀ B: "Hiekey and Tresner*s Agar", T₀O, PRIDHAH u. Mitarb., Antibiotics Annual, 195© - 1957· Seite 947-953

Anns. 6s "Yeast Extract Agar'· -T₀Go FRIDHAM u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956 - 1957, Seite 947-953

Anm. Ss ORUKDY u» Mitarb., Antibiotics and Chem., 2, 4θΟ, 1952

Ans), Es ORUKDY u, Hitarb«., Antibiotics and Chem „, 2, 401, 1952

Ana. Fs 0,5 % Pepton, 0,3 % Fleischextrakt, 0,5 # Tyrosin, 2 % Agar

Ot "la©rganio Salts - Starch Agar" - T.G. FRIDHAM u. Mitarbo, Antibiotics Annual, 1956-1957« Seite 947-953

H: QRUHDY u. Mitarb. _} Antibiotics and Chem.. 1, 310, 1951

Anas« Xs entspricht der Rezeptur W 1; wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind

Ann. Js "Plain Gelatin*, hergestellt nach den Angaben von

"Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria", Society of American Bacteriologists, Geneva, H.Y., «50-18

Anm. Ks Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria_c Society of American Bacteriologists, Geneva, HoY.,

H₅₀-Ie

Anm. Lt entspricht der Rezeptur W 18, wobei die Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapierstreifen, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen, ersetzt ist

Anm. Ms von H,D, TRESHER und F₀ DAHGA, Journal of Bacteriology, 76, 239-244 (1958), zur Untersuchung der Produktion von HgS angegebenes Medium

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Ana. Vt "Melanin formation medium", Th* Aotinomycetes Band 2, Seite 132, Nr. 42, S.A. WAXSMAN₇ The Williams and Wllkins Company, Baltimore, 1961

Ana. Ot Handelsübliches Magertallchpulver, naeh ύ@η Angaben des Herstellers zubereitet

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Tab·!!· IV

α» <*> cn

5 >

Kultunedina CD	Ent wicklung« »	■	Vegetative« Kyoel oder Unterseite der Kultur O)	Teil (umfasst die Oesaetheit von Luft-ausgesetztem Myeel und Sporu- lation) {*)	Lösliches Pigment	Beobachtungen und biochemische Eigenschaften
Agar nach (Ana. A)	grsd IS)	hellbraun- llohgelbe Unterseite	grau; gut entwickelt	gelb bis hellbraun- gelb
Agar nach (M ST	«ehr gut	hellbraun- gelbe Un terseite	weissllch; ziemlich gut entwickelt	hellgelb braun
Agar nach Biokey und Treaner (An«. B)	gut	braungelbe Unterseite	gut entwickelt; hellgräulich bis grau mit für ^Hygroseopieus" charakteristischen schwarzen Stellen	gräulich- gelbbraun
Agar «it Hefeextrakt nach	sehr gut	gelb bis gelbbraune Unterseite	welsslieh bis grau; gut entwickelt	gelb bis gelbbraun
(An«. C)	gut
Agar «it Hafer nach Carrajal (An«. D)		gelbe bis gelbbraune Unterseite	ziemlich gut ent wickelt j grüulloh- welss bis grau «it für "Hygroscopicue" oh*rak;fc#ri *t i*pb#n	gräulich- braungelb
	gut		sohwarsen Stellen

-4

co

K) cn CD

(D	(2)	(3)	weiaelioh bis gelblichweise; H&aaig entwik- kelt	(5)	(6)	1922601
Olucoae- Pepton- Agar (W 6)	zltmllQh gut	braungelbe■bis heilorangebrau- ne Unterseite	Spuren; grau- lich-weiaa graulioh-weissι müaelg ©ntwik- kelt	hellgelb braun bis heilorange braun
MAhT- agar (W 5) Glucose- AeiMurautln-	BÄseig massig	ziemlich gut e -wickelt; gaiöllchgrau bis hellbräun- 1ichgelbj gelb liche Hntersei» te hellgelibe üntf ^ selte	grSull@h-weiss j sehr Aussig ent wickelt	keines keines oder schwach gelb lieh	Lösllchmaohung des Malatss positiv, jedoch langsani
Agar (W 2)	ziemlich gut	hellbräunllßh» ,gelbe Unter seite	weisslioh bis gräulichs in For® von Spuren	hellgräullch- gelb
Glycerin- Asparagln- Aear (W 3)	spärlich	ungefärbt bis ,wel33li<2hf spli»li&h ent-	keines
Agar alt C&XelUMBalat nmch Kralnsky (Aim c E)

O O co OO ω on

co OO

	(2)	O)	(4)	(5)	(6)	« I » a j
Agar mit Tyrosin (Anm. F)	massig	gelbe bis gelb braune Unter seite	weissllch bis grttulich; massig entwlk- kelt	brätsnllohgelb bis gelbbraun	Löslichma- chung des Tyrosine s positiv, je doch langsam
Agar mit Starke (W 10)	spärlich	hellgelblioh- weisse Unter seite	weisslieh; in Form, von Spuren	keines	Hydrolyse der Stärke: posi tiv Jedoch langsam
Agar mit Stärke naoh Pridham (AiUB9 0}	ziemlieh gut	hellgelbe Un terseite	gräulloh-weiss bis grau mit kleinen für nHygrosoopicusN charakteristi- sehen schwar zen Stellen	wenig inten siv gräulich gelb	Hydrolyse von Stärke: posi tiv
Agar ait Stirke nach Srundy (Ann. H)	ziemlich gut	gräulichgelbe Unterseite	gräuilch-weiss bis grau und schwarz wachs- artig; typi sches Aussehen von "Hygro- scopicus"	wenig inten siv gräulich- gelb

CO K) N)

J-O

O O (JO CO CO

(D	(2)	(3)	(*)	(5)	(6)	19221
Syntheti scher Agar nach Czapek mit Saccharose (W D	ziemlich gut	sehr gut ent wickeltes, ge faltetes ve getatives My- cel mit Nei gung, riasig zu werden; gelb; hellgel be Unterseite	weiselieh bis hellgrHulioh; spärlich ent wickelt	schwach brSunlich- gelb		UJ O
Syntheti scher Agar nach Czapek mit Glucose (And» I)	ziemlich gut	gelbe Unter seite	weisslieh; massig ent wickelt	schwach gelb	ziemlich gute j Verflüssigung J der Gelatine ] I i
Kultur auf Kartoffeln (W 27)	gut	dickes und ge» faltetes vege tatives Myeeli gelb	weisslich bis hellgrSulich; massig ent wickelt, Exsu- äatlon'von klei nen goldgelben Tröpfchen	schwach gräulich gelb
Reine Ge latine mit 12 % (Anra, J)	ziemlich gut	Kultur an der Oberfläche gut entwickelt$ gelbe Untersei te	weisslich bis hei!gräulichs massig entwik- kelt	hellgelb

(D	(2)	O)	»s»	(*)	(5)	(β)	I
Xltrat-	massig	geiblich-	kleine Kolo	keiner	keines	Prüfung von
MXhr-		weIsser	nien mit hell			Nitriten:
bouillon		Ring	gelblicher Un			negativ im
(Ana. K)			terseite, an			Verlaufe von
			der Oberfläche			nach 24 Stunden*
			kleine Kolonien			48 Stunden» 8 Ta^
			mit hellgelbli			gen, 15 Tagen cd
	•		cher Unterseite.			und 1 Monat KuI-ro
			an der Oberflä			tür durchgefUhr-Kj
			che			ten Versuche cn
					O
Stärke-	massig und		weisslieh,	keines	Untersuchung von—*
Nitrat -	lanfiffnin		in Form von	bis sehr	Nitritens positiv
. Bouillon			Spuren	blassgelb-	nach 1-wuchiger
(W 19)				lioh	Kultur
Bouillon	massig und		weisslieh«	keines	Untersuchung von
nach	langsam	in Form von		Nitriten: positiv
Czapek		Spuren		nach 1-wuohiger ι
mit Saccha				Kultur, wird '
rose				rasch negativ
(W 18)				nach 2-wöchiger ι
				Kultur
Bouillon	keine Ent
nach	wicklung			Verwertung von j
Czapek mit				Cellulose: nega
Cellulose				tiv
(An». L)

i ο)	(2)	(3)	(^)	(5)	(6)
ζ Agar naeh Xreaaer und SWS» (Ana. K)	■ittel- ■Ksslg	hellbrüun- lioheelbe Unterseite	weiselloh bis gr&ullch- welssj SpKr- lieh entwic kelt	keines oder sehr schwach bräunlich- Selb nach 1 tJo6tM Kultur	Produktion von H2St negativ (nach den Angaben der Autoren durch geführte Ableeun- ββη)
Tyrosin· Bafeextreitt- Agar ['ltola- nin foraa- tion MdIiM* nach Vakseac] (An». Mi	■ittel- ■asslg	gelto« Unter seite	weissllch? eehr «äseig ent wickelt	naoh 1 «oeb· aaehtum helleelb	Bll^unft *nn M*la-
*ae*r*ileh (Am. 0)					BlBi nes*ti.v (Mtoh den Angaben des Autors duroh- gefUhrte Ablesun gen)
Mittel-	ziealleh gut entwickelte" RJ^ei heU- brauallchgsl« be üntereeit«	«elssiich; in For® v>3>n Spuren
kein« Koagulation; langsam Peptonl- SRti cm, volistin« die in t Monats pH geht von 6,4 auf 7#0 in 1 Mo nat

Nach dem Prinzip der Methode von Pridham (Journal of Bacteriology, £6» 107-11*» 1948) stellt man fest, dass Streptomyees hygro8copiou8 DS 10 408 als Kohlenstoffquellen die folgenden Produkte mlttelmasslg oder gut verwertets Glucose, Galactose, Laevulose, Mannose, Lactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, Raffinoaa, Dextrin» Stärk«„ eiykögssia ©lyeerin, Adonit, Mannit, Sorbit, Xsiogito Er verwertet nur sö&ie®Iifc und sthr langsam die folgend©^ Produktes Xylose, Bernsteinsäure und Apfelsäure, überhaupt nicht verwertet Werdens Arabinose, Rhamnose, Sorbose, Cellobiose, Inulin_; Brythrlt, Dulclt,

Die Bewertung der Stickstoff quellen, die S. hygroscoplcus BS 10 4O8 zur Gewährleistung seiner Entwicklung verwerten kann, erfolgt nach dem Prinzip dieser gleichen Methode von Prldham unter Verwendung von Olusose als KohlonstoffqueXie in allen Fällen und untsr Ersatz des (NH^)_gS0^ in dem Grundmedium durch verschiedene stickstoffhaltige Verbindungen. Unter diesen Be» dingungen verwertet So hygroscoplcus DS 10 4o8 die folgenden Verbindungen mlttelmässlg oder guts (NH^)_gS0^, (NH^)gHPO^, NaNO,, Adenin, Adenosin, Harnstoff, DL»Asparagin,

3Xyki;kcll, DL-Alan in, DL-VaI in, DL»Asparaglnsäure, Biinste"e, L(-«·)-Arginin, L(+)-Lysln, DL-Threonin, DL-Prolin, Lf-)»Hydroxyprolin, L(-)-Histidin. Die folgenden Verbindungen werden ebenfalls verwertet, jedoch langsamer: DL~>Phenylalanin, I,(-).Tyrosin und L-Tryptophan« Nicht verwertet werden die folgenden Verbindungen! Uracll, Sarcoein, Taurin, Betain.

Das Verfahren zur Herstellung des Enzyminhibitors 19 042 Rp besteht im wesentlichen darin, Streptomyces hygrosoopicus DS 10 4o8 oder dessen Mutanten in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und anschllessend den im Verlaufe der Züchtung gebildeten Enzyminhibitor abzutrennen

009835/1981

Die Züchtung von Streptomyces hygroseoplcus DS 10 4o3 kann nach jeder beliebigen aeroben Oberflächenzüohtungsmethode oder Submerszüehtungsmethode erfolgen» doch ist diese letzte« re aus Gründen der Bequemlichkeit bevorzugt. Man kann zu diesen Zweck die verschiedenen Apparaturtypen» die Jetzt üblicher· weise in der Technik der Fermentationen verwendet werden» verwenden. Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen;

Streptomyces hygroacopicus DS 10 403 - Stammansatsg Kultur auf Agar

Kultur im Kolben unter Bewegung

Impfkultur im Fermenter Produktionskultur im Fermenter

Das Fennentationsmedium sollte im wesentlichen assimilierbare Kohlenstoff quellen und assimilierbare Stickstoffquellen, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren und Verdik» kungsmittel enthalten« wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate« wie beispielsweise Glucose, Saccharose» Lactose, Dextrine_s Stärke, Melasse» oder andere Kohlehydratsubstanzen» wie beispielsweise Zuckeralkohole» ζ.B₀ Glycerin oder Mannit* oder gewisse organische Säuren, wie beispielsweise Milchsäure» Ci-

009835/1981

■ - 25 -

■ ·

trcnensiure, WelneJfure. und dergleichen, verwenden. Oawlas* tierische cder pflanzliche Öle, wie beispielsweise Schealz-81 oder Sojaöl, können die·· veraohiedenen Xohlehydretquellen Mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden. AIa besondere günstige Kohlenstoffquellen können Glucose, Saocharoee und Glycerin verwendet warden.

Dia geeigneten assimilierbaren Stickstoff quellen sind ausserordentlioh verschiedenartig. Sie können »ehr einfache ohe»iaehe Substanzen, wie beispielsweise Nitrate, anorganische oder organische AeoRonluasalze, Harnstoff und Aminosäuren, sein* Sie können auoh in Form von komplexen Substanzen« die den Stickstoff hauptaKehlleh in protidischer For« enthalten» zugeführt werden» wie beispielsweise In Font von Ctatin, Laotaibumln, dluten und deren Hydrolyseten, Sojamehl, Arachlemehlp Fischmehl, Pleischextrftkten, Refeextrafeteo, Diatillers' Solubles, und Mai8quellKas8er, Als besondtra gUcatige Sticketcff quellen können die Caseinhydrolyaate verwendet werden.

Uhter den zugefügten mineralischen Stoffen können gewisse

eine Pufferwirkung oder eine neutralisierend« Wirkung besitsen, wie beispielsweise dl« Alkall- oder Erdalkaliphosphate oder |

Calclua- oder Magnesiumoarbonat»„

Andere führen zu dais zur Entwicklung des Streptonyces hygroacopicua OS 10 408 und tür Erzeugung des Znzymlnhibltore erforderlichen lonengleiohgewicht, wie beispielsweise die Alkall· und Erdalkalichloride und -sulfate. Schliesslioh wirken gewlsee in spetiellerer Weise ale Aktivatoren dar 8toffweohselreaktionen das Streptoaqroes hygrosoopious OS to 4o8. Ea sind dies dia Elsen- und Kobaltaslze.

AIa beaonders günstige Miner*iatoffe können die Bisenselze oder die Kobaltaals· verwendet werden.

BAD ORIGINAL

009835/1911

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Unter den Verdiokungeaitteln kind die zum«let verwendeten Stärke, Carboxymethylcellulose und Agar.

Sin besonders günstiges Gleichgewicht dieser verschiedenen Beetindteile besteht In einen Medium, das an stiokstoffSi&lti» gen Subetanzen sehr reich und an Zuckern oder äquivalente Substansen ar« 1st.

Zu Beginn der ZUohtung sollt· der pH-Wert des mediums zwischen 6,0 und 7.8, vorzugsweise zwischen 6 7*5» liegen. Öle sur Fermentation optimal© Tenper&tir 25 bis 28⁰C, doch wird ftuoh bei Itep^rafenren zwischen 40*C eine zufriedenstellende Produktlea erhalten. Bi# tung der ZUohtung keim zwischen sieglest wslfeen OreaEOsa ^•n, Bs wurde Jedooh gelteJeiit 2 1 Luft Je Liter Bouillon und .-"•Inö: Die aaxisale Ausbeute an p naoh 20- bis 4o-st1lndl^r Züsiitung f^tolton» wobsi spanne hauptsltohlioh von den ¥$i«wigiiü&®ii Madl^· naoh und insbesondere, wenn der pi3«¥@Ft Uter 8 ein beträchtlicher Abbau des fi^äsk&s auf»

Das 19 042 RF kam denen Nethoden is>,/ ■

Man kann die Fersjentationemalsohe bei einem pH-Wart 2 und 8 und vorzugsweise zwischen 2 und h filtrieren» das PiI-trat unter verminderte» Druck bei einer Temperatur zwischen 5 und 50*C auf 1/5 bis 1/10 konzentrieren« Neutralsalze, wie beispielsweise NaCl, (NH^)₂S0^ und dergleichen, zu dem Konzentrat bis zu einer Konzentration von 25 bis 75 % (Gewicht Je Volumen) zugeben und dann das 19 0^2 RP durch wiederholte Extraktionen mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie beispielsweise einem flüssigen aliphatischen Alkohol mit

009835/1911

1922501

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sualadeet 4 Kohlenstoffatomen, tin·» chloriertesi

(s.B. Chlorcfora) oder each Xther« extrahieren. Se 1st besonders vortelUi&ft, n-Butanoi zu verwenden, Dae 19 04δ RP kann «m

Lesungen durch £inengen der Lueung unter vera&nder- Druck bei finer Temperatur «wi&Qhesi § und 2§*c «ad an«

alt

s^isohen -15*C und +1O*C isoliert «erden·

d&s in des Filtrat vorhejiden· 19 0^2 HP aueh e& »in bei ·tn(wr, pH-Wert »tischen > und ?_f vorsugeweiee bei tinea ρβ· Wert in der Mäh« von 3» tfquilibrlert»$ Hers von Cffirbcxyltyp binden und deem Bit einer O₉I bis 5fi-€hlortfftMerstofflösun£ in Methanol oder ftthanal eluieren. Man verwendet vorteilhafterweiee eine 0,5n-L3eung ia 70 £igen Methanol. Die aktiven Eluate werden neutralieierfc* unter veminderteai Druok zur Entfernung des Alkohols eingeengt und aneohliensend unter den oben beschriebenen Bedingungen

Das rohe 19 042 RP kann n&eh einer der folgenden Methoden gereinigt werden«

Herstellung und aneehlleasende Reinigung dee Pikratu und Regenerierung des gereinigten 19 0*2 RP aus dieeea 3*lt alt bei· spielewelse ChlorwaeaeratoffeMure in wMeerig-alkohollsoher Löeung,

Chroaatographie an eine» Dextran- oder PolyAervlealdeel in saurer wKesrlger LBsung unter Yerwenduns von vorsufimeiee verdünnter

Chroemtographi· en zuvor mit Sc?te*®f*leäwre odes* behandelten Aluainiueoxyd in wäüssriger oder hollecher LSsung _t

BAD ORIGINAL

009835/1991

Wenn das Aluminiumoxid mit SehwefeleSar© behandelt ist» : das Produkt in Form «ines Gemisehs von Sulfate» und Ejarm riden vor, Venn das Aluminiumoxid mit Salzsäure behandelt ω»_£, liegt das Produkt in Form eie@e Gemisch® von vor.

JBrflndungeeengse kenn sas 19 ©4g MW ia 21 052 HP und 21 0S3 ^ oUireh

oder Pol^aerylaaliSgel cä^r as

LSsisiig get

Dl® folesaöüi Beispiele ssrliiifessisi! ää© Ewf&mutmHo ©tsao SiQ besehrünken. Bie AktivifeSfe d©F Fs=oäefete uirä äsi ßs Einheiten bestimmt ₉ X>ursh Befiniföiea 1st ©iss© heit (E) die Inhlbitoriasage*, die erforäopiäsfia äsfe_a t» «Si© caseiaolytisöfe® Wirkimg,¥®h 1,5 P€ kPis^ailiäsieifteii &ypsj bei einem pH-Wert von 7,6 und bei JF®C um 50 ff Die Bestiranußgafesdingutig®!! sind siit ienjeialgea J₀ Gen. Physlolo. 30, 291 (19*7) idlenfcieohe

* Beispiel 1

In einen 170 l-Fertaantsi* bringt rnsn die f©lg®nä©a EesifeaaofeeilG eint

Pepton . βΟΟ g

Fleisülitxtrakt . 690 s

hydratisierte Ql«©8« 1i8© g Hatriumehlorid

Waee®r ai 11©

. 009836/1981

Der pH-Wert des Gemische wird mit 100 oar konzentrierter Natronlauge (d » 1,33) auf 7*0 eingestellte Hm stabilisiert ums MsdiiiiB dureh 4©»miElltig®s B3Si?@hl^itee von Sepf tob 1S2*C. Ha@h Abkühlen betrugt ü®& fmlmmm. -Mv 5?i\hv VJ,. \ und der pH-Wert 6,6« Das HecSitim '«Irrj dams üit; S@O @^ @iner gerührten

Isygroeoo unter Be-

Si® isfe dmn sur Seiaspfung-

witv. ig
» der »it den f@lg#iiSen Substansen icm&®hi&kt iati

Pipton
Calsiuaoarbonat

von

16	kg
1	kg
0	,3 kg
31	55 1
70'<	•χ so?· konsen
	t nan das
von

E*3$

¥©teM?s eSer Bouillon Hsu "59i?spffe mit 4© ] t% Si® Kultur WIM

pl«Mert;

as??

imt% mit

isife Hilfe eines ateri-. Ser

der

009335/1981

Beispiel 2

400 1'unter den in Beispiel 1 baeohvlebenen gestellte Maische mit einem Oehalt ¥©u einen mit einer Vorrichtung zum Beweg®« eingebracht« Der pH-Wert der Maisch® wird säure auf 3 eingestellt« Man setsst dann zu. Das Qemisoh wird auf einer Pilfeeffprese der Filterkuchen wird mit 75 1 Wasser so 400 1 Piltrat mit einem Gehalt ^c?e»s 6%0 l/©ts"

Das Piltrat wird unter veretedertea Qwm&li tel ^^fflü siuf oto Fünftel eingeengt. Man 9PhIULt 80 1 S@es®atp&fe salt ton 2855 B/osA

Zu dieses K<»sentrat gibt man atalfa% in und stellt den p Salz*ä\?oe auf 3 «in. Kara kühlt aiiif*¹ |·°© nal wit $% 4^ 1 Butanol«» Dia BataBe^js und dann unter verainderteii SnieEs fe.3i 50®S ®&© hält dann 1© 1

aus Ammoniuiiaifilf-i"·: MJS@fet_Ä sfeesii Filtriere» mnü zu dem geklärten Kuusentrat ^O 1 Aceton feel 25⁸C

Der Miederschlag wird gewaschen, abgesaugt und dann in Vakuumtrockeneohrank (20 mm Hg) bei 30⁰C getrocknet. Man er hält so 568 g Produkt mit einem Gehalt von

Beispiel 3

200 g eines unter den in Beispiel 2 besohriitmnen Bedingungen Rohprodukts mit einem Oehalt vm 115 B/«S werden

009835/tSt

in 2 1 destilliertem Wasser suspendiert. Han hält -sine Stund· bei Ziarosrteisipsra&ur in Bewegigng wnd filtriert dom über Papier.

Zu ÖQg» filtriertem Lorning s@tsfc ssasa «Saafia Isysgeess ysster Bewegen ein ¥©luBi®fs ®in®r gesättigten Wmmg vm Plkrisasiisi⁸® in Q»1n-

α&©@ω1£®8©©ε$ ^iM ©g ia 3-@

Man SQfest sta di@s@s' LSsmrüg iQ^gsasa wnfeeg» sfegneigefa PiIhS⁵^n 15 Ϊ Des⁰ ®@ s@feilä©fe© Mie-äergeliMg wls^ swf ®iner. Glas*

5 Wasser g

RP

GlK@Ea Gehalt ψοώ 1335 E/sag

g @toe» unter den in B®!@fii©l 5 fe®e@tot®fe®nea Bedingungen Produkte - mit o-ineei Gehalt von 1415 l|/n$ werden

®ar n/100 Salssäure sn®p@sidi®irfc» Elia Wilöeliaher inaüc ^etendteil wiva durets Filferiei^ß entfernt.

Die, filtrierte Löatmg wird m ein^r SIiai@ voa "Biogel P 4" ohroBfttogrfti^iert„ Die Sliile ^eist @in@n Disrehaee« 8®r von 7*5 cos auf und ©gifeMlfe 0^3 kg ^wB£@g@l P ft¹⁸ in a/100 Salzsäure (was «intr Höh© wsis 60 @n «snfcsprielafe)« 0as l^irahleiten ä©r Znhibitorlusimg erfolgt nit einer liife© ^öh S_e5 ®sr 4β· Minute« Aneehliesaend wird eine Elti&im mit ώ/%00

0098?5/1981

Mit einer gleichen Rate vorgenommen» Das Siuat wird in Fraktionen von etwa 30 evr gewonnen. Die Bestimmung der Antltrypsln· Aktivität der ultraviolettes Lieht von 280 nm absorbierenden Fraktionen ermöglicht, diejenigen der Fraktionen» die an 19 042 RP reich sind« zu vereinigen. Die Fraktionen 1 bis enthalten praktisch nichts. Die Fraktionen 41 bis 44 und 54 bis 80 enthalten W-absorbierende inaktive Produkte. Die Fraktionen 45 bis 5?» deren Aktivität zwischen 8000 und 40 000 E/owr beträgt, werden vereinigt.

Die Lösung wird lyophllisiert. Man erhält 1,95 g Produkt 19 042 RP mit einen Gehalt von 2Ί80 E/mg ο

Beispiel 5

8 g eines unter den Bedingungen von Beispiel 4 hergestellten Produkts mit einen Gehalt von 3430 E/mg werden in 60 cnr des til· liertem Wasser gelöst.

Die Lösung wird an einer Aluminiumoxydsäule Chromatographiert_a Die Säule weist einen Durchmesser von 6 cm auf und enthält 1 kg suvor mit Schwefelsäure behandeltes Aluminiumoxyd (pH 4) in destilliertem Wasser (was einer Höhe von 38 cm entspricht)„ Das Durchleiten der Lösung erfolgt mit einer Rate von 2 cnr je Minute. Anschliessend wird eine Blution mit destilliertem Wasser mit der gleichen Rate vorgenommen. Das Eluat wird in Fraktionen von etwa 50 cnr gesammelt. Die Bestimmung der Antitrypsin-Aktivität der ultraviolettes Licht von 280 noi absorbierenden Fraktionen ermöglicht, diejenigen der Fraktionen su vereinigen, die reich an 19 042 RP sind. Die Fraktionen 0 bis 16 und 21 bis 4o enthalten nur UV-absorbierende inaktive Pro« dukte. Die Fraktionen 17 bis 20, deren Aktivität zwischen 80 000 und 180 000 B/cnr⁵ beträgt, werden vereinigt.

009835/1981

Die Lösung wird lyophilislert. Man erhält 3,35 g gereinigtes 19 042 RP mit einem Gehalt von 6150 E/mg, das in Form eines Gemische von Sulfaten und Hydrochlorideη vorliegt.

Dieses Produkt enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Chlor. Seine Eleraentarzusammensetzung 1st etwa die folgendet

C « 50 * H - 7,0 * 0 - 17*5 # N « 20,5 % S · 2*0 %

Cl - 3»0 %

Auesehen t Blassgelbes amorphes Pulver Ultraviolatt-spektrum (Bestimmung mit einer Lösung mit 0,05 %

in Wasser)!

Absorption bei 200 nra EI * « 555

■ om

1 4t Absorptionsminimum bei 243 nm ^Ei om * ¹¹

1 4L Absorptionsmaximum bei 257 nm E₁ £_m » 12,7

Infrarot »Spektrum (Die Bestimmung erfolgt mit mit Kaliumbromid

verpresstem Produkt)!

Dieses Spektrum ist in Flg.1 gezeigt« in der als Abszisse einerseits die Wellenlängen in Mikron (oberer Massstab) und andererseits die Wellenzahl^n in ob"¹ (unterer Massstab) und als Ordinate die optische Dletite aufgetragen sind.

0 09836/1981

In der nachfolgenden Tabelle V sind die Hauptbanden der Infrarot-Absorption für dieses Produkt angegeben«

	SSt	2750	Soh	1465	Tabelle	1235	V	910	ssoh	490	Sch
»50	Soh	1730	Soh	1450	m	1175	m	860	each	450	Soh
5280	Sch	1670	St	1445	m	1105	Sch	740	m	395	ssoh
3170	M	1645	SSt und breit	1390	Soh	1000	St	700	m
2960	Soh	1550	St und breit	1330	m	970	sch	615	St
2935				ssoh	Sch

2870 sch 1495 Soh 1295 ssoh 945 sech 560 Soh

SSt	« sehr stark	m »	mittel
St	« stark	sch »	schwach
	880h «	8ehr schwach
	Sch *	Schulter
Beispiel 6

1*33 g eines unter den Bedingungen von Beispiel 5 hergestellten Produkts mit einem Gehalt von 5900 E/mg warden in 25 cm* eines wässrig-alkoholischen Gemische mit einem Gehalt von 18 % (Vol.Aol») Äthanol gelöst.

Die Lösung wird an einer SKuIe von Dextrangel "Sephadex LH 20* ohromatographiert. Die Säule besitzt einen Durchmesser von 5»3 on und enthält 500 g Dextrangel, das in einem wässrig-alkohollohen Oemlsoh mit 18 % (VoI./Vol.) Äthanol gequollen ist

009835/1981

(entsprechend einer Höh« von 65 ob) . Das Durchleiten der LOsung erfolgt ait einer konstanten Rate von 65 oe'/Stund·. Ansohllessend wird eine Blution alt de* gleichen wässrig-alkoholischen Oemiech ait der gleichen Rate vorgenommen. Das Sluat wird in Fraktionen von etwa 10 ob** gesammelt. Seine optische Dichte wird kontinuierlioh duroh eine Analyslervorrichtung "UVZCORD L.K .B." bei 25?,7 na geaessen. Das erhaltene Dlagraaa welat zwei scharf getrennte Spitzen auf» Man vereinigt die Jeder der Spitzen entsprechenden Fraktionen· entfernt den Alkohol duroh Verdaapfen la VakuuB und lyophillslert.

Die Fraktionen 6? bis 7* liefern 290 ag 21 052 RP in Fora des Sulfats ait einea Gehalt von 6550 K/ag. Die Fraktionen 85 bis 104 liefern 620 ag 21 053 RP in Fora des Hydrochloride alt einea Oehalt von 6400 K/ag. Die der ersten Spltse vorausgehenden Fraktionen und die der zweiten Spitse folgenden Fraktionen enthalten geringe Mengen an wenig aktiven Produkten.

Beispiel 7

182 g eines unter den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen hergestellten Rohprodukts alt elnea Oehalt von 300 8/ag werden unter den in den Beispielen 3 und 4 beschriebenen Bedingungen behandelt, wobei die als Zwischenstufe vorgenoaaene Lyophilisation duroh eine Konzentrierung unter veralndertea Druok bei 30*C ersetst wird. Nach der Chromatographie an "Biogel P 4" aaohen die aktiven Fraktionen 550 oar au·, die aan unter vermindertem Druck bei 30*C einengt. Man erhält so 50 oar einer Lösung alt einen Oehalt von 475 000 E/cm'.

Diese Lösung wird an einer SKuIe von aktiviertem, zuvor ait Salzsäure behandelten Aluainluaoxyd (pH 4) unter den in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen ohromatogrephlert· Man erhält 2,7 g 19 042 RP mit einea Oehalt von 6250 S/ag. Das so hergestellte Produkt enthält mehrere Bestandteile, alle in Fora

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der Hydrochloride. Seine Elementarzusammensetzung ist etwa die folgende:

C » 50,5 % H - 6,8 % 0 « 16,15 # N » 20,0 £ Cl = 6,55

Es zeichnet sich durch die folgenden physikalischen Eigenschaften aus:

Aussehen? blassgelbee amorphes Pulver Ultraviolett-Spektrum (Bestimmung mit einer Lösung mit 0,05 #

in Wasser):

Absorption bei 200 nm ^Ei cm ^{β 5}^

1 9»

Absorptionsminimum bei 243 nm E₁ £_m =

1 3»

Absorptionsmaximum bei 257 nm El ^_n. * 7,7

Beispiel 8

12,3 S eines unter den Bedingungen von Beispiel 7 hergestellt ten Produkts mit einem Gehalt von 5120 E/mg werden in 75 cnr eines wässrig-alkoholischen Oemlschs mit 18 $ (Vol./VoIo) Ethanol gelöst.

Die Lösung wird an einer Säule von Dextrange1 "Sephadex LH 20" ohromatographiert. Die Säule weist einen Durchmesser von 10 cm auf und enthält 1,6 kg Dextrangel, das in einem wässrig-alkoholischen Gemisch mit 18 % (VoIo/VoIo) Ethanol gequollen ist (was einer Höhe von 6o am entspricht). Das Durchleiten der Lösung erfolgt mit einer konstanten Rate von 16O onr/Stunde. An-

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sohllessend wird eine EIution mit den gleichen wässrig-alkoholischen Gemisch mit der gleichen Rate vorgenommen. Das Eluat wird in Fraktionen von etwa 45 car gesammelt. Seine optische Diohte wird kontinuierlich mit einer Analysiervorrlohtung "UVICORO LoKaB." bei 255,7 mn gemessen. Das erhaltene Diagramm weist eine erste Spitze (Fraktionen 43 bis 50) auf, die dem 21 052 RP entspricht und der eine Hauptspitze (Fraktionen 55 bis 74) folgt», die dem 21 053 RP entspricht. Die aktivsten Fraktionen (61 bis 69) werden vereinigt. Man entfernt den Alkohol durch Verdampfen im Vakuum und lyophllisiert.

Man erhält 6 g Hydrochlorid des 21 053 RP mit einem Gehalt von 6600 S/mg.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die medizinischen Zusammensetzungen, die den Enzyminhibitor 19 0*2 RP oder zumindest einen seiner Bestandteile zusammen mit jedem anderen verträglichen Produkt, das inert oder selbst physiologisch wirksam sein kann, enthalten.

Die Zusammensetzungen können in allen für den vorgesehenen Verabreichungsweg geeigneten Formen vorliegen. Der Enzyminhibitor 19 042 RP und seine Bestandteile können auf intravenösem, intramuskulärem, oralem oder percutanem Wege verabreicht werden, wobei der Intravenöse Weg (Perfusion) der bevorzugte Verabreichungeweg ist.

Enzyminhibitor 19 042 Rp und seine Bestandteile können in der Humantherapie als Antifibrinolytlca zur Verhinderung und Behandlung von Hämorrhagln durch Flbrlnolyse, als Antlkoagulantlen und als Trypsin-Inhibitoren zur Behandlung von Cutanlaesionen zlrkulatoriaohen oder traumatleohen Ursprungs und thrombo-embolisohen Erkrankungen verwendet werden.

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Die Qebrauchsdosen variieren je nach der gewünschten therapeutischen Wirkung« der Verabreichungsart und der Dauer der Behandlung. Sie liegen la allgemeinen zwischen 0,1 und 5 g WirkeubBtanz je Tag für einen Erwachsenen bei intravenöser oder subcutaner Verabreichung.

Das folgende Beispiel erläutert eine erflndungsgemässe Zusammensetzung.

Beispiel 9

Man stellt zum Zeitpunkt des Gebrauchs eine Lösung der folgenden Zusammensetzung her:

Enxyninhibitor 21 053 RP 0,5g

pyrogenfreie physiologische ~

Lösung 20 cnr

Die so erhaltene Lösung wird alsbald zur intravenösen Perfusion verwendet.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   blassgelbes amorphes Pulver, sehr löslich in Wasser und in verdünnten Säuren, löslich in wässrig-alkoholischen Gemischen und Waeeer-Aceton-Gemischen, sehr wenig löslich in konzentrierten wässrigen Lösungen von Neutralsalzen, in wasserfreien Alkoholen» Aceton» Hexan» Äthylacetat, Äther und chlorierten Lösungsmitteln;

   liefert bei saurer Hydrolyse Arginin» Phenylalanin» Prolin» Valin und sieben Guanidine„

   2. Hauptbestandteile des Enzyminhibitors 19 042 RP» die mit den Nummern 21 052 RP und 21 053 RP bezeichnet werden und in Form des Sulfats und Hydrochloride die folgenden Merkmale aufweisen: sie sind Produkte mit salzartigem Charakter» die das Aussehen eines weisslichen amorphen Pulvers haben; sie sind in Wasser und verdünnten Säuren sehr löslich» in wässrig-alkoholischen Gsmischen und Wasser-Aceton-Gemischen löslich und in konzentrierten wässrigen Lösungen von Neutralsalzen» wasserfreien Alkoholen» Aceton» Hexan» Äthylacetat, Äther und chlorierten Lösungsmitteln sehr wenig löslich;

   das 21 052 RP enthält in Form des Sulfats Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff» Stickstoff und Schwefel und besitzt die folgende Elementarzusammensetzung:

   C - 48,3 % H » 6,0 % 0 - 18,2 % N * 21,2 % S « 4,5 f>

   Sein Ultraviolett-Spektrum (in Lösung in Wasser) weist eine Absorption bei 200 nm (e] £_m - 435), ein Absorptions-

   009835/1981

   maximum bei 257 not (JS₁J £ * 5*25) und ein Absorptionsminimum bei 245 mn (E^ ^₀ * 4,5) auf %

   sein Drehvermugen (in Lösung mit 0,9 $ in Wasser) beträgt:

   M% -71 +

   [ο]®°--22+ 1·| [α3Jg₆ « -45,5 i 1,5°j

   das 21 053 RP enthält in Form des Hydrochloride Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Chlor und besitzt die folgende Elementarzusammensetzung:

   C - 49,5 % H - 7,1 % 0 « 17,5 % N * 21,8 % Cl » 4,9 % ι sein Ultraviolett-Spektrum (in Lösung in Wasser) weist eine

   1 ii

   Absorption bei 200 nm (EJ ^_n. » 53K)), ein Absorptionsmaximuni

   I (Sri 1 £

   bei 257 nm (E^ ^ « 5,4} und ein Absorptionsminimum bei 243 nm <^E1 Im ^{m 2}'⁹> ^aufJ

   sein Drehvermögen (in Lösung mit 0,9 % in Wasser) beträgt: ²O - -23,5 ♦ 1^eJ [CtJg₆ - -46,6 _±i,5^ci

   3· Verfahren zur Herstellung von 19 042 RP, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyoes hygrosoopicus OS 10 4θδ (NRRL 3286) oder seine 19 042 RP erzeugenden Mutanten in einem belüftetem Medium, das assimilierbare Kohlenstoff und Stiok-

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   stoffquellen enthält, unter den Üblichen Bedingungen für diese Art von Kultur züchtet und dann den gebildeten Enzym» inhibitor <·9 O42 RP abtrennt.

   4„ Verfahren zur Herstellung von 21 052 RP und 21 055 RPr dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige oder wässrigalkoholische Lösung von 19 042 RP einer Chromatographie an Aluminiumoxyd oder Dextran- oder Polyacrylamidgel unterzieht.

   5. Medizinische Zusammensetzungen, enthaltend als Enzyminhibitor eine wirksame Menge von 19 042 RP oder zumindest einem seiner Bestandteile, zusammen mit jedem anderen verträglichen inerten oder isslbst physiologisch aktiven Produkt»

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   BAD ORIGINAL

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