<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung betrifft neue, biologisch aktive Oxiran-Pseudooligosaccharide und ihre physiologisch verträglichen Salze mit Säuren. Sie besitzen Alpha-Glukosidase, d. h. z. B. Alpha-Amylase- und Disaccharidase-, hemmende Eigenschaften. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Präparate, welche diese neuen OxiranPseudooligosaccharide oder ihre physiologisch verträglichen Salze mit Säuren enthalten, sowie die Verwendung dieser Verbindungen zur Hemmung von Alpha-Glukosidase, wobei die therapeutische Behandlung des Menschen ausgeschlossen ist.
In der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0 173 948 (EP-A2-0 173 948, entspr.
US-PS 4 632 917) werden Pseudooligosaccharide mit Alpha-Glukosidase-hemmender Wirkung und der Formel m
EMI1.1
in welcher I = 1 oder 2 m 1, 2 oder 3 n = eine ganze Zahl von 1 bis 20 bedeutet, beansprucht.
Bei den beschriebenen Verbindungen handelt es sich um potente Inhibitoren, im folgenden auch als Inhibitoren vom W-46 Typ bezeichnet, die aufgrund ihrer Wirkung auf Glukosid-Hydrolasen des Verdauungsextraktes als Resorptionsverzögerer von Glukose bei den Behandlungen von Diabetes, Adipositas u. a. eingesetzt werden können. Sie werden aus den Kulturflüssigkeit. en von Inhibitor W-46 bildenden Organismen wie z. B. Streptomyces galbus subsp. FH 1716 (DSM 3007) gewonnen. Man erhält nur nach einem aufwendigen Verfahren einheitliche Substanzen, vielfach gewinnt man eine Mischung von verschiedenen Inhibitoren, die sich in der Länge der Glukose-enthaltenden Ketten unterscheiden. Diese Uneinheitlichkeit ist für eine sichere Dosierung und Standardisierung hinderlich, sie ist bei der Anwendung des Präparats von Nachteil.
Es ist nun gefunden worden, das sich durch saure Hydrolyse oder enzymatische Glukoseabspaltung aus dem nativen Inhibitorgemisch entsprechend der EP-A2-0 173 948 neue, hochaktive Abbauprodukte gewinnen lassen, die mit geeigneten Methoden leicht voneinander getrennt und in reiner Form hergestellt werden können. Der vorliegende Erfindungsgegenstand ergibt sich nicht in naheliegender Weise aus der vorstehend genannten Europäischen Patentanmeldung, weil nicht zu erwarten war, dass die Spaltprodukte der bekannten Pseudooligosaccharide hochaktive Glukosidase-Inhibitoren sind.
Gegenstand der Erfindung sind daher neue Oxiran-Pseudooligosaccharide der Formel I
EMI1.2
worin z = Null oder 1 ist, sowie deren physiologisch verträgliche Salze mit Säuren. Die beiden unter die Formel I fallenden Inhibitoren weisen die folgenden Formeln Ia und Ib
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
auf. Das neue Pseudooligosaccharid der Formel Ia und seine Salze werden in den folgenden Ausführungen auch als Inhibitor W-46-H und das neue Pseudooligosaccharid der Formel Ib sowie seine Salze als Inhibitor W-46 P bezeichnet.
Die Erfindung hat ferner Verfahfen zur Herstellung der neuen Oxiran-Pseudooligosaccharide I und ihrer physiologisch verträglichen Salze mit Säuren, pharmazeutische Präparate, die diese Verbindungen enthalten, und die Verwendung dieser Verbindungen zur Hemmung von Alpha-Glukosidase, wobei die therapeutische Behandlung des Menschen ausgeschlossen ist, zur Hemmung von Alpha-Glukosidase in der Tiermedizin, zur Hemmung von Alpha-Glukosidase in der Tieremährung zur Hemmung von Alpha-Glukosidase in der Biotechnologie der Stärke, zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten für die Behandlung von Diabetes, Prädiabetes und Adipositas, sowie bei der Herstellung von Diagnostika oder Reagenzien gegen Karies zum Gegenstand.
Das erfmdungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Oxiran-Pseudooligosaecharide und ihrer physiologisch verträglichen Salze mit Säuren ist dadurch gekennzeichnet, dass man a) von einem Alpha-Glukosidaseinhibitor der Formel 11
EMI2.2
<Desc/Clms Page number 3>
in welcher m = 2 oder 3 n = eine ganze Zahl von 1 bis 20 bedeutet, oder von einem Gemisch dieser Inhibitoren unter Bildung einer Verbindung der Formel I durch saure Hydrolyse oder durch Anwendung von Glukoid-spaltenden enzymen Zucker abspaltet, oder b) den Pseudooligosaccaride der Formel I erzeugenden Mikroorganismus Streptomyces galbus subsp.
FH 1716 (DSM 3007) in einem Fermentationsmedium in geeignetem Submersverfahren kultiviert, die Pseudooligosaccaride aus dem Mycel oder dem Kultufiltrat in an sich bekannter Weise isoliert und die erhaltenen Verbindungen der Fomel I gegebenenfalls in ein physiologisch verträgliches Salz überführt.
Der bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eingesetzte Stamm Streptomyces galbus subsp.
FH 1716 ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DMS) unter der Registrier-Nr. DSM 3007 hinterlegt und in EP-A2-0 173 948 beschrieben. Es können aber auch die Varianten und Mutanten dieses Stammes zur Gewinnung der neuen Oxiran-Pseudooligosaccharide und ihrer Salze mit Säuren eingesetzt werden.
Inhibitoren der Formel 11 und Verfahren zu ihrer Gewinnung sind in EP-A2-0 173 948 beschrieben. Durch Abspaltung von Zucker wie z. B. Glukose entstehen nach dem erfindungsgemässen Verfahren an der Saccharidkette verkürzte, einheitliche Inhibitoren.
Die neuen Oxiran-Pseudooligosaccharide und ihre Salze mit Säuren werden vorzugsweise nach Methode a) gewonnen.
Bei der Gewinnung geht man zwecksmässigerweise wie folgt vor
Als Ausgangsmaterial dienen Inhibitoren der Formel 11 (vergl. EP-A2-0 173 948) entweder in angereicherter oder in chemisch gereinigter Form. Es können aber auch die rohen, ungereinigten Fermentationslösungen von W- 46 bildenden Organismen verwendet werden. Die Abspaltung der verschieden langen Glukoseketten der Inhibitoren erfolgt z. B. durch saure Hydrolyse mit Schwefelsäure, Salzsäure, Trifluoressigsäure u. a. im Temperaturbreich 0 bis 120 C, vorzugsweise 80-105 C. Die Hydrolysedauer beträgt in Abhängigkeit von der Temperatur einige Minuten bis mehrere Tage. Vorzugsweise arbeitet man im Bereich von 20 - 200 Minuten.
Eine andere Möglichkeit zur Abspaltung von Neutralzuckem wie z. B. Maltose und Glukose von den Inhibitoren des Gemisches gemäss EP-A2-0 173 948 besteht in der Anwendung von Alpha-Glukosid-spaltenden Enzymen. Es ist gefunden worden, dass im Gegensatz zu Warmblüterenzymen einige mikrobielle AlphaAmylasen sehr wohl in der Lage sind, die Inhibitoren vom W-46 Typ wie z. B. W-46 A, W-46 B oder W-46 C u. a. mehr (vergl. EP-A2-0 173 948) durch Neutralzuckerabspaltung zu verkürzen und damit zu vereinheitlichen.
Solche Enzyme sind z. B. die Alpha-Amylase aus Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis (beide besonders geeignet für die Gewinnung von W-46 H), es können aber auch Amylasen aus anderen geeigneten Mikroorganismen verwendet werden. Bevorzugt eingesetzt werden Alpha-Amylasen aus thermophilen oder thermotolerablen Mikroorganismen, deren Enzyme auch ein höheres Temperaturoptimum haben. Solche Amylasen führen bei den erhöhten Temperaturen zu höheren Reaktionsraten, d. h. zu vorteilhaften, kürzeren Reaktionszeiten. Mit Hilfe solcher geeigneter Enzyme lassen sich 0. 01 bis 20, vorzugsweise 0. 5-5 prozentiger Inhibitorlösungen in guter Ausbeute umsetzen. Der pH-Wert und die Temperatur werden hierbei in Abhängigkeit von den Enzymeigenschaften gewählt. Gearbeitet werden kann zwischen 0 und 100 C, bevorzugt wird der Bereich zwischen 30 und 80 C.
Durch Steuerung der Permentationszeit bei der mikrobiellen Herstellung (gemäss Verfahren b) oder Variation der Glukoseabspaltung oder der Hydrolysezeit (gemäss Verfahren a) kann entweder der Inhibitor W-46 H oder W-46 P bevorzugt gewonnen werden. Aus den Fermentations- oder Reaktionslösungen können die Inhibitoren durch an sich bekannte Verfahren isoliert und gereinigt werden.
Hierzu eignet sich eine grosse Zahl von Verfahren, wie beispielsweise Chromatographie an Ionenaustauschern, Molekularsieben oder Adsorptionsharzen, darüberhinaus Lösungsmittelfällungen, Ultrafiltration, Craig-Verteilung u. a.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung und Reinigung der Inhibitoren W-46 H bzw. P besteht darin, dass man die Inhibitoren aus dem-z. B. wie vorstehend beschrieben-behandelten Kulturfiltrat oder der Reaktionslösung an ein geeignetes Harz z. B. auf Polystyrolbasis adsorbiert, dieses beladene Harz abtrennt und die genannten Inhibitoren durch Elution mit geeigneten Pufferlösungen wie z. B. Phosphat- oder Na-acetatPufferlösung oder mit ggfs. wasserhaltigen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Methanol, Ethanol, Aceton, vorzugsweise aber mit wässrigem Isopropanol, isoliert. Die inhibitorhaltigen Eluate konzentriert man durch Ultrafiltration in an sich bekannter Weise, wobei gleichzeitig eine Entsalzung vorgenommen wird. Die ionenarme wässrige Lösung der erwähnten Inhibitoren wird dann auf einer Ionenaustauscher-Säule chromatographisch in an sich bekannter Weise aufgetrennt.
Vorzugsweise verwendet man stark oder schwach saure Kationenaustauscher z. B. auf Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisatbasis, welche als funktionelle Gruppen S03H oder-COOH Gruppen tragen (RDowex 50 W, RAmberlite CG 120) oder auf Basis modifizierter
EMI3.1
käufliche Kationenaustauscher. Der letzte Schritt der Isolierung ist die Anwendung eines Molekularsiebes, z. B. auf Polyacrylamid-Gel-Basis (RBiogel P-6) oder auf Basis modifizierter Cellulose (RSephadex). Die resultierenden wässrigen Lösungen des reinen Materials werden dann z. B. durch Lyophilisierung getrocknet.
Die reinen Inhibitoren W-46 H und W-46 P sind farblose, amorphe Pseudooligosaccharide. Sie enthalten
<Desc/Clms Page number 4>
Stickstoff und haben schwach basischen Charakter. So wandern die Inhibitoren W-46 H und P in der Hochspannungselektrophorse in sauren Puffern, wie z. B. wässrigen Ameisensäure/Essigsäure Mischungen als Kationen in Richtung Kathode. Die erfindungsmässigen Substanzen besitzen reduzierende Eigenschaften, die, wie in der Zuckerchemie üblich, z. B. mit Triphenyltetrazoliumchlorid (TCC) nachgewiesen werden können.
Die durch FAB-Massenspektrometrie bestimmten Molekulargewichte der reinen Verbindungen betragen : 981 m/z (M + H+) entsprechend der Summenformel C38H64N2027 des Inhibitors W-46 H (freie Base), bzw.
819 m/z (M + W) entsprechend der Summenformel C32H54N2022 des Inhibitors W-46 P (freie Base). Durch spektroskopische, insbesondere kernresonanzspektroskopische Untersuchungen wurden den Verbindungen W-46 H die Formel Ia und W-46 P die Formel Ib zugeordnet.
In der Literatur sind bereits mehrere Alpha-Glukosidaseinhibitoren beschrieben worden, jedoch nur die von H.
Takeda et al. (Japan KOKAI 83-172. 400 (11. Oktober 1983)) beschriebene Verbindungsreihe : NS 1 bis NS 17 enthält Epoxydringe (Oxirane) in den Strukturformeln. Die Epoxid-Strukturen kommen jeweils nur einmal vor.
Durch die Formeln Ia und Ib, in denen die wirksamen Epoxyd-pseudoaminozucker-Strukturen zweifach vorhanden sind, unterscheiden sich die erfindungsgemässen Verbindungen von den Inhibitoren der Reihe NS 1 bis NS 17. Gegenüber den Pseudooligosacchariden mit Alpha-Glukosidase-hemmender Wirkung gemäss EP-A2-0 173 948 sind W-46 H und W-46 P durch die verkürzten Saccharidketten (geringeres Molekulargewicht) unterscheidbar.
Somit liegen hier neue Substanzen vor, die eine einheitliche Struktur aufweisen.
EMI4.1
104Amylasetest
Eine Amylase-Inhibitoreinheit (AIE) ist definiert als die Inhibitormenge, die unter den Testbedingungen zwei Amylase-Einheiten (AE) zu 50 % zu hemmen vermag. Eine Amylase-Einheit ist nach internationaler Übereinkunft die Enzymmenge, die in einer Minute 1 J. 1 Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die J. 1Val gespaltener glucosidischer Bindungen werden als J. 1Val reduzierender Zucker photomerisch mit Dinitrosalizylsäure bestimmt. Die Angaben sind als J. 1Mole Maltose berechnet, die anhand einer MaltoseEichgeraden ermittelt werden.
Die Tests werden folgendermassen durchgeführt :
Alpha-Amylase aus Schweinepankreas und die zu testenden Lösungen werden gemeinsam in 1, 0 ml 20 mM Phosphatpuffer, pH 6, 9 + 10 mM NaCl 10-20 min. bei 37 C vorinkubiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 1, 0 ml löslicher Stärke (0, 25 % in dem angegebenen Puffer) nach Zulkowski gestartet. Nach genau 10 min. wird die Reaktion mit 2, 0 ml Dinitrosalizylsäure-Farbreagenz (nach Boehringer Mannheim : Biochemica-Information II) abgestoppt und zur Farbentwicklung 5 min. im siedenden Wasserbad erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die Extinktion bei 546 nm gegen den Reagentienleerwert gemessen. Die 50 %ige Hemmung wird im Vergleich zur ungehemmten Enzymreaktion durch Einsatz verschiedener Inhibitormengen graphisch mittels der Wahrscheinlichkeitsauftragung bestimmt.
Saccharase-Test
Eine Saccharase-Inhibitoreinheit (SIE) ist definiert als die Inhibitormenge, die unter den Testbedingungen zwei Saccharase-Einheiten (SE) zu 50 % zu hemmen vermag. Eine SE ist nach internationaler Übereinkunft die Enzymmenge, die in einer Minute 1 p. Äquivalent glycosidischer Bindungen der Saccharose spaltet. Die J. 1 Val
EMI4.2
Glukose Eichgeraden ermittelt werden.
Die Tests wurden nach H. U. Bergmeyer, beschrieben in "Methods of Enzymatic Analysis", 3rd edition, Verlag Chemie, Weinheim, 1984, Seite 96 - 103, durchgeführt.
Die Eigenschaften der erfmdungsgemässen Inhibitoren sind im Hinblick auf die Anwendung als Therapeutikum gegen Diabetes und Prädiabetes sowie Adipositas und Unterstützung von Diät interessant. Aufgrund ihrer Eigenschaften sind sie auch bei der Herstellung von Reagenzien für diagnostische Zwecke wertvoll. Die Erfindung betrifft daher auch Arzneimittel, insbesondere solche zur Behandlung der genannten Krankheiten, sowie die Verwendung als Arzneimittel, insbesondere als Antidiabetikum, sowie bei der Herstellung von Reagenzien.
Stärke- und rohrzuckerhaltige Nahrungs- und Genussmittel führen bei Tier und Mensch zu einem Anstieg des Blutzuckers und dadurch auch zu einer vermehrten Insulinsekretion des Pankreas. Die Hyperglykämie kommt durch die Aufspaltung der Stärke und des Rohrzuckers im Verdauungstrakt unter Einwirkung von Amylase und Saccharase zu Glukose zustande.
Bei Diabetikern ist die Hyperglykämie besonders ausgeprägt und lang anhaltend.
<Desc/Clms Page number 5>
Die alimentäre Hyperglykämie sowie die Hyperinsulinämie nach Stärke- und Rohrzuckeraufnahme lässt sich durch die erfindungsgemässen Inhibitoren W-46 H und W-46 P vermindern. Diese Wirkung ist dosisabhängig. Die erfindungsgemässen Alpha-Glukosidase-inhibitoren lassen sich daher als Therapeutikum einsetzen bei Diabetes, Prädiabetes und Adipositas sowie zur Unterstützung von Diät. Zu diesem Zweck empfiehlt sich eine Verabreicherung, insbesondere zu den Mahlzeiten. Die Dosierung, die sich nach dem Gewicht des Patienten sowie dem individuellen Bedarf ausrichten soll, beträgt 5 - 500 mg pro Dosis, die zweckmässig zu jeder Mahlzeit genommen wird. Die Dosierung kann jedoch in begründeten Einzelfällen auch darüber oder darunter liegen.
Die erfindungsgemässen Alpha-Glukosidase-Inhibitoren eignen sich insbesondere zur oralen Verabreichung.
Sie können als Substanz per se, als ihre physiologisch verträglichen Salze mit Säuren, aber auch in Form einer pharmazeutischen Zubereitung unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägerstoffe angewandt werden. Auch eine kombinierte Anwendung mit anderen Arzneimitteln, wie blutzuckersenkenden oeer lipidsenkenden Substanzen, kann von Vorteil sein. Da höhermolekulare Saccharide als solche nicht oder nicht nennenswert aus dem Verdauungstrakt resorbiert werden, sind von den erfindungsgemässen Substanzen keine toxikologisch bedenklichen Nebenwirkungen zu erwarten.
Dementsprechend konnten nach oraler Gabe auch hoher Dosen der Inhibitoren W-46 H und P an Versuchstieren keine auffälligen Symptome erkannt werden.
Zur Prüfung der pharmakologischen Wirkung der Alpha-Glukosidase-Inhibitoren erhielten nüchterne, männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht zwischen 200 und 250 g einen erfindungsgemässen Hemmstoff W-46 H oder W-46 P zusammen mit 2 g Stärke bzw. Rohrzucker pro kg Körpergewicht als Suspension in @Tylose (Methyl-hgdroxyethyl-cellulose) oral verabreicht. Durch Bestimmung von Blutzuckerkonzentrationen in Blutproben, die vor, während und nach p. o. Applikation der Alpha-Glukosidase-Inhibitoren entnommen worden sind, wurde die Wirksamkeit der Präparate bewiesen.
In diesen Untersuchungen wurden für den Inhibitor W-46 H die in den Tabellen 1 (Wirkung auf Blutglukosekonzentration der Stärke-belasteten Ratte) und 2 (Wirkung auf die Blutglukosekonzentration der
EMI5.1
EMI5.2
<tb>
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Blutglukose <SEP> in <SEP> mmo <SEP> !/l <SEP> ( <SEP> ? <SEP> SEM, <SEP> n <SEP> = <SEP> 7) <SEP>
<tb> Stunden <SEP> p. <SEP> o. <SEP> Dosis <SEP> p. <SEP> o. <SEP> Dosis <SEP> Kontrolle
<tb> nach <SEP> der
<tb> Behandlung <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP> mg/kg <SEP> 1.0 <SEP> mg/kg
<tb> 0 <SEP> 3. <SEP> 770. <SEP> 09 <SEP> 3. <SEP> 93 <SEP> 0. <SEP> 10 <SEP> 3. <SEP> 790. <SEP> 14 <SEP>
<tb> 0. <SEP> 5 <SEP> 5.53 <SEP> ¯ <SEP> 0.17 <SEP> 5.04 <SEP> ¯ <SEP> 0.08 <SEP> 5.56 <SEP> ¯ <SEP> 0.16
<tb> 1 <SEP> 5. <SEP> 590. <SEP> 06 <SEP> 5. <SEP> 070. <SEP> 09 <SEP> 6. <SEP> 360. <SEP> 17 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 5. <SEP> 670. <SEP> 13 <SEP> 4.
<SEP> 9910. <SEP> 14 <SEP> 5. <SEP> 180. <SEP> 17 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 4. <SEP> 860. <SEP> 18 <SEP> 4. <SEP> 570. <SEP> 10 <SEP> 4. <SEP> 9410. <SEP> 16 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 4. <SEP> 39 <SEP> ¯ <SEP> 0.13 <SEP> 4.13 <SEP> ¯ <SEP> 0.08 <SEP> 4.19 <SEP> ¯ <SEP> 0.14
<tb>
Tabelle 2
EMI5.3
<tb>
<tb> Zeit <SEP> Blutglukose <SEP> in <SEP> mmoi/i <SEP> (X <SEP> i <SEP> SEM, <SEP> n <SEP> = <SEP> 7)
<tb> in <SEP> Minuten <SEP> p. <SEP> o. <SEP> Dosis <SEP> p. <SEP> o. <SEP> Dosis <SEP> p. <SEP> o. <SEP> Dosis <SEP> Kontrolle
<tb> nach <SEP> der
<tb> Behandlung <SEP> 1 <SEP> mg/kg3 <SEP> mg/kgIQmg/kg <SEP>
<tb> 0 <SEP> 3.99 <SEP> ¯ <SEP> 0.10 <SEP> 3.94 <SEP> ¯ <SEP> 0.14 <SEP> 4.01 <SEP> ¯ <SEP> 0.15 <SEP> 4.08 <SEP> ¯ <SEP> 0.12
<tb> 15 <SEP> 6.07 <SEP> ¯ <SEP> 0.28 <SEP> 5.71¯0.23 <SEP> 5.06¯0.20 <SEP> 6.65¯0.40
<tb> 30 <SEP> 6. <SEP> 01 <SEP> 0. <SEP> 22 <SEP> 5.
<SEP> 53 <SEP> 0. <SEP> 19 <SEP> 5. <SEP> 11 <SEP> 0. <SEP> 10 <SEP> 6. <SEP> 630. <SEP> 10 <SEP>
<tb> 60 <SEP> 6. <SEP> 34¯0.14 <SEP> 5.47¯0.15 <SEP> 4.82¯0.09 <SEP> 7.18¯0.30
<tb> 120 <SEP> 5. <SEP> 45¯0.13 <SEP> 5.20¯0.16 <SEP> 4.50¯0.11 <SEP> 5.50¯0.09
<tb> 240 <SEP> 4. <SEP> 57¯0.07 <SEP> 4.83¯0.15 <SEP> 4.29¯0.22 <SEP> 4.90¯0.07
<tb>
Aus den in Tabelle I angegebenen Werten errechnet sich ein Grenzwert von 0, 27 mg/kg Ratte und aus den in Tabelle 2 angegebenen Werten ein Grenzwert von 1, 29 mg/kg Ratte (unter Grenzwert der Wirksubstanz wird diejenige Menge pro kg Versuchstier verstanden, bei deren Verabreichung nach einer Stunde noch eine deutliche Wirkung festzustellen ist).
Neben der Blutglukoseregulation kann man die erfindungsgemässen Oligosaccharide auch zur Hemmung der Speichel Alpha-Amylase verwenden. Dieses Enzym bewirkt die Verdauung der Stärke im Mund und der so gebildete Zucker fördert den Kariesbefall der Zähne. Die erfindungsgemässen Verbindungen können daher zur
<Desc/Clms Page number 6>
Verhütung oder Verminderung der Ausbildung von Karies angewandt werden.
Weiterhin können sie als biochemische Reagenzien sowie als diagnostische Mittel verwendet werden.
Beispiel l : 5, 0 g Inhibitorgemisch mit den Komponenten W-46 A, W-46 B und W-46 C, gewonnen entsprechend den nachstehenden Vorschriften A und B werden in 80 ml 2 N Trifluoressigsäure gelöst und während 10 Minuten unter Sauerstoffausschluss auf 100 C erhitzt. Nach Ablauf dieser Zeit wird das Reaktionsgefäss unter Rühren rasch abgekühlt und die wässrige Trifluoressigsäure im Vakuum bis zur Trockene abdestilliert.
Zur Gewinnung der verkürzten Inhibitoren wird der feste Destillationsrückstand in destilliertem Wasser gelöst und auf eine, mit dem Ionenaustauscher SP-SephadexR C-25 gefüllte und auf pH 3 äquilibrierte Säule von 3 l Inhalt aufgetragen. Die Elution der Wirksubstanz erfolgt durch Anlegen eines ansteigenden 50 mM NaCI- Gradienten. Während die Kochsalzkonzentration mit einer Leitfähigkeit von 3. 0 mS den Inhibitor W-46 H von der Säule löst, geschieht die Elution der Verbindung W-46 P bei einer Leitfähigkeit von 4 mS. Die getrennt gesammelten Eluate werden zur Entsalzung durch Ultrafiltration bei > 35 bar konzentriert und anschliessend gefriergetrocknet. Es resultieren 0, 7 g des Inhibitors W-46 H und 1. 6 g des Inibitors W-46 P (jeweils als Hydrochloride).
Vorschrift A :
Zur Gewinnung von W-46 erfolgte die Impfstoffanzucht (Anzucht des Mikroorganismus) - wie in der mikrobiologischen Praxis üblich - aus einer gefriergetrockneten Dauerform des Organismus Streptomyces galbus, PH 1716 DSM 3007, über Einzelkoloniepassage und Schrägröhrchen. Die für die Fermentation notwendige Massenproduktion an Sporen wurde ebenfalls auf festem Nährboden in Roux-Flaschen durchgeführt.
Agarmedium für Platte. Schrägröhrchen und Roux-Flasche :
Dextrin 15, 0 g/l
Rohrzucker 3, 0 g/l
Fleischextrakt 1, 0 g/l
Hefeextrakt 2, 0 g/l
EMI6.1
5 g/lpH-Wert 7, 3
Sterilisation bei 1200C 20 min.
Inkubation bei 300C 9 Tage.
Das beimpfte Röhrchen und die Roux-Flasche wurden 7 Tage bei 300C bebrütet und danach bei +4 C gehalten. Die Sporen wurden mit 10 ml sterilisiertem Aqua dest. oder physiologischer Kochsalzlösung von dem festen Nährboden abgeschwemmt. 5 ml der Suspension dienten zur Beimpfung eines 2000 ml Erlenmeyerkolbens, der mit 500 ml sterilisierter wässriger Nährlösung mit einem pH-Wert von 7, 7 und folgender Zusammensetzung beschickt war (Angaben in Gew.-%).
1, 00 % Glukose
0, 40 % Caseinpepton
0, 40 % Fleischextrakt
0, 25 % NaCl
0, 05 % Hefeextrakt
0, 05 % Leberpulver.
Der Kolben wurde bei 220 Upm 48 Stunden bei +30 C auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Danach wurde diese Vorkultur in ein 121-Fermenter überführt, der mit 9 I sterilisierter wässriger Nährlösung beschickt war und einen pH-Wert von 7, 4 hatte. Die Zusammensetzung der Nährlösung für die Hauptkultur war folgende (Angaben in Gewichts-%).
2, 0 % Fleischextrakt
2, 0 % Malzextrakt
1, 0 % Calciumcarbonat
0, 1 % Antischaummittel, ad 100 % Wasser.
<Desc/Clms Page number 7>
Die Hauptkultur wurde bei 28 C, 2 Tage mit 850 Upm gerührt, die Luftzufuhr betrug 4201 pro Stunde. Nach 18,24, 30,36, 40,44 und 48 Stunden wurde der Gehalt an Alpha-Amylaseinhibitor gemäss der Vorschrift von R.
Bender et al., Anal. Biochem, 131, 307-312 (1984) bestimmt. Der Stamm Str. galbus FH 1716 lieferte unter den beschriebenen Versuchs-und Kulturbedingungen durchschnittlich 5 x 10"AlE/ml bei einem End-pH von 9, 0.
Vorschrift B :
8 I Fermentationslösung gemäss Vorschrift A wurden mit Hilfe einer Zentrifuge von der Zellmasse befreit und die klare flüssige Phase wurde auf pH 9, 5 eingestellt. Anschliessend trug man die Lösung auf eine 0, 8 I Polystyrol-Adsorptionsharz (Diaion@ HP-20) beinhaltende Säule auf, wusch mit 1, 5 I Wasser nach und eluierte mit Wasser, dem steigende Mengen Isopropanol hinzugefügt worden war. Die Mischung, die 10 % Isopropanol enthielt, löste den Inhibitor W-46 von der Säule. Diese aktiven Eluate (1, 2 I) wurden durch Ultrafiltration konzentriert und unter Wasserzugabe sowie weitere Ultrafiltration solange entsalzt, bis das Retenat keine nachweisbaren Salze mehr enthielt.
Das resultierende Konzentrat (0, 2 I) trennte man auf Sulfopropyl modif.
Cellulose (SP-Sephadex@, die in die Säureform (H+-Form) überführt war. Durch Anlegen eines Ammoniumacetatgradienten, pH 5 (0-0, 5 molar), wurden die die Alpha-Amylase-hemmende Aktivität enthaltenden Fraktionen eluiert. Die entsprechenden Fraktionen wurden in Ultrafiltrationszellen (OAmicon) konzentriert und entsalzt. Die Endreinigung geschah an Polyacrylamid-Gel (BiogelO P-6) mit reinem Wasser als Laufmittel. Die W-46-haltigen Fraktionen dieser Säule wurden gesammelt und gefriergetrocknet. Es resultierten 1, 5 g einen hellbeigen amorphen Pulvers mit einer Alpha-Amylase-hemmenden Wirksamkeit von 4 x 104 AIE pro mg Substanz.
Beispiele
65 g Inhibitorgemisch, gewonnen nach Beispiel 1, werden in 6, 51 Wasser gelöst und der pH-Wert wird auf 7. 5 eingestellt. Anschliessend wird 1 g Alpha-Amylase aus Bacillus subtilis 130 U/mg hinzugegeben und 18 Stunden bei 60 C gerührt. Während dieser Zeit achtet man darauf, dass der pH-Wert konstant bleibt. Nach Ablauf der Reaktionszeit wird die resultierende Lösung bei Raumtemperatur über 4 I 20 Polystyrol-Adsorptionsharz (@Diaion HP-20) filtriert. Während der sogenannte Durchlauf die unerwünschten Verunreinigungen, Neutralzucker und Salze enthält, gewinnt man den Inhibitor W-46 H durch Waschen der Säule mit 20110 % iger Isopropanollösung. Die Trocknung führt zum gewünschten Inhibitor.
Sollte an dieser Stelle die Verbindung W-46 H nicht rein genug anfallen, so kann eine Weiterreinigung an Ionenaustauschern erfolgen, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 3:
10 g des Inhibitors W-46 H, gewonnen nach Beispiel 1, werden in 200 ml Wasser gelöst und über 200 ml Anionenaustauscher IRA-68, OH-Form, welches in eine Glassäule gefüllt wird, filtriert. Anschliessend wird mit 200 ml Wasser nachgewaschen. Die Eluate werden gereinigt. Sie enthalten den Inhibitor in Form der freien Base.
Die Lösung wird nun in 4 gleiche Teile geteilt. Je ein viertel wird mit Glukuronsäure bzw. mit Schwefelsäure bzw. mit Salzsäure auf pH 6 gestellt und gefriergetrocknet ebenso wie das 4. Viertel, welches nicht neutralisiert wird. Die letzte Lösung ergibt nach der Trocknung 2,3 g W-46 H (freie Base) mit 4 x 104 AlE/mg und 1 x 104
EMI7.1
62. 6 g W-46 P-Glucuronat, 2. 3 g W-46 P-Sulfat, 2. 3gW-46P-Chlorid.