EP0049847B1 - Alpha-Amylaseinaktivator, Verfahren zu seiner Herstellung, Mittel auf Basis dieses Inaktivators sowie dieser Inaktivator zur Regulierung des Blutzuckerspiegels - Google Patents

Alpha-Amylaseinaktivator, Verfahren zu seiner Herstellung, Mittel auf Basis dieses Inaktivators sowie dieser Inaktivator zur Regulierung des Blutzuckerspiegels Download PDF

Info

Publication number
EP0049847B1
EP0049847B1 EP81107960A EP81107960A EP0049847B1 EP 0049847 B1 EP0049847 B1 EP 0049847B1 EP 81107960 A EP81107960 A EP 81107960A EP 81107960 A EP81107960 A EP 81107960A EP 0049847 B1 EP0049847 B1 EP 0049847B1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
inactivator
thr
val
cys
hoe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
EP81107960A
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
EP0049847A2 (de
EP0049847A3 (en
Inventor
László Dr. Vértesy
Miroslav Mracek
Gerhard Prof. Dr. Braunitzer
Heinz Dr. Aschauer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19803038130 external-priority patent/DE3038130A1/de
Priority claimed from DE19813107106 external-priority patent/DE3107106A1/de
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
Priority to AT81107960T priority Critical patent/ATE12242T1/de
Publication of EP0049847A2 publication Critical patent/EP0049847A2/de
Publication of EP0049847A3 publication Critical patent/EP0049847A3/de
Application granted granted Critical
Publication of EP0049847B1 publication Critical patent/EP0049847B1/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues

Definitions

  • DE-OS 2 701 890 describes an a-amylase inhibitor which is obtained by fermentation of Streptomyces tendae 4158 (ATCC31210) and its variants and mutants. It is a chemical peptide and has the ability a-amylase. irreversibly inactivate. Because of these properties, it can be used to regulate blood sugar levels.
  • HOE467 a - amylase activator
  • the inactivator can be produced in a simpler manner in greater purity, and that the highly pure substance consists of two components, hereinafter referred to as HOE467-A and HOE467-B.
  • a-amylase activator means both the mixture and the individual components.
  • the invention therefore relates to an ⁇ -amylase activator consisting of the components HOE467-A and HOE467-B, or from the component HOE467-A or HOE467-B, and to a process for its preparation and separation into the two components.
  • HOE467-A has an increased enzymatic activity and consists of the two components HOE467-A and HOE467-B, which are characterized by the following data:
  • the hydrolyzate of HOE 467-A has the following amino acid composition:
  • the hydrolyzate of HOE467-B has the following amino acid composition:
  • Trp was determined by measuring the absorption in UV light. The remaining amino acids were determined after hydrolytic cleavage.
  • the isoelectric points of the two components differ slightly, they depend on the ionic strength and the determination methods (Biochemical paperback, published by HM Rauen, Springer Verlag, 1964).
  • the values obtained by isoelectric focusing (RC Allen, HR Maurer: Elektrophoresis and Isoelectric Focusing in Polyacrylamid Gel, W. de Gruyter, Berlin, 1974) are:
  • HOE467-A was cleaved hydrolytically, the corresponding acids Glu and Asp being formed from glutamine (Gln) and asparagine - (Asn).
  • the inactivator HOE467-B is a degradation product of HOE 467-A shortened at the N-terminal chain end.
  • HOE 467-A shortened at the N-terminal chain end.
  • the specific inhibitory effect against a-amylase from porcine pancreas is 1.7.10 7 AIE / g.
  • An amylase inhibitor unit is defined as the amount of inhibitor that is able to inhibit two amylase units (AE) by 50% under the test conditions.
  • an amylase unit is the amount of enzyme that cleaves 1 ⁇ equivalent of glucosidic bonds in starch in one minute.
  • the ⁇ Val cleaved glucosidic bonds are determined as ⁇ Val reducing sugars photometrically with dinitrosalicylic acid.
  • the data are calculated as ⁇ Moles of maltose, which are determined using a maltose calibration line.
  • the strain Streptomyces tendae 4158 ATCC31210
  • the derived strain Streptomyces tendae HAG 1266 DSM 1912
  • the inactivator is obtained from the culture solution. Use of the Streptomyces tendae HAG 1266 strain is preferred.
  • the invention also relates to the strain Streptomyces tendae HAG 1266 (DSM 1912).
  • the new strain differs from the strain Streptomyces tendae ATCC31210 in important properties. What is striking are the different morphological characteristics of the two strains and also new properties that are important for the fermentative production and isolation of the a-amylase inactivator according to the invention, such as the faster growth and the approximately 40% increased a-amylase inactivator production capacity.
  • the formation of melanin which is manifested by the brown-black color of the culture solution and the culture filtrate in the Streptomyces tendae ATTC 31210 and which presents the workup with certain purification problems, was found in the new strain HAG 1266 (DSM 1912) with the help of genetic interventions about 1 / lo reduced and also qualitatively changed by a color shift.
  • the melanin pigments now show a yellow-reddish color spectrum. The elimination of this type of melanin during processing is not a problem.
  • the strain Streptomyces tendae HAG 1266 has been deposited with the German Collection of Microorganisms (DSM) under registration number DSM 1912.
  • the fermentation is expediently carried out in an analogous manner to that described in DE-OS2701 890.
  • the finished fermentation solutions from Strep tomyces tendae ATCC31210 and HAG 1266 contain enzymes that can significantly reduce the concentration of the active substance during work-up.
  • substances such as melanin may be present, the complete separation of which is difficult to achieve with the known methods.
  • the process according to the invention for producing the ⁇ -amylase activator is characterized in that Streptomyces tendae ATCC31210 or 1266 is cultivated and the inactivator is separated from the culture with the aid of adsorption resins or reverse phase chromatography and then purified.
  • the resin is brought into contact with the culture filtrate.
  • the pH of the culture liquids is adjusted to 2 to 8, preferably 4 to 6.
  • the solid resin selectively adsorbs the HOE467 inactivator, whereas the unwanted enzymes and most of the contaminants can be removed by filtration because they remain unbound in solution.
  • the recovery of the HOE467 from the resin is conveniently carried out either by washing with suitable aqueous buffer solutions such as Phosphate buffer or with aqueous solutions of organic solvents such as e.g. lower aliphatic alcohols, acetone, acetonitrile or others.
  • the further enrichment of the now enriched inactivator HOE467 is carried out according to known methods.
  • the separation described with adsorption resins is based on the principle of the distribution of different polar compounds. Other distribution methods can be used for the required rapid separation. Distributions in the sense of reverse phase chromatography are also suitable (G. Schwendt, Chromatographic Separation Methods, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1979), whereby either commercially available carriers or self-made, e.g. silanized carriers, find use. Finally, reference should also be made to the liquid-liquid separation processes, e.g. with aqueous polyethylene glycol, aqueous phosphate buffer systems, as are described in principle, for example, in DE-OS 2 639129.
  • ion exchangers e.g. DEAE cellulose is suitable for cleaning the a-amylase activator HOE 467.
  • pH values were chosen which ensure a required degree of ionization.
  • HOE467 is separated into two components.
  • a component of the active substance is held in place by the ion exchanger and can only be removed from it by changing the pH or by increasing the salt concentration. This substance is called HOE467-A.
  • the other component remains more or less unbound from the ion exchanger under the conditions mentioned and can be easily washed from the carrier. This component is called HOE 467-B.
  • inactivator HOE 467-A e.g. by chromatography, in the presence or absence of a dissociating buffer, preferably urea (6-8 M aqueous solution), over DEAE or cation exchange columns, e.g. Carboxymethyl cellulose columns, cleaned and isolated by conventional methods. This additional cleaning is e.g. before determining the amino acid sequence.
  • a dissociating buffer preferably urea (6-8 M aqueous solution
  • DEAE or cation exchange columns e.g. Carboxymethyl cellulose columns
  • the a-amylase activator according to the invention is resistant to enzymatic degradation. Its properties are interesting with regard to its use as a medicament, in particular as a therapeutic agent against diabetes and prediabetes and obesity, as well as its use to support diet. Both the individual components and the mixture of HOE467-A and HOE 467-B can be used in the application.
  • the invention therefore also relates to a pharmaceutical composition containing the amylase activator according to the invention and its use.
  • Hyperglycaemia is caused by the breakdown of starch in the digestive tract under the action of amylase and maltase to form glucose.
  • This hyperglycemia is particularly pronounced and long-lasting in diabetics.
  • Alimentary hyperglycaemia and hyperinsulinemia after starch intake can be reduced by the claimed amylase inactivator.
  • This effect is dose-dependent.
  • the amylase inactivator according to the invention can therefore be used as a therapeutic agent for diabetes, prediabetes and obesity and to support diet. For this purpose, administration is recommended, especially with meals.
  • the dosage which should be based on the patient's weight and individual needs, is approximately 10,000 up to 300000AIE, but it can also be above or below in justified cases.
  • the amylase inactivator according to the invention is particularly suitable for oral administration. It can be used as a pure substance but also in the form of a pharmaceutical preparation using the customary auxiliaries and carriers, such as Talc, magnesium stearate, milk sugar, starch or polyethylene glycols.
  • a dosage form for example, tablets, capsules or granules are suitable.
  • NZO mice have an impaired glucose tolerance. They are therefore particularly suitable for examinations in which the blood glucose level is influenced.
  • the experimental setup corresponds to that in rats. Blood is drawn from the orbital vein plexus. The course of blood glucose is monitored over 3 hours.
  • the detection of active substances is carried out in an anologic way on NMRI mice.
  • the blood samples are taken from the orbital vein plexus and the blood sugar course is monitored over 3 hours.
  • the animals treated with the inactivator according to the invention showed a lower, increased blood sugar rise compared to untreated animals.
  • the strain Streptomyces tendae HAG 1266 is inoculated on inclined tubes with a nutrient medium of the following composition:
  • the inoculated tube is incubated for 10 days at 28 ° C and then stored at + 4 ° C.
  • the spores which easily dissolve from the yellowish aerial mycelium, are sterilized in 10 ml of distilled aqua. suspended with 0.2 ml Tween 80.
  • 10 8 -10 9 spores, ie 1 ml of the suspension is used to inoculate a 300 ml Erlenmeyer flask which is loaded with 35 ml of sterilized nutrient solution with a pH of 7.2 and the following composition:
  • the sterilization time is 45 minutes. at 121 ° C and 1 bar.
  • the flask is shaken at 250 rpm for 40 hours at + 30 ° C on a shaker with an amplitude of 3.5 cm.
  • Each 5 ml of this preculture is transferred to several Erlenmeyer flasks, which are loaded with 50 ml of sterilized nutrient solution and have a pH of 7.4.
  • the composition of this main culture is as follows:
  • the sterilization time is 45 minutes. at 121 ° C and 1 bar.
  • the main cultures were shaken at 25 ° C at 250 rpm on a shaker with an amplitude of 3.5 cm for 96-120 hours.
  • the content of a-amylase inactivator is determined in accordance with the test instructions.
  • the strain Streptomyces tendae HAG 1266 delivers under the described experimental and culture conditions at a final pH of 6.4 1900 ATE / ml.
  • the pH should be 6.8 after sterilization and is adjusted to this value with sterilized acid (2n H 3 P0 4 ) or lye (2n NaOH) as required.
  • the main stage is inoculated with 1 1, corresponding to 10%, of a preculture as described in Example 1.
  • the ventilation is 300 l / h with a stirring of 250 rpm and an overpressure of 0.3 bar.
  • Sampling monitors and tracks the fermentation process with regard to inhibitor activity, carbohydrate degradation, biomass development and the physical-technical behavior of the culture solution (surface tension, viscosity, density, osmotic pressure).
  • the maximum inhibitory activity is reached from the 60th culture hour with an average of 1800 AIE / ml.
  • the fermenter content is then fed to the workup.
  • 6.5 l of culture filtrate obtained by filtering off the Streptomyces culture obtained in accordance with Example 2, were adjusted to pH 4.9 with glacial acetic acid while stirring and applied to a prepared glass column.
  • the column contained 230 g polystyrene adsorption resin (e.g. Diaion® HP20) slurried in water.
  • the column dimensions were 22x5 cm, corresponding to a volume of 430 ml.
  • the liquid flow was regulated in such a way that 6.5 liters had passed through after 2 hours.
  • the adsorption process was then complete and the resin could first be washed with pure water and then eluted with water, to which increasing amounts of isopropanol had been added.
  • the liquid flowing through was captured in fractions of 11 each and tested for enzyme-inhibiting activity.
  • the active fractions were collected and concentrated in vacuo to 100 ml by distillation.
  • the concentrate contained 110,000 AIE / ml.
  • the substance obtained according to the example was then dissolved in 10 ml of the same buffer and applied to the column. First the column contents were washed with 100 ml of acetate buffer, then sodium chloride was gradually added to this eluent in such a way that a continuous gradient was ensured.
  • HOE467-B When collecting the column flow fractionally, HOE467-B was in the initial fractions, which were still free of saline, while the HOE467-A component was detectable in the fractions in which the NaCl concentration was 0.25 to 0.3 molar.
  • the fractions containing B and A components were collected separately, dialyzed against distilled water and freeze-dried. The colorless substances each had an effectiveness of
  • the a-amylase activator HOE 467-A and HOE 467-B are obtained in an analogous manner from the culture solution of Streptomyces tendae ATCC 31210.
  • HOE467-A obtained according to Example 4 or 5 is purified by chromatography on a DEAE or carboxymethyl cellulose column in the presence of 8M, aqueous urea solution as a dissociating buffer and isolated by customary methods.
  • the a-amylase activator HOE467-A obtained according to a) with a pure end group is either oxidized with performic acid or reacted with azirane to split the disulfide bridges [cf. C.H.W. Hirs, J. Biol. Chem. 219, 611-621 (1956) and M.A. Raftery and R.D. Cole, J. Biol. Chem. 241, 3457-3461 (1966)] and tryptically cleaved by conventional methods.
  • the tryptic hydrolyzates are separated and purified by chromatography.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

  • In der DE-OS 2 701 890 wird ein a-Amylaseinhibitor beschrieben, der durch Fermentation von Streptomyces tendae 4158 (ATCC31210) sowie seiner Varianten und Mutanten gewonnen wird. Er ist seiner chemischen Struktur nach ein Peptid und besitzt die Fähigkeit a-Amylase. irreversibel zu inaktivieren. Aufgrund dieser Eigenschaften kann er zur Regulierung des Blutzuckerspiegels verwendet werden.
  • Es wurde nun gefunden, dass durch Anwendung eines verbesserten Verfahrens zur Gewinnung und Reinigung des a-Amylaseinaktivators, im folgenden auch als HOE467 bezeichnet, der Inaktivator auf einfacherem Wege in grösserer Reinheit hergestellt werden kann, und dass die hochreine Substanz aus 2 Komponenten, im folgenden als HOE467-A und HOE467-B bezeichnet, besteht.
  • Sofern nichts anderes gesagt ist, werden in den vorstehenden und folgenden Ausführungen unter a-Amylaseinaktivator sowohl das Gemisch als auch die Einzelkomponenten verstanden.
  • Die Erfindung betrifft daher einen a-Amylaseinaktivator bestehend aus den Komponenten HOE467-A und HOE467-B, oder aus der Komponente HOE467-A oder HOE467-B sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung und Auftrennung in die beiden Komponenten.
  • Für den erfindungsgemässen a-Amylaseinaktivators HOE 467 sowie für die beiden Einzelkomponenten HOE467-A und HOE467-B trifft die in der- DE-OS 2701890 angegebene Substanzbeschreibung mit Ausnahme der folgenden wesentlichen Unterschiede zu:
  • Er besitzt eine erhöhte enzymatische Wirksamkeit und besteht aus den 2 Komponenten HOE467-A und HOE467-B, die durch folgende Daten charakterisiert sind: Das Hydrolysat von HOE 467-A weist folgende Aminosäurezusammensetzung auf:
    Figure imgb0001
  • Das Hydrolysat von HOE467-B hat folgende Aminosäurezusammensetzung:
    Figure imgb0002
  • Die Bestimmung von Trp erfolgte durch Absorptionsmessung im UV-Licht. Die übrigen Aminosäuren wurden nach hydrolytischer Spaltung bestimmt.
  • Die isoelektrischen Punkte der beiden Komponenten unterscheiden sich geringfügig, sie sind abhängig von der lonenstärke sowie den Bestimmungsmethoden (Biochemisches Taschenbuch, herausgegeben von H.M. Rauen, Springer Verlag, 1964). Die durch isoelektrische Fokussierung (R.C. Allen, H.R. Maurer: Elektrophoresis and Isoelectric Focusing in Polyacrylamid Gel, W. de Gruyter, Berlin, 1974) erhaltenen Werte betragen:
    Figure imgb0003
  • Der erfindungsgemässe hochreine a-Amylaseinaktivator HOE467-A ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass seine Endgruppe die Asparaginsäure ist, dass er aus 74 Aminosäuren mit folgenderSequenz
    • Asp-Thr-Thr-Val-Ser-Glu-Pro-Ala-Pro-Ser-Cys-
    • Val-Thr-Leu-Tyr-Gln-Ser-Trp-Arg-Tyr-Ser-Gln-
    • Ala-Asp-Asn-Gly-Cys-Ala-Glu-Thr-Val-Thr-Val-
    • Lys-Val-Val-Tyr-Glu-Asp-Asp-Thr-Glu-Gly-Leu-
    • Cys-Tyr-Ala-Val-Ala-Pro-Gly-Gln-Ile-Thr-Thr-
    • Val-Gly-Asp-Gly-Tyr-lle-Gly-Ser-His-Gly-His-
    • Ala-Arg-Tyr-Leu-Ala-Arg-Cys-Leu

    besteht und zwischen Cys 11 und Cys 27 sowie zwischen Cys 45 und Cys 73 Disulfidbrücken aufweist. Sein Molekulargewicht berechnet sich aufgrund der Zusammensetzung zu 7958.
  • Zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung wurde HOE467-A hydrolytisch gespalten, wobei aus Glutamin (Gln) und Asparagin -(Asn) die entsprechenden Säuren Glu und Asp entstanden.
  • Der Inaktivator HOE467-B ist ein am N-terminalen Kettenende verkürztes Abbauprodukt von HOE 467-A. So kann z.B. bei einem der möglichen Abbauprodukte Serin die terminale Gruppe sein.
  • Für die beiden Komponenten HOE467-A und HOE467-B beträgt die spezifische Hemmwirkung gegen die a-Amylase aus Schweinepankreas jeweils 1,7.107 AIE/g.
  • Die Hemmwirkung wurde in dem nachfolgend beschriebenen Amylasetest bestimmt:
    • Amylasetest
  • Eine Amylase-Inhibitoreinheit (AIE) ist definiert als die Inhibitormenge, die unter den Testbedingungen zwei Amylaseeinheiten (AE) zu 50% zu hemmen vermag. Eine Amylaseeinheit ist nach internationaler Übereinkunft die Enzymmenge, die in einer Minute 1 µ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die µVal gespaltener glucosidischer Bindungen werden als µVal reduzierender Zucker photometrisch mit Dinitrosalizylsäure bestimmt. Die Angaben sind als µMole Maltose berechnet, die anhand einer Maltose-Eichgeraden ermittelt werden.
  • Die Tests werden folgendermassen durchgeführt:
    • a-Amylase aus Schweinepankreas und die zu testende Lösung werden gemeinsam in 1,0 ml 20 mM Phosphatpuffer, pH 6,9 + 10 mM NaCI 10-20 min. bei 37°C vorinkubiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 1,0 ml löslicher Stärke nach Zulkowski (0,25% in dem angegebenen Puffer) gestartet. Nach genau 10 min. wird die Reakton mit 2,0 ml Dinitrosalizylsäure-Farbreagenz (nach Boehringer Mannheim: Biochemica-Information II) abgestoppt und zur Farbentwicklung 5 min. im siedenden Wasserbad erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die Extinktion bei 546 nm gegen den Reagentienleerwert gemessen. Die 50%ige Hemmung wird im Vergleich zur ungehemmten Enzymreaktion durch Einsatz verschiedener Inhibitormengen graphisch mittels der Wahrscheinlichkeitsauftragung bestimmt.
  • Bei der Herstellung des erfindungsgemässen a-Amylaseinaktivators bedient man sich erfindungsgemäss des Stammes Streptomyces tendae 4158 (ATCC31210) oder des abgeleiteten Stammes Streptomyces tendae HAG 1266 (DSM 1912). Der Inaktivator wird aus der Kulturlösung gewonnen. Die Anwendung des Stammes Streptomyces tendae HAG 1266 ist bevorzugt.
  • Die Erfindung betrifft ferner auch den Stamm Streptomyces tendae HAG 1266 (DSM 1912).
  • Der neue Stamm unterscheidet sich von dem Stamm Streptomyces tendae ATCC31210 durch wichtige Eigenschaften. Auffällig sind die unterschiedlichen morphologischen Charakteristika beider Stämme und ebenso neue, für die fermentative Herstellung und die Isolierung des erfindungsgemässen a-Amylaseinaktivators bedeutende Eigenschaften, wie das schnellere Wachstum und die um etwa 40% erhöhte a-Amylase-Inaktivator-Produktionskapazität. Die Melanin-Bildung, die sich bei dem Streptomyces tendae ATTC 31210 durch eine braun-schwarze Farbe der Kulturlösung und des Kulturfiltrats manifestiert und die Aufarbeitung vor gewisse Reinigungsprobleme stellt, wurde bei dem neuen Stamm HAG 1266 (DSM 1912) mit Hilfe von genetischen Eingriffen auf etwa 1/lo reduziert und auch qualitativ durch eine farbliche Verschiebung verändert. Die Melaninpigmente zeigen nun ein gelb-rötliches Farbspektrum. Die Eliminierung dieser Melaninart bei der Aufarbeitung ist unproblematisch.
  • Die beiden a-Amylase-Inaktivator produzierenden Stämme sind in der folgenden Tabelle gegenübergestellt:
    Figure imgb0004
  • Der Stamm Streptomyces tendae HAG 1266 ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) unter der Registriernummer DSM 1912 hinterlegt worden.
  • Die Fermentation wird zweckmässig in analoger Weise wie in der DE-OS2701 890 beschrieben, durchgeführt.
  • Die fertigen Fermentationslösungen des Streptomyces tendae ATCC31210 und HAG 1266 enthalten Enzyme, die die Wirkstoffkonzentration während der Aufarbeitung beträchtlich vermindern können. Darüberhinaus können Stoffe wie z.B. Melanin vorhanden sein, deren vollständige Abtrennung mit den bekannten Verfahren nur schwierig zu erreichen ist.
  • Es ist nun gefunden worden, dass die erforderlichen Abtrennungen des Inaktivators aus der Kulturlösung durch Verwendung von sogenannten Adsorptionsharzen (DE-PS 1274128, US-PS 3531 963) leicht durchgeführt werden können.
  • Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des a-Amylaseinaktivators ist dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces tendae ATCC31210 oder 1266 kultiviert und aus der Kultur den Inaktivator mit Hilfe von Adsorptionsharzen oder Reversephase-Chromatographie abtrennt und anschliessend reinigt.
  • Geeignet sind handelsübliche Harze wie z.B. Polystyrolharze. Zur Anwendung wird das Harz mit dem Kulturfiltrat in Berührung gebracht. Der pH-Wert der Kulturflüssigkeiten wird auf 2 bis 8, vorzugsweise 4 bis 6, eingestellt. Das feste Harz adsorbiert den Inaktivator HOE467 selektiv, wohingegen die unerwünschten Enzyme sowie der grösste Teil der Verunreinigungen durch Filtration entfernt werden können, da sie ungebunden in Lösung bleiben. Die Wiedergewinnung des HOE467 vom Harz erfolgt zweckmässigerweise entweder durch Waschen mit geeigneten wässrigen Pufferlösungen wie z.B. Phosphatpuffer oder mit wässrigen Lösungen von organischen Lösungsmitteln wie z.B. niederen aliphatischen Alkoholen, Aceton, Acetonitril oder anderen. Die weitere Reinigung des nun angereicherten Inaktivators HOE467 erfolgt nach bekannten Verfahren.
  • Die geschilderte Trennung mit Adsorptionsharzen beruht auf dem Prinzip der Verteilung verschiedener polarer Verbindungen. Für die erforderliche rasche Abtrennung lassen sich noch weitere Methoden der Verteilung verwenden. So sind ferner Verteilungen im Sinne der Reversephase-Chromatographie geeignet (G. Schwendt, Chromatographische Trennmethoden, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1979), wobei entweder käufliche Träger oder selbst hergestellte, z.B. silanisierte Träger, Verwendung finden. Schliesslich sei auch noch auf die Flüssig-flüssig-Trennverfahren hingewiesen, z.B. mit wässrigem Polyäthylenglykol, wässrigen Phosphatpuffersystemen, wie sie im Prinzip beispielsweise in der DE-OS 2 639129 beschrieben sind.
  • Es ist in der DE-OS2701 890 beschrieben worden, dass sich lonenaustauscher, wie z.B. DEAE-Cellulose zur Reinigung des a-Amylaseinaktivators HOE 467 eignen. Hierbei wurden - wie in der lonenaustauscherchromatographie üblich - pH-Werte gewählt, die einen erforderlichen lonisierungsgrad gewährleisten. Es wurde nun überraschend gefunden, dass wenn man Reinigungen - entgegen der Regel - in der Nähe des isoelektrischen Punktes, d.h. bei einem geringen lonisierungsgrad durchführt, HOE467 in zwei Komponenten getrennt wird. Geeignet ist zur Trennung der pH-Bereich von 4,4-6, vorzugsweise von 4,8 bis 5,3. Dabei wird eine Komponente des Wirkstoffs vom Ionenaustauscher festgehalten und kann von diesem nur durch Änderung des pH-Wertes oder durch Erhöhen der Salzkonzentration heruntergelöst werden. Dieser Stoff wird HOE467-A genannt. Die andere Komponente bleibt unter den genannten Bedingungen vom Ionenaustauscher mehr oder weniger ungebunden und kann soweit leicht vom Träger gewaschen werden. Diese Komponente wird HOE 467-B genannt.
  • Obwohl die Komponenten für eine pharmazeutische Anwendung hinreichend rein anfallen, kann noch eine zusätzliche Reinigung durchgeführt werden.
  • So wird der Inaktivator HOE 467-A z.B. durch Chromatographie, in An- oder Abwesenheit eines dissoziierenden Puffers, vorzugsweise Harnstoff (6-8 M wässrige Lösung), über DEAE- oder Kationenaustauscher-Säulen, wie z.B. Carboxymethyl- cellulose-Säulen, gereinigt und nach üblichen Methoden isoliert. Diese zusätzliche Reinigung wird z.B. vor Bestimmung der Aminosäuresequenz durchgeführt.
  • Der erfindungsgemässe a-Amylaseinaktivators ist gegenüber enzymatischem Abbau resistent. Seine Eigenschaften sind im Hinblick auf seine Anwendung als Arzneimittel, insbesondere als Therapeutikum gegen Diabetes und Prädiabetes sowie Adipositas, sowie auf seine Anwendung zur Unterstützung von Diät interessant. Bei der Anwendung können sowohl die Einzelkomponenten als auch das Gemisch aus HOE467-A und HOE 467-B eingesetzt werden.
  • Die Erfindung betrifft daher auch ein pharmazeutisches Mittel enthaltend den erfindungsgemässen Amylaseinaktivator sowie seine Verwendung.
  • Stärkehaltige Nahrungs- und Genussmittel führen bei Tier und Mensch zu einem Anstieg des Blutzuckers und dadurch auch zu einer vermehrten Insulinsekretion des Pankreas. Die Hyperglykämie kommt durch die Aufspaltung der Stärke im Verdauungstrakt unter Einwirkung von Amylase und Maltase zu Glukose zustande.
  • Bei Diabetikern ist diese Hyperglykämie besondes ausgeprägt und langanhaltend.
  • Bei Adipösen wirkt die vermehrte Insulinsekretion auf die Lipogenese und vermindert die Lipolyse:
  • Die alimentäre Hyperglykämie sowie die Hyperinsulinämie nach Stärkeaufnahme lässt sich durch den beanspruchten Amylase-Inaktivator vermindern. Diese Wirkung ist dosisabhängig. Der erfindungsgemässe Amylase-Inaktivator lässt sich daher als Therapeuticum einsetzen.bei Diabetes, Prädiabetes und Adipositas sowie zur Unterstützung von Diät. Zu diesem Zweck empfiehlt sich eine Verabreichung, insbesondere zu den Mahlzeiten. Die Dosierung, die sich nach dem Gewicht des Patienten sowie dem individuellen Bedarf ausrichten soll, beträgt etwa 10000 bis 300000AIE, sie kann jedoch in begründeten Fällen auch darüber oder darunter liegen.
  • Der erfindungsgemässe Amylase-Inaktivator eignet sich insbesondere zur oralen Verabreichung. Er kann als reine Substanz aber auch in Form einer pharmazeutischen Zubereitung unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägerstoffe angewandt werden, wie z.B. Talkum, Magnesiumstearat, Milchzucker, Stärke oder Polyethylenglykole. Als Darreichungsform eignen sich beispielsweise Tabletten, Steckkapseln oder auch ein Granulat.
  • Auch eine kombinierte Anwendung mit anderen Arzneimitteln wie blutzuckersenkenden oder lipidsenkenden Substanzen kann von Vorteil sein.
  • Da höhermolekulare Peptide als solche nicht oder nicht nennenswert aus dem Verdauungstrakt resorbiert werden, sind von der erfindungsgemässen Substanz keine toxikologisch bedenklichen Nebenwirkungen zu erwarten. Aufgrund der nicht aussergewöhnlichen Aminosäurezusammensetzung sind auch evtl. proteolytische Spaltprodukte als physiologisch unbedenklich anzusehen. Dementsprechend konnten bei oraler Gabe auch hoher Dosen des Amylaseinaktivators an Versuchstiere keine auffälligen Symptome erkannt werden. Auch bei intravenöser Applikation an Mäusen (1 g/kg) wurde der erfindungsgemässe Inaktivator bei 24stündiger Beobachtungszeit ohne erkennbare toxische Wirkung vertragen.
  • Zur Prüfung der pharmakologischen Wirkung des Amylase-Inaktivators erhielten nüchterne, männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht zwischen 200 und 250 g den erfindungsgemässen Inaktivator gleichzeitig mit 2g g Stärke pro kg Körpergewicht oral verabreicht, nachdem unmittelbar zuvor eine Blutentnahme zur Bestimmung des Ausgangsblutzuckerwertes erfolgte. Weitere Blutentnahmen erfolgten nach 15 und 30 Minuten sowie nach 1, 2, 3 und 5 Stunden aus der Schwanzvene. Die Blutzuckerbestimmungen wurden nach der Methode von Hoffman im Autoanalyzer [J. biol. Chem. 120, 51 (1937)] durchgeführt.
  • NZO-Mäuse weisen eine gestörte Glucosetoleranz auf. Sie eignen sich deshalb besonders gut für Untersuchungen, bei denen der Blutglucosespiegel beeinflusst wird. Die Versuchsanordnung entspricht der bei Ratten. Die Blutentnahme erfolgt aus dem Orbitalvenen-Plexus. Der Blutzukkerverlauf wird über 3 Stunden verfolgt.
  • In anologer Weise wird der Wirkstoffnachweis an NMRI-Mäusen erbracht. Die Blutentnahmen erfolgen ebenfalls aus dem Orbitalvenen-Plexus und der Blutzuckerverlauf wird über 3 Stunden verfolgt.
  • Unter diesen Versuchsanordnungen zeigten die mit dem erfindungsgemässen Inaktivator behandelten Tiere einen gegenüber unbehandelten Tieren geringeren, protrahierten Blutzuckeranstieg.
    • Beispiel 1
  • Der Stamm Streptomyces tendae HAG 1266 wird auf Schrägröhrchen mit einem Nährboden folgender Zusammensetzung geimpft:
    • Haferflocken 50 g ad. 1000 ml H2O pH 7,2
  • Das beimpfte Röhrchen wird 10 Tage bei 28°C bebrütet und danach bei +4°C gelagert. Die aus dem gelblichen Luftmyzel sich leicht lösenden Sporen werden in 10 ml sterilisiertes aqua dest. mit 0,2 ml Tween 80 suspendiert. 108-109-Sporen, d.h. 1 ml der Suspension dient zur Beimpfung eines 300 ml Erlenmeyerkolbens, der mit 35 ml sterilisierter Nährlösung mit einem pH-Wert von 7,2 und folgender Zusammensetzung beschickt ist:
    • 1% Glukose 1% Sojamehl 0,25% NaCI
  • Die Sterilisationszeit beträgt 45 min. bei 121°C und 1 bar. Der Kolben wird bei 250 Upm 40 Stunden bei +30°C auf einer Schüttelmaschine bei einer Amplitude 3,5 cm geschüttelt. Je 5 ml dieser Vorkultur werden in mehrere Erlenmeyerkolben überführt, die mit 50 ml sterilisierter Nährlösung beschickt sind und einen pH-Wert von 7,4 haben. Die Zusammensetzung dieser Hauptkultur ist folgende:
    Figure imgb0005
  • Die Sterilisationszeit beträgt 45 min. bei 121°C und 1 bar. Die Hauptkulturen wurden bei 25°C mit 250 Upm auf einer Schüttelmaschine mit einer Amplitude von 3,5 cm 96-120 Stunden geschüttelt. Am dritten, vierten und fünften Kulturtag wird der Gehalt an a-Amylase-Inaktivator gemäss Testvorschrift bestimmt.
  • Der Stamm Streptomyces tendae HAG 1266 liefert unter den beschriebenen Versuchs- und Kulturbedingungen bei einem End-pH von 6,4 1900 ATE/ml.
    • Beispiel 2
  • Ansatz wie im Beispiet 1, die Hauptfermentation wird jedoch in einem Fermenter von 151 Gesamtvolumen mit Füllung 101 durchgeführt. Es wird folgende Nährlösung-Zusammensetzung verwendet:
    Figure imgb0006
  • Der pH-Wert soll nach der Sterilisation 6,8 betragen und wird nach Bedarf mit sterilisierter Säure (2n H3P04) oder Lauge (2 n NaOH) auf diesen Wert eingestellt. Beimpft wird die Hauptstufe mit 1 1, entsprechend 10%, einer wie unter Beispiel 1 beschriebenen Vorkultur.
  • Es wird 50 bis 70 Std. bei 30°C fermentiert. Die Belüftung beträgt 300 l/h bei einer Rührung von 250 Upm und einem Überdruck von 0,3 bar.
  • Durch die Probenahme wird der Fermentationsverlauf hinsichtlich der Inhibitoraktivität, des Carbohydrateabbaus, der Biomasseentwicklung und des physikalisch-technischen Verhaltens der Kulturlösung (Oberflächenspannung, Viskosität, Dichte, osmotischer Druck) überwacht und verfolgt.
  • Die maximale Inhibitoraktivität wird ab der 60. Kulturstunde mit durchschnittlich 1800 AIE/ml erreicht. Danach wird der Fermenterinhalt der Aufarbeitung zugeführt.
    • Beispiel 3
  • 6,5 I Kulturfiltrat, gewonnen durch Abnutschen der nach Beispiel 2 gewonnenen Streptomyceskultur, wurden mit Eisessig unter Rühren auf pH 4,9 gestellt und auf eine vorbereitete Glassäule aufgetragen. Die Säule beinhaltete 230 g Polystyrol-Adsorptionsharz (z.B. Diaion® HP20) in Wasser aufgeschlämmt. Die Säulenmasse betrugen 22x5 cm entsprechend einem Volumen von 430 ml. Den Flüssigkeitsdurchfluss regelte man so, dass nach 2 Stunden 6,5 1 durchgelaufen sind. Dann war der Adsorptionsvorgang beendet und das Harz konnte zunächst mit reinem Wasser gewaschen und anschliessend mit Wasser, dem steigende Mengen Isopropanol hinzugefügt worden sind, eluiert werden. Die durchfliessende Flüssigkeit wurde in Fraktionen von je 11 eingefangen und auf enzymhemmende Wirkung getestet. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und im Vakuum auf 100 ml destillativ eingeengt. Das Konzentrat enthielt 110 000 AIE/ml.
  • Die so entstandene, jetzt salzfreie Lösung wurde direkt auf eine mit
    Figure imgb0007
    -Phosphatpuffer, pH 7,5, vorbereitete DEAE-Ionenaustauscher-Säule aufgetragen und entsprechend DAS 2 701 890, Beispiel 5, gereinigt. Es resultierten 4 g Substanz mit 2500 AIE/mg.
    • Beispiel 4
  • Zur weiteren Reinigung wurde eine Glassäule von 2 cm Durchmesser und 22 cm Höhe, entsprechend 70 ml Inhalt, mit DEAE-Cellulose gefüllt, die vorher mit
    Figure imgb0008
     m Natriumacetatpuffer, pH 4,9 und 0,02% Natriumazid equilibriert worden ist. Nun wurde die nach Beispiel erhaltene Substanz in 10 ml des gleichen Puffers gelöst und auf die Säule aufgetragen. Zunächst wusch man den Säuleninhalt mit 100 ml Acetatpuffer, dann wurde zu diesem Elutionsmittel allmählich Kochsalz so zugemischt, dass ein kontinuierlicher Gradient gewährleistet war. Beim fraktionierten Auffangen des Säulendurchflusses befand sich HOE467-B in den noch Kochsalz-freien Anfangsfraktionen, während die HOE467-A Komponente in den Fraktionen nachweisbar war, in denen die NaCI-Konzentration 0,25 bis 0,3 molar war. Die B-sowie die A-Komponenten enthaltenden Fraktionen wurden getrennt gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Die farblosen Substanzen hatten eine Wirksamkeit von jeweils
    • 1,7.104 AIE/mg.
  • Die Aminosäurenanalyse der Produkte ergab nach 20stündiger Salzsäurehydrolyse mit Hilfe eines Beckman-Multichroanalysators folgende prozentuale Zusammensetzungen:
    Figure imgb0009
    • Beispiel 5
  • In analoger Weise erhält man aus der Kulturlösung von Streptomyces tendae ATCC 31210 den a-Amylaseinaktivator HOE 467-A und HOE 467-B.
    • Beispiel 6 a) Herstellung des N-terminal einheitlichen a-Amylaseinaktivators HOE 467-A:
  • HOE467-A erhalten gemäss Beispiel 4 oder 5 wird durch Chromatographie über eine DEAE-oder Carboxymethylcellulose-Säule in Gegenwart von 8M, wässriger Harnstofflösung als dissoziierendem Puffer gereinigt und nach üblichen Methoden isoliert.
    • b) Herstellung tryptischer Peptide:
  • Der gemäss a) erhaltene a-Amylaseinaktivator HOE467-A mit reiner Endgruppe wird zur Aufspaltung der Disulfidbrücken entweder mit Perameisensäure oxydiert oder mit Aziran umgesetzt [vgl. C.H.W. Hirs, J. Biol. Chem. 219, 611-621 (1956) und M.A. Raftery und R.D. Cole, J. Biol. Chem. 241, 3457-3461 (1966)] und nach üblichen Methoden tryptisch gespalten. Die tryptischen Hydrolysate werden chromatographisch getrennt und gereinigt.
    • c) Sequenzanalyse:
  • Die Sequenzanalyse wurde nach der Filmtechnik [P. Edmann und G. Begg, Eur. J. Biochem. 1, 80-91 (1967)] durchgeführt unter Anwendung folgender Programme:
    • a) Quadrolprogramm: Es wurde der gemäss b) mit Aziran umgesetzte a-Amylaseinaktivator HOE 467-A und ein limitiert tryptisch gespaltener lnaktivator A abgebaut.
    • ß) Propinprogramm: Hier wurden die übrigen Peptide abgebaut [vgl. G. Braunitzer und B. Schrank, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 351, 88 (1970) und G. Braunitzer, A. Stangel und O. Scheithauer, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359,137―146 (1978)].
    d) Aminosäureanalyse:
  • Sie wurde nach Hydrolyse des gemäss a) erhaltenen Inaktivators mit 6 N Salzsäure durchgeführt.
    • e) Bestimmung der Disulfidbrücken:
  • Hierzu wurde die gemäss a) erhaltene Substanz in verdünnter Ameisensäure mit Pepsin während 18 Stunden behandelt, die Spaltprodukte wurden nach üblichen Methoden gereinigt. Aufgrund der durchgeführten Operationen zeigte sich, dass die gemäss a) erhaltene Substanz aus 74 Aminosäuren besteht, deren Sequenz wie folgt ist:
    • Asp-Thr-Thr-Val-Ser-Glu-Pro-Ala-Pro-Ser-Cys-
    • Val-Thr-Leu-Tyr-Gln-Ser-Trp-Arg-Tyr-Ser-Gln-
    • Ala-Asp-Asn-Gly-Cys-Ala-Glu-Thr-Val-Thr-Val-
    • Lys-Val-Val-Tyr-Glu-Asp-Asp-Thr-Glu-Gly-Leu-
    • Cys-Tyr-Ala-Val-Ala-Pro-Gly-Gln-Ile-Thr-Thr-
    • Val-Gly-Asp-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-His-Gly-His-
    • Ala-Arg-Tyr-Leu-Ala-Arg-Cys-Leu

    und die an den genannten Stellen Disulfidbrükken besitzt.

Claims (8)

1. a-Amylaseinaktivator, bestehend aus dem Inaktivator HOE 467-A, dessen Hydrolysat folgende Aminosäurezusammensetzung aufweist:
Figure imgb0010
und der einen isoelektrischen Punkt bei 4,35 ± 0,15 besitzt oder bestehend aus dem Inaktivator HOE467-B, dessen Hydrolysat folgende Aminosäurezusammensetzung aufweist:
Figure imgb0011
und der einen isoelektrischen Punkt bei 4,53 ± 0,15 besitzt oder bestehend aus den beiden Komponenten HOE 467-A und HOE 467-B.
2. a-Amylaseinaktivator gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass HOE467-A ein Molekulargewicht von 7958 besitzt und dass die 74Aminosäuren folgende Sequenz aufweisen:
Asp-Thr-Thr-Val-Ser-Glu-Pro-Ala-Pro-Ser-Cys-
Val-Thr-Leu-Tyr-Gln-Ser-Trp-Arg-Tyr-Ser-Gln-
Ala-Asp-Asn-Gly-Cys-Ala-Glu-Thr-Val-Thr-Val-
Lys-Val-Val-Tyr-Glu-Asp-Asp-Thr-Giu-Gly-Leu-
Cys-Tyr-Ala-Val-Ala-Pro-Gly-Gln-Ile-Thr-Thr-
Val-Gly-Asp-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-His-Gly-His-
Ala-Arg-Tyr-Leu-Ala-Arg-Cys-Leu

und dass zwischen Cys 11 und Cys 27 sowie zwischen Cys 45 und Cys 73 Disulfidbrücken sind.
3. Verfahren zur Herstellung des a-Amylaseinaktivators gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces tendae ATCC 31210 oder HAG 1266 kultiviert und aus der Kultur den Inaktivator HOE467 mit Hilfe von Adsorptionsharzen oder Reversephase-Chromatographie abtrennt und anschliessend durch lonenaustauscherchromatographie in einem pH-Bereich von 4,4 bis 6 in die zwei Komponenten HOE 467-A und HOE467-B auftrennt.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man den abgetrennten Inaktivator HOE467 mit Hilfe von Ionenaustauschern im pH-Bereich zwischen 4,8 und 5,3 in die beiden Komponenten HOE467-A und HOE467-B auftrennt.
5. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man den abgetrennten Inaktivator HOE467 mit Hilfe von Ionenaustauschern im pH-Bereich zwischen 4,4 und 6 in die beiden Komponenten HOE467-A und HOE467-B auftrennt und HOE 467-A durch Chromatographie an DEAE- oder Carboxymethyl-cellulose-Säulen in Gegenwart eines dissoziierenden Puffers weiter reinigt und isoliert.
6. Streptomyces tendae HAG 1266 (DSM 1912).
7. Pharmazeutisches Präparat enthaltend den a-Amylaseinaktivator gemäss Anspruch 1.
8. a-Amylaseinaktivator gemäss Anspruch 1 zur Regulierung des Blutzuckerspiegels.
EP81107960A 1980-10-09 1981-10-06 Alpha-Amylaseinaktivator, Verfahren zu seiner Herstellung, Mittel auf Basis dieses Inaktivators sowie dieser Inaktivator zur Regulierung des Blutzuckerspiegels Expired EP0049847B1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT81107960T ATE12242T1 (de) 1980-10-09 1981-10-06 Alpha-amylaseinaktivator, verfahren zu seiner herstellung, mittel auf basis dieses inaktivators sowie dieser inaktivator zur regulierung des blutzuckerspiegels.

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3038130 1980-10-09
DE19803038130 DE3038130A1 (de) 1980-10-09 1980-10-09 (alpha) -amylaseinaktivatoren sowie verfahren zu ihrer herstellung
DE19813107106 DE3107106A1 (de) 1981-02-26 1981-02-26 (alpha) -amylaseinaktivator und verfahren zu seiner herstellung
DE3107106 1981-02-26

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EP0049847A2 EP0049847A2 (de) 1982-04-21
EP0049847A3 EP0049847A3 (en) 1982-08-25
EP0049847B1 true EP0049847B1 (de) 1985-03-20

Family

ID=25788382

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP81107960A Expired EP0049847B1 (de) 1980-10-09 1981-10-06 Alpha-Amylaseinaktivator, Verfahren zu seiner Herstellung, Mittel auf Basis dieses Inaktivators sowie dieser Inaktivator zur Regulierung des Blutzuckerspiegels

Country Status (9)

Country Link
US (1) US4451455A (de)
EP (1) EP0049847B1 (de)
AU (1) AU542795B2 (de)
CA (1) CA1172978A (de)
DE (1) DE3169418D1 (de)
DK (1) DK446481A (de)
ES (1) ES8207217A1 (de)
FI (1) FI813108L (de)
NO (1) NO813407L (de)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5885899A (ja) * 1981-11-16 1983-05-23 Fujirebio Inc アミラ−ゼインヒビタ−およびその製造法
DE3331860A1 (de) * 1983-09-03 1985-03-21 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur herstellung von tendamistat
FI844289L (fi) * 1984-01-21 1985-07-22 Hoechst Ag Nya polypeptider med -amylashaemmande verkan, foerfarande foer deras framstaellning, deras anvaendning och farmaceutiska preparat.
DE3738541A1 (de) * 1987-11-13 1989-05-24 Hoechst Ag Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin
DE3536182A1 (de) * 1985-10-10 1987-04-16 Hoechst Ag Promotor-anordnung fuer streptomyceten-vektoren
AU3818095A (en) * 1994-10-20 1996-05-15 Industrial Research Limited Separation of amino acids and peptides from protein hydrolysates
US7829552B2 (en) 2003-11-19 2010-11-09 Metabasis Therapeutics, Inc. Phosphorus-containing thyromimetics
US7262318B2 (en) * 2004-03-10 2007-08-28 Pfizer, Inc. Substituted heteroaryl- and phenylsulfamoyl compounds
US20050288340A1 (en) * 2004-06-29 2005-12-29 Pfizer Inc Substituted heteroaryl- and phenylsulfamoyl compounds
KR20070084455A (ko) * 2004-11-23 2007-08-24 워너-램버트 캄파니 엘엘씨 지질혈증 치료용 ｈｍｇ ｃｏ-ａ 환원효소 억제제로서의7-(2ｈ-피라졸-3-일)-3,5-디히드록시-헵탄산 유도체
US7741317B2 (en) 2005-10-21 2010-06-22 Bristol-Myers Squibb Company LXR modulators
US7888376B2 (en) 2005-11-23 2011-02-15 Bristol-Myers Squibb Company Heterocyclic CETP inhibitors
JP5498168B2 (ja) 2006-12-01 2014-05-21 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー アテローム性動脈硬化および循環器疾患の治療のためのｃｅｔｐ阻害剤としてのｎ−（（３−ベンジル）−２，２−（ビス−フェニル）−プロパン−１−アミン誘導体
EA020466B1 (ru) 2007-06-04 2014-11-28 Синерджи Фармасьютикалз Инк. Агонисты гуанилатциклазы, пригодные для лечения желудочно-кишечных нарушений, воспаления, рака и других заболеваний
US8969514B2 (en) 2007-06-04 2015-03-03 Synergy Pharmaceuticals, Inc. Agonists of guanylate cyclase useful for the treatment of hypercholesterolemia, atherosclerosis, coronary heart disease, gallstone, obesity and other cardiovascular diseases
CA2726917C (en) 2008-06-04 2018-06-26 Synergy Pharmaceuticals Inc. Agonists of guanylate cyclase useful for the treatment of gastrointestinal disorders, inflammation, cancer and other disorders
CA2730603C (en) 2008-07-16 2019-09-24 Synergy Pharmaceuticals Inc. Agonists of guanylate cyclase useful for the treatment of gastrointestinal disorders, inflammation, cancer and other disorders
WO2010093601A1 (en) 2009-02-10 2010-08-19 Metabasis Therapeutics, Inc. Novel sulfonic acid-containing thyromimetics, and methods for their use
WO2011145022A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 Pfizer Inc. 2-phenyl benzoylamides
US20130156720A1 (en) 2010-08-27 2013-06-20 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome and related diseases and disorders
US9616097B2 (en) 2010-09-15 2017-04-11 Synergy Pharmaceuticals, Inc. Formulations of guanylate cyclase C agonists and methods of use
US20130345392A1 (en) 2011-03-04 2013-12-26 Pfizer Inc Edn3-like peptides and uses thereof
WO2013133685A1 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Biotropics Malaysia Berhad Extract formulations of rhodamnia cinerea and uses thereof
EP2970384A1 (de) 2013-03-15 2016-01-20 Synergy Pharmaceuticals Inc. Agonisten der guanylatcyclase und deren verwendungen
CA2905435A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Synergy Pharmaceuticals Inc. Compositions useful for the treatment of gastrointestinal disorders
JP2016516804A (ja) 2013-04-17 2016-06-09 ファイザー・インク 心血管疾患を治療するためのｎ−ピペリジン−３−イルベンズアミド誘導体
CN113388007A (zh) 2013-06-05 2021-09-14 博士医疗爱尔兰有限公司 鸟苷酸环化酶c的超纯激动剂、制备和使用所述激动剂的方法
EP3186242B1 (de) 2014-08-29 2021-10-06 Tes Pharma S.r.l. Inhibitoren von alpha-amino-beta-carboxymuconsäure semialdehyd-decarboxylase
WO2016055901A1 (en) 2014-10-08 2016-04-14 Pfizer Inc. Substituted amide compounds
EP3526199B1 (de) 2016-10-14 2022-04-13 Tes Pharma S.r.l. Inhibitoren der alpha-amino-beta-carboxymuconsäure-semialdehyddecarboxylase
CN113302189A (zh) 2018-11-20 2021-08-24 Tes制药有限责任公司 α-氨基-β-羧基己二烯二酸半醛去羧酶的抑制剂
JOP20210193A1 (ar) 2019-01-18 2023-01-30 Astrazeneca Ab مثبطات pcsk9 وطرق استخدامها

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5125232B1 (de) * 1965-02-24 1976-07-29
DE2701890C2 (de) * 1977-01-19 1983-08-04 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Peptielischer Glycosidhydrolase-Inhibitor aus einem Streptomyceten und seine Verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
ES505959A0 (es) 1982-09-01
DK446481A (da) 1982-04-10
US4451455A (en) 1984-05-29
NO813407L (no) 1982-04-13
ES8207217A1 (es) 1982-09-01
AU542795B2 (en) 1985-03-14
CA1172978A (en) 1984-08-21
EP0049847A2 (de) 1982-04-21
EP0049847A3 (en) 1982-08-25
FI813108L (fi) 1982-04-10
AU7615081A (en) 1982-04-22
DE3169418D1 (en) 1985-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0049847B1 (de) Alpha-Amylaseinaktivator, Verfahren zu seiner Herstellung, Mittel auf Basis dieses Inaktivators sowie dieser Inaktivator zur Regulierung des Blutzuckerspiegels
EP0151246B1 (de) Neue Polypeptide mit alpha-Amylase-hemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und pharmazeutische Präparate
EP0003616B1 (de) Neue Aminozucker-Derivate, ihre Herstellung und Amylase-hemmende Mittel
DE2064092C2 (de) Inhibitoren für Glykosidhydrolasen aus Actinomyceten
DE2331144A1 (de) Wasserloesliche extrakte von mycobacterien
EP0599159B1 (de) Heterogenes Proteingemisch mit alpha-L-rhamnosidase Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
DE3109335C2 (de) Ebelacton A und B, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Mittel
DE2919132A1 (de) Substanz ks-2-b, verfahren zu deren herstellung und diese substanz enthaltende mittel
DD215580A5 (de) Hypocholesterolaemisch aktives protein
DE2701890C2 (de) Peptielischer Glycosidhydrolase-Inhibitor aus einem Streptomyceten und seine Verwendung
DE1919837B2 (de) Leupeptine, deren Salze und Verfahren zu ihrer Herstellung
EP0057349B1 (de) Neues Peptid-Antibiotikum Komponente B, Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung in Arzneimitteln
DD222895A5 (de) Verfahren zur herstellung eines hypotriglyceridemisch aktiven polysaccharids
EP0173950A2 (de) Neuer alpha-Glukosidase Inhibitor, Verfahren zur seiner Herstellung, seine Verwendung und pharmazeutische Präparate
DE2803397C2 (de)
DE2950980C2 (de) Antibiotikum BN-183B und Arzneimittel, welche dieses enthalten
EP0057812B1 (de) Neues Peptid-Antibiotikum Komponente A, Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung in Arzneimitteln
DE2304780A1 (de) Plasminostreptin und verfahren zu seiner herstellung
DE2532589A1 (de) Polypeptid und verfahren zur herstellung desselben und mittel mit einem gehalt desselben
DE2146674C3 (de) Faktor und seine Verwendung als Arzneimittel
DE2708493A1 (de) Neues antibiotikum am-1042
EP0257418B1 (de) Oxiran-Pseudooligosaccharide, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und pharmazeutische Präparate
AT389516B (de) Neue oxiran-pseudooligosaccharide, verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung und sie enthaltende pharmazeutische praeparate
DE2443560C2 (de)
EP0173948A2 (de) Neue Pseudooligosaccharide mit alpha-Glukosidase-hemmender Wirkung, Verfahren zur deren Herstellung, deren Verwendung und pharmazeutische Präparate

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

AK Designated contracting states

Designated state(s): AT BE CH DE FR GB NL SE

PUAL Search report despatched

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009013

AK Designated contracting states

Designated state(s): AT BE CH DE FR GB NL SE

17P Request for examination filed

Effective date: 19821025

GRAA (expected) grant

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009210

AK Designated contracting states

Designated state(s): AT BE CH DE FR GB LI NL SE

REF Corresponds to:

Ref document number: 12242

Country of ref document: AT

Date of ref document: 19850415

Kind code of ref document: T

REF Corresponds to:

Ref document number: 3169418

Country of ref document: DE

Date of ref document: 19850425

ET Fr: translation filed
PLBE No opposition filed within time limit

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009261

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: NO OPPOSITION FILED WITHIN TIME LIMIT

26N No opposition filed
PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: FR

Payment date: 19890918

Year of fee payment: 9

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: SE

Payment date: 19890927

Year of fee payment: 9

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: AT

Payment date: 19890929

Year of fee payment: 9

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: GB

Payment date: 19890930

Year of fee payment: 9

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: BE

Payment date: 19891024

Year of fee payment: 9

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: NL

Payment date: 19891031

Year of fee payment: 9

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: DE

Payment date: 19891212

Year of fee payment: 9

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: CH

Payment date: 19891218

Year of fee payment: 9

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: GB

Effective date: 19901006

Ref country code: AT

Effective date: 19901006

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: SE

Effective date: 19901007

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: LI

Effective date: 19901031

Ref country code: CH

Effective date: 19901031

Ref country code: BE

Effective date: 19901031

BERE Be: lapsed

Owner name: HOECHST A.G.

Effective date: 19901031

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: NL

Effective date: 19910501

GBPC Gb: european patent ceased through non-payment of renewal fee
NLV4 Nl: lapsed or anulled due to non-payment of the annual fee
PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: FR

Effective date: 19910628

REG Reference to a national code

Ref country code: CH

Ref legal event code: PL

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: DE

Effective date: 19910702

REG Reference to a national code

Ref country code: FR

Ref legal event code: ST

EUG Se: european patent has lapsed

Ref document number: 81107960.7

Effective date: 19910603