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α-Amylase-Inhibitor aus einem Streptomyceten und Verfahren zu
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seiner Gewinnung Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen
neuen Inhibitor der Glycosidhydrolasen des Verdauungstraktes, insbesondere der oC-Amylase
aus Pankreas. Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines solchen Inhibitors
durch Fermentation des spezifischen Mikroorganismus Streptomyces violaceoruber Z-2G85
(ZATCC 31 209), sowie seiner Varianten und Mutanten, den genannten Mikrobenstamni
als solchen und auch Verfahren zur Gewinnung des Inhibitors aus dem Fermentationsansatz
und zu seiner Reinigung.
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Inhibitoren der Glycosidhydrolasen aus Mikroorganismen, besonders
aus Actinomyceten sind bekannt. Die bisher näher untersuchten Substanzen gehören
chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide. Entsprechende Inhibitoren
mit wahrscheinlichem Peptidcharakter sind als hitzelabil, mehr oder weniger leicht
durch Trypsin inaktivierbar und vor allem vergleichsweise weniger aktiv beschrieben.
Es wurde bereits vergeschlagen, aus den Fermentationsansätzen von Streptomyces tendae
4158 (ATCC 31 210) einen Her:rstoff der i -Amylase zu isolieren.
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Es wurde nun in Fermentationsansätzen von Streptomyces violaceoruber,
Z 2685 ein hochaktiver hitzestabiler Hemmstoff der OC-kmvlase aus Pankreas gefunden,
der sich chemisch zu den Peptiden einordnen läßt und der sich hinsichtlich seiner
Aminosäurenzusammensetzung und UV-Lichtabsoption von dem Inhibitor aus Streptomyces
tendae unterscheidet.
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Der Inhibitor ist gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht
von
5000 bis 10.000, ein Absorptionsmaximum in UV-Licht bei 276 nm, einen isoelektrischen
Punkt von 4,4 und eine min säurezusammensetzung wie weiter unten angegeben.
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Der erfindungsgemäße Inhibitor hat ein relativ hohes Molekulargewicht.
Er diffundiert nicht oder allenfalls zu einem sehr geringen Tcil durch handelsübliche
Dialysiermembranen wie Visking (R) -Schläuche. Naturgemäß ist die Bestimmung des
genauen Molekulargewichts schwierig und man gelangt mit vcrschiedenen Bestimmungsmethoden
zu unterschiedlichen Resulfaten. Benützt man zur Moelkulargewichtsbestimmung die
analytische Ultrazentrifuge (Biochemisches Taschenbuch, 2.
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Teil, Seite 746 bis 767), so erhält man Werte von ungefähr 10.000.
Werden hingegen Molekular-Siebe wie Sephadex-G-50 superfein verwandt, so ermittelt
man ein Alolekulargewicht von 5000 oder sogar noch darunter. Es ist demgemäß aufgrund
der derzeitig vorliegenden Untersuchungsergebnisse ein Molekulargewicht zwischen
5000 und 10.000 anzunehmen.
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Die erfindungsgemäße Verbindung ist eine farblose Substanz.
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Sie absorbiert aber ultraviolettes Licht mit einem bei 276 nm liegenden
Maximum, das bei 281 nm eine Schulter aufweist. E11cm=25. Figur 1 gibt en Absorptionsspektrum
wieder.
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Der Inhibitor ist seiner chemischen Struktur nach ein Peptid. Er kann
durch Hydrolyse in Aminosäuren gespalten werden.
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Es ist bis jetzt nicht gelungen, neben den Aminosäuren andere Bestandteile
nachzuweisen. Bestimmt man die Aminosäurezusammensetzung mit der von St. Moore und
W.H. Stein (Methods in Enzymology, Band VI, Seite 819 bis 831, herausgegeben von
Colovick und Kaplan in Academic Press, New York, London 1963) angegebenen Methode,
so kann man folgende Zusammensetzung ermitteln:
Asparaginsäure 5
- 6 Threonin 6 - 8 Serin 2 - 4 Glutaminsäure 5 - 6 Prolin 3 - 5 Alanin 5 - 7 Glycin
7 - 9 Cystein 2 - 4 Valin 5 - 7 Isoleucin 0 - 1 Leucin 0 - 1 Tyrosin 3 - 5 Phenylalanin
1 - 2 Histidin 2 - 3 Arginin 1 - 2 Tryptophan 2 - 3 Der Wert von Tryptophan wurde
aus der Absorption von ultraviolettem Licht geschätzt. Es ist naturgemåR, daß die
Ergebnisse der Aminosäure-Untersuchung nicht immer auf ein esnziges ganzzahliges
Mengenverhältnis deuten, und daß derartige Messungen allgemein mit gewissen Fehlern
behaftet sind. Demgemäß beruhen die in der Aufzählung wiedergegebenen Variationsgrenzen
nicht auf einer Uneinheitlichkeit des Inhibitors, sondern auf der unvermeidlichen
Meßungenauigkeit des Analysenverfahrens. Kennzeichnend für den erfindungsgemä.ßen
Inhibitor ist aber, daß die Aminosäuren Asparginsäure, Glutaminsäure, Threonin,
Glycin, Alanin und Valin einen über durchschnittlich hohen molekularen Anteil des
Peptids einnehmen und daß Methionin und Lysin in der reinen Substanz gänzlich zu
fehlen scheinen. Da Methionin und Lysin cit verbreitete Aminosäuren sind, ist ihre
weitgehende Abwesenheit ein gutes Kennzeichnungsmerkmal für den erfindungsgemäßen
Inhibitor
und kann insbesondere auch bei Anreicherungsverfahren zur Reinheitsermittlung des
Produkts dienen.
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Der erfindungsgenäße Inhibitor reagiert positiv auf Peptidreagenzien
aber negativ auf Phenol-Schwefelsäure.
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Der erfindungsgemäße α-Amylase-Inhibitor enthält keinen Zuckeranteil.
Dadurch, sowie durch seine Aminosäurezusammen setzung, sein Molekulargewicht und
seinem isoelektrischen Punkt unterscheidet er sich von allen bekannten α-Amylase-Inhibitoren.
Reine Präparate des Inhibitors weisen eine Aktivität von ca. 1 x 106 AIE/g auf.
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Für eine Substanz von Peptidnatur weist der heallspruclltc Amylaseinhibitor
eine bemerkenswerte thermische Stabilität auf. Selbst Kochen in einem neutralen
oder schwachsauren Medium (pH etw 4 - S) während mehrerer Minuten ist auf seine
glucosihydrolase-hemmende Eigenschaften ohne nennenswerten Einfluß.
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Der Inhibitor wird durch Pepsin, Trypsin oder Chymotrypsin im Vergleich
ru anderen Proteinen nur sehr langsam proteolytisch inaktiviert. Während des therapeutischen
Wirkungszeitraums ist daher nicht mit einer nennenswerten Aktivitätsverminderung
im Verdauungstrakt ZU rechnen.
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Der Inhibitor weist eine hohe Wirkungsspezifität auf. Die α-Amylase
aus Pankreas wird außerordentlich stark gehemmt, während demgegenüber bakterielle
A-Amylasen, z.B. solche aus Bacillus subtilis, nicht meßbar inhibiert werden. Dergleiche
ist keine Wirkung gegen ß-Amylasen beobachtet worden.
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Schon geringe Dosierungen des erfindungsgemäßen Amylaseinhibitors
führen zu einer vollständigen hemmung der enzymatische Aktivität der Pankreasamylase.
Dieser Befund ist mit den klassischen
Hemmechanismen nicht zu erklären,
bei denen die Hemmung der enzymatischen Katalyse vom relativen lengenverhältnis
von Inhibitor und Substrat (Stärke) abhcingt. Es uuß vielmehr eine irreversible
Inaktivierung der Pankreasamylase durch den erfindungsgemäßen Inhibitor angenommen
werden.
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Zur Herstellung des Amylaseinhibitors bedient man sich crfindungsgemäß
des Stammes Streptomyces violaccoruber Z 2685.
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Die Eigenschaften des Stammes sind wie folgt: Farbe des Substratmycels:
gelb-braun mit rot; keine Farbveränderung durch pH-Verschiebung.
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Farbe des versporten Luftmycels: braungrau bis mittclgrau (light brownish
gray to medium gray nach: ISCC methods of designating colors).
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Morphologie der Sporenkette: Spira-Typ b, weniger als sechs Windungen.
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Sporenmorphologie: Ellipsoide Sporen mit glatter Oberfläche (1.2 x
0.70 µ).
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Melaninbildung auf Peptonmedium:negativ.
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Nitratreduktion: negativ.
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Substratverwertungsspektrum: Glucose ++ Arabinase ++ Sucrose Xylose
+ Inositol + Mannitol ++ Fructose ++ Rhamnose ++ Raffinose + Cellulose -
Der
Stamm Streptomyces violaceoruher Z 2685 ist bei der American Type Culture Collection
unter der Registrier-Nr.
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31 209 hinterlegt.
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Die Fermentation kann bei 25 bis 350 C, vorzugsweise bei 28 bis 500
C, entweder submers in Schüttelkultur oder in verschieden großen Fermentationsgefäßen
unter Riihrung und Belüftung durchgeführt werden.
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Als Kulturmedium hat sich eine Kombination von Kohlenstoff-und Stickstoffquellen
besonders bewährt. Ein solches Kulturmedium enthält z.B. neben den bei er Kultur
von Mikroorganismen überlicherweise angewandten anorganischen Salzen mindestens
eine Kohlenstoffquelle wie Stärke, Glucose, Rohrzucker, Fruktose, Lactose, Glycerin
oder Melasse sowie mindestens eine Stickstoffquelle wie Sojamehl, Cornsteep liquor,
Hefeextrakt, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Peptone, Milchpulver, Nitrate oder Ammoniumsalze.
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Als optimale Zusammensetzung hat sich erwiesen (Gewichts % in Lösung)
3 - 5 % lösliche Stärke, 0,2 - 0,6 % Cornsteep, 0,5 - 1,5 % Glucose, 0,5 - 1 % (NH4)2HPO4,
0,3 - 0,6 % Sojamehl, 0,5 - 1,5 % Caseinpepton. Auch auf anderen stärkehaltigen
Nährmedien, z.B. einem solchen aus 2 - 6 °Ó Erdnußmehl, 1 - 3 Co Kartoffelstärke,
3 - 5 °Ó Hafermehl, 3 - 5 % Molkepulver, 1 - 2 % Molkensirup, 1 - 2 o Milchzucker
wird der Amylaseinhibitor in guten Ausbeuten erhalten, wobei die Wahl der Stickstoffquelle
und des Pufferanteils, sofern man in physiologischen Bereichen ist, nicht so entscheidend
ist.
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Wird jedoch der Gehalt an Stärke vermindert oder ganz gestrichen,
so geht die Inhibitorenausbeute drastisch zurück.
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Erhöht man andererseits die Stärkekonzentration wesentlich über 7
%, so wird aufgrund der hohen Viskosität die Sauerstoff-Versorgung der Mikroorganismen
suboptimal. Damit verbunden
sinkt die Inhibitorausbeute.
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Im Fermentationsansatz setzt die Bildung des Inhibitors in der Regel
zwischen der 10. und 30. Stundc der Fermentation ein. Innerhalb der nächsten 20
Stunden wird sie weitgehend abeschlossen. Längere Fermentations zeiten haben keinen
nachteiligen Einfluß auf die Inhibitorausbeute, jedoch erhöht sich diese auch nicht
mehr nennenswert. Daraus ergibt sich, daß die Fermentationsansätze etwa 30 - 70
Stunden in Betrieb zu halten sind.
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Zur Isolierung des Inhibitors wird aus der Fermentationslösung die
Zellmasse durch Zentrifugieren, I:iltriercn oder Nutschen entfernt, da sich der
größte Tcil des Wirkstoffes in der Regel in der klaren Kulturflüssigkeit befindet.
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Falls aufgrund spezieller Fermentationsbedingungen e iii Teil des
Inhibitors im Zellmaterial verbleibt,so bereitet cs keine Schwierigkeiten, den Wirkstoff
durch geeignete Methoden daraus zu extrahieren, z.B. durch Ausrühren mit einem wassermischbaren
organischen Lösungsmittel wie Methanol, wobei ein zusätzliches Mazerieren des Zellmaterials
von Vorteil ist.
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Der im Extraktionsmittel gelöste Wirkstoff kann mittels Zentrifugieren
oder Filtricren von den ungelösten Zellbestandteilen befreit und wie die klare Kulturflüssigkeit
veiterbearbeitet werden.
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Aus der Kulturflüssigkeit läßt sich der Inhibitor durch ansich bekannte
Verfahren der Protein- und Peptidchemie isolieren. So eignen sich Fälltingen mit
wasser-mischbaren organischen Lösungsmitteln wie Aceton, Isopropanol oder anderen
niederen Alkoholen, oder auch mit Salzen, wie Ammoniumsulfat.
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Es ist weiter möglich, den Inhibitor auf entsprechende Träger,
z.B.
Aktivkohle u adsorbieren und diesc durch Filtration oder Zentrifugation aus der
wässriger Lösung abzuscheiden.
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Das kann in einem weiten pH-Bereich zwischen 2 bis 10 geschehen, vorzugsweise
benützt man aber den Bereich zwischen pH 4 bis 6. Ionenaustauscher können zur Abtrennung
des erfindungsgemäßen α-Amylase-Inhibitors ebenfalls angewandt werden. I!a
die beanspruchte Substanz sowohl saure 1 als 5 auch basische Eigenschaften hat,
also amphoter ist, kaiin sie sowohl mit Kationen- als auch mit Anionenaustauschern
reagieren und mit Hilfe dieser aus der Fermentationslösung entfernt werden. Hierbei
könne die Techniken angewandt werden, die im Prinzip im Kapitel über Ionenaustauschen
im Biochemischen Taschenbuch, herausgegeben von H.M. Rauen im Springer-Verlag 1964,
2. Teil, Seite SOS - 824, beschrieben sind.
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Bei der Aufarbeitung von Fermentationsansätzen, die die erfindungsgemäße
Substanz in der Kulturflüssigkeit enthalten, ist es häufig zweckmäßig, diese zu
konzentrieren. Hierzu können die bekannten Verfahren für Destillation, Ultrafiltration,
Sprüh- und Gefriertrocknung oder andere bekannte Methoden herangezogen werden. Aus
dem so erhaltenen Konzentrat läßt sich der Inhibitor wieder mit den oben beschriebenen
Verfahren abtrennen. Aus Konzentraten, wie sie die eingeengten Kulturfiltrate darstellen,
kann der Inhibitor auch dadurch angereichert werden, daß sie wesentlichen Verunreinigungen
entfernt werden. So haben sich zur Abtrennung von fettartigen Stoffen Extraktionen
mit organischen Lösungsmitteln bewährt.
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Durch Dialysde oder gegebenenfalls Ultrafiltration (C.J.O.R.
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und P. Morris "Separation methods in Biochemistry" Ditman Publishing,
London 1976, Seiten 941 - 950) kann die Lösung von niedermolekularen Substanzen
befreit werden. Hochmolekulare Stoffe, wie Nucleinsäuren, Polysaccharide oder manche
Eiweißstoffe können mittels frakt ionierter Fällung durch Aussal=en oder durch Zugabe
eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie Aceton oder eines niederen Alkohols
abgesondert werden.
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Die Zugabe des Fällungsmittels wird in diesen lällen so dosiert, daß
sie leicht präzipitierbaren Stoffe mit Molekulargewichten über 100.000 ausgefällt
werden, während der s-Amylase-Inhibitor in Lösung bleibt. Die geschilderten Anreichcrungsschritte
können in beliebiger Reihenfolge kombiniert und variiert werden. Auf diese Weise
gelangt man zu Lösungen, die an Inhibitor stark angereichert sind.
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Die Endreinigung kann mit verschiedenen gezielten Verfahren, wie Gel-
und Ionenaustausclierchromatographie erfolgen oder mit verwandten Verfahren, deren
Trennprinzip nicht ausschließlich auf Ionenaustausch beruht, wie z.B. die Trennung
an llydroxylapatit. Weiterhin könncn Lösungsmittel- oder Salzfällungen, präparative
Elektrophorese oder andere ansich bekannte Verfahren angewandt werden. Besonders
bewährt haben sich Trennungen an Diäthylaminoäthyl-(DEAE-)-Gruppen tragenden lonenaustauschern
sowie fraktionierte Fällungen mit Ammoniumsulfat oder Ahtanol, wobei sogar kristallines
Material erhalten we5rden kann.
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Die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Inhibitors sind im 1-linblick
auf seine Anwendung als Therapeutikum gegen Diabetes und Prädiabetes sowie Adipositas
und Unterstützung von Diät interessant.
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Stärkehaltige Nahrungs- und Genußmittel führcn bei Ticr und Mensch
zu einem Anstieg des Blutzuckers und dadurch auch zu einer vermehrten Insulinsekretion
des Pankreas. Die Hyperglykämie kommt durch die Aufspaltung der Stärke im Verdauungstrakt
unter Einwirkung von Amylase und Maltase zu Glukose zustande.
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Bei Diabetikern ist die Hyperglykämie besonders ausgeprägt und langanhaltend.
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ei Adipösen wirkt die vermehrte Insul insekretion auf die Lipogenese
und vermindert die c Lipolyse Die al imentöre Hyperglykämie sowie die llyperinsulinämie
nach Stärkeaufnahme läßt sich durch den beanspruchten Amylase-in-Inhibitor vermindern.
Diese Wirkung ist dosisabhängig. Der erfiiidungsgemäße Amylase-Inhibitor läßt sich
daher als Therapeuticum einsetzen bei Diabetes, Prädiabetes und Adipositas sowie
zur Unterstützung von Diät. Zu diesem Zweck empfiehlt sich eine Verabreichung insbesondere
ZU den Mahl zeiten. Die Dosierung, die sich nach dem Gewicht des Patienten sowie
dem individuellen Bedarf ausrichten soll, beträgt etwa 10.000 bis 300.000 ATE, sie
kann jedoch in begründeten Einzelfällen auch darüber oder darunter liegen.
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Der erfindungsgemäße Amylase-Inhibitor eignet sich insbesondere zur
oralen Verabreichung. Er kann als reine Substanz aber auch in Form einer pharmazeutischen
Zubereitung unter Verwendung der üblichen Ililfs- und Trägerstoffe angewandt werden.
Auch eine kombinierte Anwendung mit anderen Arzneimitteln wie blutzuckersenkenden
oder lipidsenkenden Substanzen kann von Vorteil sein.
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Da höhermolekulale Peptide als solche nicht oder nicht nennenswert
aus dem Verdauungstrakt resorbiert werden, sind von der erfindungsgemäßen Substanz
keine toxikologisch bedenklichen Nebenwirkungen zu erwarten. Aufgrund der nicht
außergewöhnlichen Aminosäurezusammensetzung sind auch evtl. proteolytische Spaltprodukte
als physiologisch unbedentlich anzusehen. Dementsprechend konnten bei oraler Gabe
auch hoher Dosen des Amylaseinhibitors an Versuchstiere keine auffälligen Symptome
erkannt werden. Auch bei intravenöser Applikation an Mäusen (1 g/kg) wurde der erfindgungsgemäße
Inhibitor bei 24-stündiger Bcobachtungszeit ohne- erkennbare toxische Wirkung vertragen.
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Zur Prüfung der pharmakologischen Wirkung des Amylase-Inlaibitors
erhielten nüchterne, männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht zwischen 200 und
250 g den erfindungsgemäßen llemmstoff gleichgleichzeitig
mit
2 g Stärke pro kg Körpergewicht orjl verabreicht, nach dem unmittelbar zuvor eine
Blutentnahme zur Bestimmung des Ausgangsblutzuckerwertes erfolgte. Weitere Blutentnahmen
erfolgten nach 15 und 30 Minuten sowie nach 1, 2, 3 und 5 Stunden aus der Schwanzvene.
ic Blutzuckerbestimmungen wurden nach der bIcthodc von lloffman im Autoanalyzer
(J. Biol. Chem. 120, 51 (1937) durchgeführt.
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NZO-Mäuse weisen eine gestörte Glucosetoleranz auf. Sie eignen sich
deshalb besonders gut für Untersuchungen bei denen der Blutglucosespiegel beeinflußt
wird. Die Versuchsanordnung entspricht der bei Ratten. Die Blutentnahme erfolgt
aus dem Orbitalenvenen-Plexus. Der Blutzuckerverlauf wird über 3 Stunden verfolgt.
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In analoger Weise wird der Wirkstoffnachweis an NMRI-Mäusen erbracht.
Die Blutentnahmen erfolgen ebenfalls aus dem Orhitalvenen-Plexus und der Blutzuckerverlauf
wird über 3 Stunden verfolgt.
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Unter diesen Versuchsanordnungen zeigten die mit dcnt crfindungsgemäßcn
Inhibitor behandelten Tiere einen gegenüber iinbehandelten Ticren geringercn, protrahierten
Blutzuckeranstieg.
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Amylasetest Ein Amylase-Inhibitoreinheit (AIE) ist definiert als die
Inhibitormenge, die unter den Testbedingungen zwei Amylasc-Einheiten (AE) zu 50
% zu hemmen vermag. Einc Amylase-Einheit ist nach intcrnationaler Übereinkunft die
Enzymmenge, die in einer Minute 1 µ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke
spaltet. Die »Val gespaltener glucosidischer Bindungen werden als µVal reduzierender
Zucker photometrisch mit Dinitrosalizylsäure bestimmt. Die Angaben sind als µMole
Maltose berechnet, die anhand einer Maltose-Eichgeraden ermittelt werden.
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Die Teste werden folgendermaßen durchgeführt: α-Amylase aus
Schweinepankreas und zie zu testende Lösung werden gemeinsam in 1,0 ml 20 mM Phosphatpuffer,
pH 6.9 + 10 mM KaCl 10 - 20 min. bei 37°C vorinkubiert. Die enzymatische Reaktion
wird durch Zugabe von 1,0 ml löslicher Stärke (0,25 % in dem angegebenen Puffer)
nach Zulkowski gestartet.
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Nach genau 10 min. wird die Reaktion mit 2,0 ml Dinitrosalizylsäure-Farbreagenz
(nach Bochringer Mannheim: Biochemica-Information II) abgestoppt und zur Farbentwicklung
5 min.
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im siedenden Wasserbad erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die Extinktion
bei 546 nm gegen den Reagentienleerwert gemessen.
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Die 50 %ige Hemmung wird im Vergleich zur ungehemmten Enzymreaktion
durch Einsatz verschiedener Inhibitormengen graphisch mittels der Wahrscheinlichkeitsauftragung
bestimmt.
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Beispiel 1 Der Stamm Streptomyces violaceoruber, Stamm Z-2865, (ATCC
31 209) wird auf Schrägröhrchen mit einem Nährboden folgender Zusammensetzung geimpft:
50 g Haferflocken ad. 1000 ml 1120 pHA 7,2 Das beimpfte Röhrchen wird 7 Tage bei
30°C bebrütet und danach bei +4°C gehalten. Die Sporen werden mit 10 ml sterilisiertem
A. dest. oder physiologischer NaCl-Lösung von dem Schrägröhrchen abgeschwemmt. 1.0
ml der Suspension dient zur Beimpfung eines 300 ml-Erlenmeyerkolbens, der mit 35
ml sterilisierter Nährlösung mit einem pH-Wert von 7,7 und folgender Zusammensetzung
beschickt ist: 1 90 Glucose 1 % Sojamehl 0,25 % NaCl pH 7,7
Der
Kolben wird bei 220 m 48 Stunden bei + 30° C auf einer Schüttelmaschine bei einer
Amplitude von 4 cm geschüttelt Danach werden jc 5 ml dieser Vorkultur in mehrere
Erlenmeyer kolben überführt, die mit 35 ml sterilisierter Nährlösung beschickt sind
und cincn pll-licrt von 8.5 haben. Die Zusammensetzung dieser Hauptkultur ist folgende:
4 % Stärke 0,4 % Cornsteep liq.
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1,0 % Glucose 0,8 % (NH4)2HPO4 0,4 % Sojamehl 1,0 % Pepton pllA 8,5.
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Die Hauptkulturen werden ebenfalls bei + 30° C mit 220 pm auf einer
Schüttelmaschine mit einer Amplitude von 4 cm 2 - 3 Tage geschüttelt. Am crsten,
zweiten und dritten Kulturtag wird der Gehalt an an α-Amylase-Inhibitor gemäß
Testvorschrift bestimmt.
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Der Stamm Streptomyces violaceoruner Z-2685 liefert unter den beschriebenen
Versuchs- und Kulturbedingungen durchschnittlich 42 AIE/ml bei einen End-pll von
5,2.
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Beispiel 2 Ansatz wie im Beispiel 1, jedoch wird als Hauptkultur ein
Fermentationsgefäß von 300 l Gesamtvolumen gewählt, das mit 200 1 einer sterilisicrten
Nährlösung folgender Zusammensetzung beschickt ist: 4 % Stärke 0,4 % Cornsteep liq.
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1,0 % Glucose 0,8 % (NH4)2HP04 1,0 % Caseinpepton 0,1 % Desmophen
pllA 8.3 - 8.5.
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Die Sterilisationszeit für den Ansatz beträgt 45 min. bei 1210 C und
1 bar, wobei die Glucose separat sterilisiert und nach Abkühlung des Fermenters
auf Betriebstemperatur steril zugeführt wurde.
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Der pH-Wert soll nach der Sterilisation 6.8 betragen und wird nach
Bedarf mit sterilisierter Säure (2 n H3PO4) oder Lauge (2 n NaOH) auf diesen Wert
eingestellt.
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Beiinpft wird die Hauptstufe mit 20 1 entsprechend 10 °o einer wie
unter Beispiel 1 beschriebenen und in einem Kleinfermenter von 30 1 Totalvolumen
hergestellten Vorkultur.
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Es wird 50 bis 70 Std. bei 300 C fermentiert. Die Belüftung beträgt
6 m5/hr bei einer Rührung von 250 Upm und einem Überdruck von 0,3 bar.
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Durch die Probenahme wird der Fermentationsverlauf hinsichtlich der
Inhibitoraktivität, des Substratabbaues, der Biomasseentwicklung und des physikalisch-technischen
Verhaltens der Kulturlösung (Oberflächenspannung, Viskosität, Dichte, osmotischer
Druck) überwacht und verfolgt.
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Die maximale Inhibitoraktivität wird ah der 60. Kulturstunde mit durchschnittlich
55 AIE/ml erreicht. Danach wird der Fermenterinhalt der Aufarbeitung zugeführt.
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Beispiel 3 Ansatz wie in Beispiel 1 und Beispiel 2, jedoch wird als
Hauptstufe ein Bioreaktor von 4000 1 Gesamtvolumen benutzt, der mit 2500 1 folgender
Nährlösung beschickt ist: 6 % Stärke 1,0 % Glucose 0,4 % Cornsteep liq.
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0,8 % (NH4)2PO4 1,0 % Soypepton 0,1 , Desmophen pHA 7.0 - 7.3. /
15
Die Sterilisationszeit für diesen Ansatz beträgt 60 min.
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bei 1210 C und 1 bar, wobei die Glucose separat stcrilfiltriert und
nach Abkühlung dcs Fermenters auf Betricbstemperatur diesem unter sterilen Bedingungen
zugepumpt wird.
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Der pH-Wert wird - wenn nötig - mit steriler Säure (H3PO4) oder Lauge
(NaOH) auf einen Anfangswert von 7.0 - 7.3 eingestellt.
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Beimpft wird mit 200 1 einer unter Beispiel 2 beschriebenen und hergestellten
Vorkultur.
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Die Fermentationszeit beträgt 70 Std., wobei einer Femperatur von
500 C, einer Belüftung von 60 Nm5/hr, einem Oberdruck von 0,5 bar und bei 180 Upm
fermentiert wird.
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Durch Probenahme - wie unter Beispiel 2 beschrieben - werden alle
wichtigen Prozeß-, Organismen- und Aktivitätsdaten über die gesamte Fermentationszeit
vcrfolgt.
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Nach 70-stündiger Fermcntation ist eine durchschnittliche Aktivitätskonzentration
von 38 AIE/ml erreicht. Die Fermentation wird daraufhin abgebrochen und die Kulturlösung
der Aufarbeitung zugeführt.
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Beispiel 4: 10 1 einer filtrierten Kulturflüssigkeit mit einer Wirksamkeit
von 35 AIE/ml wird in einem Sprühtrockner getrocknet und ergibt 380 g eines hellbraunen
Pulvers. Dieses wird dann zur Entfettung mit einer Mischung von 1 1 Methanol und
1 1 Chloroform gründlich durchgerührt und anschließend abgenutscht. Das nech lösungsmittel
feuchte, ungelöste Produkt in dem die Wirksubstanz enthalten ist, wird in 2 1 Wasser
gelöst, auf pH 6,5 gestellt und mit 3 1 Methanol versetzt. Es
entsteht
hierbei ein llellel-, flockiger Niederschlag, der durch Zentrifugieren entfernt
und verworfen wird, da er nur vernachlässigbare Mengen des α-Amylasehemmstoffes
enthält. Der dunkle Oberstand der Methanolfällung, der den gewünschtnen inhibitor
enthält, wird dann im Vakuum vom Methanol hcfrcit und die nun auf 1 1 aufkonzentrierte
Lösung gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Das Retenat enthält 12 g
Trockensubstanz (spez. Aktivität 25 AIE/mg). Das Retenat wird anschließend bei pH
5,5 mit Ammoniumsulfat auf 50 % Sättigung gebracht, wozu bei 250 ml 79 g des Salzes
erforderlich sind. Bei dem Aussalzen entsteht ein Niederschlag, der rund 90 % der
aktiven Substanz enthält.
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Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand verworfen. Den Niederschlag
löst man erneut in destilliertem Wasser und bei pH 8 wird wieder mit Ammoniumsulfat
versetzt, aber diesmal zunächst nur bis zu 15 % Sättigung und nach Entfernen des
Niederschlages weiter bis 35 % Sättigung. Der Niederschlag der Aussalzung zwischen
15 und 35% beinhaltete die Hauptmenge des Amylaseinhibitors. Diese fraktionierte
Fällung wird wiederholt.
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Das entstandene Produkt ist nach Dialyse und Trocknung 390 mg mit
einer spcz. Aktivität von 431 AIE/mg.
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350 mg dieser Rohsubstanz werden dann in Sephadex (R) G-50 fine in
einer 100 cm langen und 1,2 l fassenden Glassäule aufgetrennt und angereichert.
Als Quell- und Elutionsmittel dient wässrige 5 Millimolare Phospatpufferlösung von
pH 8, dem 0,02 % Natriumazid zugesetzt worden ist. Die Rohsubstanz wird in 15 ml
des gleichen Puffers gelöst und auf die Säule aufgetragen. Die elution erfolgt während
zwei Tagen, wobei Fraktionen von 1 5 nil Inhalt abgenommen werdeii.
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Die vier aktivsten Fraktionen werden gesammelt, salzfrei dialysiert
und gefriertrocknet. Sie ergeben 56 mg eines weißen Pulvers mit einer Aktivität
von 1170 AIEα-Amylaseinhibi tor/mg.
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Beispiel 5: 2100 1 Kulturflussigkeit werden auf 60 gekühlt und nach
Zusetzung von 2 b Kieselgur über einer Kammerpress filtriert.
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Der Filterkuchen (ca. 450 kg feucht) wird verworfen, das klare Filtrat
(1700 1 mit einer Aktivität von 38 AIE/ml) wird nach Zugabe von 500 g Natriumazid
über einen Fallstromverdampfer auf 120 1 eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wird
auf 10 C gekühlt und mit 120 1 vorgekühltem Aceton langsam unter Rühren versetzt.
Zur vollständigen Fällung wird dann noch 1/4 Stundc gerührt und nach Zugabe von
1 kg Kieselgur über eine Schenkprcsse geklärt. Der I cststoff mit dein Filterhilfsmittel
wird verworfen. Das acetonische Filtrat, das die Wirksubstanz enthält. wird unter
Rühren und Kühlen mit 380 1 Aceton vermengt , wodurch eine ungefähr 80 %ige acetonische
Suspension entsteht. Der entstandene (2.) Niederschlag enthält den gewünschten Amylaseinhibitor.
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Er wird dadurch gewonnen, daß man die Fällungsflüssigkeit ohne Rühren
stehen läßt. Hierbei sinkt der Niederschlag ab und der Oberstand kann abgehebert
werden. Aus dem Überstand dieser zweiten Acetonfällung können geringc Mengen Niederschlag
durch Zentrifugation abgetrennt werden. Dicser Feststoff wird bei pl 7 gelöst und
der Lösung des Niederschlages (siehe unten) zugesetzt. Der im Fällungskessel vcrbleibende
Hauptniederschlag wird in 120 1 Wasser bei p 7 gelöst und die entstandene Lösung
mit einer Durchlaufzentrifuge (Sepa (R), 1700 Upm) geklärt. Dabei werden 110 g inaktive
Schwebeteilchen entfernt.
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Die klare Wasserphase wird nun mit einer DDS-Ultrafiltrationsanlage
(Membran Nr. 800) auf ca. 15 1 konzentriert und dialysiert. Um die Entsalzung zu
vervollständigen, wird das Retenat mit destilliertem Wasser verdünnt und erneut
konzentriert.
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Nach zwei- bis dreimaliger Wiederholung ist das Retenat, in dem der
Amylaseinhibitor enthalten ist, praktisch salzfrei.
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Aus 50 1 Lösung des Retenats wird dann der Hemmstoff bei pH 5,5 durch
Zugabe von 19,5 kg Ammoniumsulfat gefällt, abzentrifugiert und der Überstand verworfen.
Der Niederschlag wird erneut in 40 1 Wasser gelöst und diesmal bei pH 8,0 mit
12,5
kg Ammoniumsulfat präzipitiert. Nach der Abtrennung der Klarphase in einer Röhrenzentrifuge
wird der !Wiederschlag wie im Beispiel 4 fraktioniert gefällt: Aus 40 1 der wieder
aufgelösten Substanz wird bei pH 5, 5 durch Zugabe von 3,2 kg Ammoniumsulfat zunächst
ein inaktiver Niederschlag gefällt, der abgetrennt und verworfen wird. Dann wird
durch weiteres Aufkonzentrieren der flüssigen Phase mit 7,4 kg Ammonlumsulfat der
Hauptteil der Aktivität aus der Flüssigkeit abgeschieden. Dieser Niederschlag wird
gesammclt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Es resultieren
91 g eines braunen Pulvers mit einer Aktivität von 381 AIE/mg.
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Zur weiteren Auftrennung wird eine Glassäule von 5 cm und 50 cm Höhe
(ungefähr 1 1 Inhalt) mit DEAE-Sephadex A-25 (R) gefüllt, das vorher mit molarem
Phosphorpuffer auf pH 7,5 und 0,02 1 igem Natriumazid equilibiriert worden ist.
Nun werden 10 g Substanz gelöst in 100 ml des gleichen Puffers und auf die Säule
aufgetragen. Zunächst wäscht man die Säule mit 1 1 des gleichen Puffers, dann wird
zu diesem Elutionsmittel allmählich Kochsalz so zugemischt, daß ein kontinuierlicher
Gradient gewährleistet ist. Wird der Säulenausfluß fraktioniert aufgefangen, so
befindet sich der Amylaseinhibitor in den Fraktionen, in denen die 'aCl-Konzentration
etwa 0.55 molar ist.
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Diese Fraktionen werden gesammelt und gegen destilliertes Wasser dialysiert.
Die Gefriertrocknung ergibt 6.2 g hellbraune Substanz mit einer Wirksamkeit von
1080 AIE/mg.
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Hierauf wird noch eine gelchromatographische Reinigung - ie im Beispiel
4 beschrieben - angeschlossen. Aus den 6.2 g Material resultieren 4 g eines farblosen
Pulvers, dessen Aktivität 1250 AIE/n1g beträgt. Die Aminosäureanalyse des Produktes
ergibt nach einer 20-stündigen Salzsäureydrolyse mit Hilfe eines Beckman-Multichromanalysators
folgende Zusammensetzung:
Asparaginsäure 7.24 % Theronin 9.26 %
Serin 3.04 % Glutaminsäure 8.18 % Prolin 5.17 % Glycin 5.87 t Alanin 5.94 % 1/2
Cystein 3.08 % Valin 7.52 % Isoleucin 0.70 % Leucin 0.98 % Tyrosin 8.03 % Phenylalanin
2.83 % Histidin 3.78 % Arginin 3.24 z
L e e r s e i t e