JPS5885899A - アミラ−ゼインヒビタ−およびその製造法 - Google Patents
アミラ−ゼインヒビタ−およびその製造法Info
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- JPS5885899A JPS5885899A JP56182316A JP18231681A JPS5885899A JP S5885899 A JPS5885899 A JP S5885899A JP 56182316 A JP56182316 A JP 56182316A JP 18231681 A JP18231681 A JP 18231681A JP S5885899 A JPS5885899 A JP S5885899A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は新規なアミラーゼインヒビタートソの製造法
に関するものである。
に関するものである。
アミラーゼインヒビターには種々のものが知ら九でいる
が唾液内、来アばラーゼ′ｆｒ特異的に阻害し、膵臓由
来−ｙ ミラーゼを阻害しないものは知らｎていない。
が唾液内、来アばラーゼ′ｆｒ特異的に阻害し、膵臓由
来−ｙ ミラーゼを阻害しないものは知らｎていない。
本発明者らは小麦からこのような特異的な性質を有する
新規なアミラーゼインヒビターの単離に成功した。小麦
にアミラーゼインヒビターが存在することは知らｎてい
るが（Ｍ Ｄ、 ｄｄｏｎｎｅｔＬ ｅｔ ａム、
Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ−このアミラー
ゼインヒビターは唾液由来アミラーゼのほかに膵臓由来
アミラーゼをも阻害するものであった。本発明者らは精
製法を新たに工夫することによって前記の新規なアミラ
ーゼインヒビターの取得に成功し、こ扛に基いて本発明
を完成したものである。
新規なアミラーゼインヒビターの単離に成功した。小麦
にアミラーゼインヒビターが存在することは知らｎてい
るが（Ｍ Ｄ、 ｄｄｏｎｎｅｔＬ ｅｔ ａム、
Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ−このアミラー
ゼインヒビターは唾液由来アミラーゼのほかに膵臓由来
アミラーゼをも阻害するものであった。本発明者らは精
製法を新たに工夫することによって前記の新規なアミラ
ーゼインヒビターの取得に成功し、こ扛に基いて本発明
を完成したものである。
すなわち本発明は、膵臓由来アミラーゼに対する阻害率
が唾液由来アミラーゼに対する阻害率の０．１以下であ
ることによって特徴づけらｎたアミラーゼインヒビター
５ａｉｎと、小麦よりアミラーゼインヒビタ−５ａｉｎ
ｔ分離精製するにあたり、。
が唾液由来アミラーゼに対する阻害率の０．１以下であ
ることによって特徴づけらｎたアミラーゼインヒビター
５ａｉｎと、小麦よりアミラーゼインヒビタ−５ａｉｎ
ｔ分離精製するにあたり、。
その一工程にダイ・リガンド・アフィニティー・クロマ
トグラフィー（Ｄｙｅ Ｌｉｇａｎｄ Ａｆｆｉｎ
ｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｂ以下ＤＬＡＣ法
と略記する。）を用いることを特徴とするアミラーゼイ
ンヒビター５ａｉｎの製造法に関するものである。
トグラフィー（Ｄｙｅ Ｌｉｇａｎｄ Ａｆｆｉｎ
ｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｂ以下ＤＬＡＣ法
と略記する。）を用いることを特徴とするアミラーゼイ
ンヒビター５ａｉｎの製造法に関するものである。
アミラーゼインヒビター５ａｉｎは、例えば強力小麦粉
とかチューラム小麦粒から取得することができる。こ扛
らから分離するにあたって通常はまず水抽出する。抽出
方法としては、まず原料小麦に対し５〜２０倍量程度の
水を加え、３０分ないし２時間程度攪拌してから懸濁物
−ｆ濾過あるいは遠心分離すｎばよい。抽出の際に加温
してもよいが、小麦粒あるいは小麦粉から抽出する場合
にはデン粉がアルファー化しない程度に止めるのがよい
。
とかチューラム小麦粒から取得することができる。こ扛
らから分離するにあたって通常はまず水抽出する。抽出
方法としては、まず原料小麦に対し５〜２０倍量程度の
水を加え、３０分ないし２時間程度攪拌してから懸濁物
−ｆ濾過あるいは遠心分離すｎばよい。抽出の際に加温
してもよいが、小麦粒あるいは小麦粉から抽出する場合
にはデン粉がアルファー化しない程度に止めるのがよい
。
本発明の酵素阻害物質の製造法は小麦水抽出物から分離
精製する一工程としてＤＬＡＣ法を用いるところに特徴
がある。
精製する一工程としてＤＬＡＣ法を用いるところに特徴
がある。
ＤＬＡＣ法に用いる吸着剤には、ＯＨ基またはＮＨ２基
を有する担体に反応性染料を反応させ、この染料分子を
担体に固定したものを用いる。このような担体の例とし
ては、セファロース４Ｂ、同ＣＬ−６Ｂ（商品名、ファ
ルマシア社製品）、セファデックスａ−２００（商品名
、ファルマシア社製品）、セルロース、バイオグールー
Ｐ（商品名、バイオランド社製品）などを挙げることが
できる。っこｎらの担体が水に不溶性のものであること
はいうまでもない。
を有する担体に反応性染料を反応させ、この染料分子を
担体に固定したものを用いる。このような担体の例とし
ては、セファロース４Ｂ、同ＣＬ−６Ｂ（商品名、ファ
ルマシア社製品）、セファデックスａ−２００（商品名
、ファルマシア社製品）、セルロース、バイオグールー
Ｐ（商品名、バイオランド社製品）などを挙げることが
できる。っこｎらの担体が水に不溶性のものであること
はいうまでもない。
反応性染料は塩化シアヌル誘導体であって、その例とし
ては、リアクティブ・レッド、リアクティブ・ブルーな
どを挙げることができる。
ては、リアクティブ・レッド、リアクティブ・ブルーな
どを挙げることができる。
反応性染料を前記の担体に固定させるには、担体を水中
に分散させてアルカリ性にし、反応性染料を投入して加
温下でゆっくり攪拌すｎばよい。
に分散させてアルカリ性にし、反応性染料を投入して加
温下でゆっくり攪拌すｎばよい。
ソウスると、塩化シアヌル部分のクロライドと担体のＯ
Ｈ基およびＮＨ２基とが反応して反応性染料が担体に共
有結合する。反応性染料の添加量は担体等によって異な
るが、通常は膨潤した担体１００ｍｔにつき０．１〜１
２程度である。添加するアルカリは水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、炭酸すＩ−ＩＪウム等でよく、添加量
は担体を分散した液のＰＨ’ｅ９〜１１にする程度でよ
い。反応の際には、加温すると反応をはやく完結させる
ことができる。反応終了後は戸別して水、アセトン等で
数回洗浄する。
Ｈ基およびＮＨ２基とが反応して反応性染料が担体に共
有結合する。反応性染料の添加量は担体等によって異な
るが、通常は膨潤した担体１００ｍｔにつき０．１〜１
２程度である。添加するアルカリは水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、炭酸すＩ−ＩＪウム等でよく、添加量
は担体を分散した液のＰＨ’ｅ９〜１１にする程度でよ
い。反応の際には、加温すると反応をはやく完結させる
ことができる。反応終了後は戸別して水、アセトン等で
数回洗浄する。
このようにして得らｎた染料固定化物全吸着剤トシテア
ミラーゼインヒビタ−８ａｉｎｅ分離するには、染料固
定化物を充填したカラムにまずアミラーゼインヒビター
含有液を通液してインヒビターヲ吸着させ、続いて展開
剤を通液してインヒビ゛ター全展開溶離する。インヒビ
ターの吸着量は染料固定化物ＩＬ当り５〜１０７程度が
適当である。
ミラーゼインヒビタ−８ａｉｎｅ分離するには、染料固
定化物を充填したカラムにまずアミラーゼインヒビター
含有液を通液してインヒビターヲ吸着させ、続いて展開
剤を通液してインヒビ゛ター全展開溶離する。インヒビ
ターの吸着量は染料固定化物ＩＬ当り５〜１０７程度が
適当である。
展開剤としては、リン酸緩衝液−アセトングラジェント
、またはビロリン酸緩衝液−エタノール、メタノール、
アセトンなどの極性溶媒のグラジェントなどを用いるこ
とができる。この展開剤を通液し、カラムから流出して
くる液を例えば紫外線、吸収とかフォーリン・ローリ−
法で定量した蛋白濃度などを指標として分画し、アミラ
ーぜインヒｊＬ ビター区分を採夕する。゛展開溶離終了後はゲルを常法
によって再生して再使用する。
、またはビロリン酸緩衝液−エタノール、メタノール、
アセトンなどの極性溶媒のグラジェントなどを用いるこ
とができる。この展開剤を通液し、カラムから流出して
くる液を例えば紫外線、吸収とかフォーリン・ローリ−
法で定量した蛋白濃度などを指標として分画し、アミラ
ーぜインヒｊＬ ビター区分を採夕する。゛展開溶離終了後はゲルを常法
によって再生して再使用する。
反応性染料は補酵素と構造が似ておシ、この反応性染料
の固定化物を用いて酵素をＤＬＡＣ法で精製しうること
は知らｎているが、アミラーゼインヒビターの如き酵素
インヒビターを精製しうろことは全く知らｎていない。
の固定化物を用いて酵素をＤＬＡＣ法で精製しうること
は知らｎているが、アミラーゼインヒビターの如き酵素
インヒビターを精製しうろことは全く知らｎていない。
本発明者らは、ＤＬＡＣ法が酵素インヒビターの精製に
有効であることを初めて見出したのであり、ＤＬＡＣ法
は他の酵素インヒビターの精製にも使用することができ
る。
有効であることを初めて見出したのであり、ＤＬＡＣ法
は他の酵素インヒビターの精製にも使用することができ
る。
アミラーゼインヒビター５ａｉｎ”ｔ−分離取得するに
あたってはＤＬＡＣ法のみでなく、他の精製方法も併用
してもよい。他の精製法としては、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過法、アルコール分画法、硫安分画
法、透析など蛋白質を精製する一般的な手法を広く用い
ることができる。
あたってはＤＬＡＣ法のみでなく、他の精製方法も併用
してもよい。他の精製法としては、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過法、アルコール分画法、硫安分画
法、透析など蛋白質を精製する一般的な手法を広く用い
ることができる。
アミラーゼインヒビター５ａｉｎはＤＬＡＣ法で精製す
ることによって他のアミラーゼインヒビターと相互分離
することができ、不純物の大部分を淘汰することができ
る。そして例えば、小麦の水抽出物’ｅＤＬＡＣ法で二
段に処理するか、あるいはＤＬＡＣ法で１回処理後イオ
ン交換クロマトグラフィーで精製することによってアミ
ラーゼインヒビター５ａｉｎの純品を得ることができる
。
ることによって他のアミラーゼインヒビターと相互分離
することができ、不純物の大部分を淘汰することができ
る。そして例えば、小麦の水抽出物’ｅＤＬＡＣ法で二
段に処理するか、あるいはＤＬＡＣ法で１回処理後イオ
ン交換クロマトグラフィーで精製することによってアミ
ラーゼインヒビター５ａｉｎの純品を得ることができる
。
次ニ、実施例で得らｎたアミラーゼインヒビター５ａｉ
ｎの理化学的性質を次に示す。
ｎの理化学的性質を次に示す。
（１） 分子量
セファデックスＧ−１００に用いたゲル濾過法で測定し
た分子量は２３，０００〜２４，０００であった。一方
、ドデシル硫酸ナトリウムおよびポリアクリルアミドゲ
ルを用いて電気泳動法で測定した分子量が１１，０００
〜１３，０００であったので本発明のアミラーゼインヒ
ビターは二量体であると考えらｎる。
た分子量は２３，０００〜２４，０００であった。一方
、ドデシル硫酸ナトリウムおよびポリアクリルアミドゲ
ルを用いて電気泳動法で測定した分子量が１１，０００
〜１３，０００であったので本発明のアミラーゼインヒ
ビターは二量体であると考えらｎる。
（２）紫外線吸収スペクトル
アミラーゼインヒビター５ａｉｎの０．２２％水溶液の
紫外線吸収スペクトルを測定した結果を第１図に示す。
紫外線吸収スペクトルを測定した結果を第１図に示す。
（３）赤外線吸収スペクトル
ＫＢｒ 錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルを第
２図に示す。
２図に示す。
（４）等電点
バイオライト（Ｂｉ ｏ Ｌ’ｊ ｔ ｅ＋商品名、
Ｂｉ。
Ｂｉ。
Ｒａｄ 社製）を用いて測定したアだラーゼイイヒビ
ター５ａｉｎの等電点は５，０であった。
ター５ａｉｎの等電点は５，０であった。
（５）糖含量
フェノール−硫酸法で測定した糖含量は、ｔｒａ ｃ
ｅであった。
ｅであった。
（６）’７＜ラーゼに対する阻害作用
アミラーゼＤＳテスト（ベックマン社）で唾液由来アミ
ラーゼ（四角印）および膵臓由来アミラーゼ（三角印）
に対するアミラーゼインヒビター５ａｉｎの阻害作用を
測定した結果を第３図に示す。尚、図の横軸はアミラー
ゼインヒビターの濃度を、そして縦軸は阻害率を表わし
ている。このほか、ブルースターチ法（ファルマシア社
）でも阻害率を測定したが、やはり第３図と同様、本発
明のアミラーゼインヒビターは唾液由来アミラーゼを特
異的に阻害することが認めらｎた。
ラーゼ（四角印）および膵臓由来アミラーゼ（三角印）
に対するアミラーゼインヒビター５ａｉｎの阻害作用を
測定した結果を第３図に示す。尚、図の横軸はアミラー
ゼインヒビターの濃度を、そして縦軸は阻害率を表わし
ている。このほか、ブルースターチ法（ファルマシア社
）でも阻害率を測定したが、やはり第３図と同様、本発
明のアミラーゼインヒビターは唾液由来アミラーゼを特
異的に阻害することが認めらｎた。
（７）阻害型式
フ／Ｌ、 −スターｆ （商品名、ファルマシア社製）
を基質として阻害型式を測定したところ第４図に示すよ
うな結果が得らｎた。図から明らかな如く、本発明のア
ミラーゼインヒビターは非競合阻害型（Ｎｏ ｎ−Ｃｏ
ｍｐ ｅ ｔ ｉ ｔ ｉ ｙｅ）である。また、阻害
定数（Ｋｉ ）は８，４×１０ ’Ｍ であった。な
お、図の縦軸はしへ（酵素活性）であり、横軸は１／ｓ
（基質濃度）で示しである。そして、丸印はアミラーゼ
インヒビターがある場合を、四角印はない場合をそｎ−
ｅｎａわしている。用いた酵素は唾液インヒビター水溶
液を３７℃で３０分間加熱し、その後、唾液由来アミラ
ーゼに対する阻害率を測定した結果を第５図に示す。
を基質として阻害型式を測定したところ第４図に示すよ
うな結果が得らｎた。図から明らかな如く、本発明のア
ミラーゼインヒビターは非競合阻害型（Ｎｏ ｎ−Ｃｏ
ｍｐ ｅ ｔ ｉ ｔ ｉ ｙｅ）である。また、阻害
定数（Ｋｉ ）は８，４×１０ ’Ｍ であった。な
お、図の縦軸はしへ（酵素活性）であり、横軸は１／ｓ
（基質濃度）で示しである。そして、丸印はアミラーゼ
インヒビターがある場合を、四角印はない場合をそｎ−
ｅｎａわしている。用いた酵素は唾液インヒビター水溶
液を３７℃で３０分間加熱し、その後、唾液由来アミラ
ーゼに対する阻害率を測定した結果を第５図に示す。
（９）温度安定性
Ｐ Ｈ７，０に調整した３ ８ｔｔ９／ｍｔのアミラー
ゼインヒビター水溶液を各温度で３０分間加熱し、その
後唾液由来アミラーゼに対する阻害率を測定した結果を
第６図に示す。
ゼインヒビター水溶液を各温度で３０分間加熱し、その
後唾液由来アミラーゼに対する阻害率を測定した結果を
第６図に示す。
このような理化学的性質を従来のアミラーゼインヒビタ
ーと比較すると、従来のものには唾液由来アミラーゼを
阻害しかつ膵臓由来アミラーゼを阻害しないものが見出
さｎないところから、本発明のアミラーゼインヒビター
は従来のものと基本的に相違する。例えば、小麦由来の
アミラーゼインヒビターについて言及すれば、公知のも
のはいず汎も膵臓由来アミラーゼを阻害する点で本発明
のアミラーゼインヒビターと′相違するが、そのほか分
子量も公知のものは１３．ＯＯＯ〜２０，０００である
点でも本発明品と相違する。そこで、本廃明のアミラー
ゼインヒビターは新規なものであると認定するにいたシ
、アミラーゼインヒビター５ａｉｎと命名した。
ーと比較すると、従来のものには唾液由来アミラーゼを
阻害しかつ膵臓由来アミラーゼを阻害しないものが見出
さｎないところから、本発明のアミラーゼインヒビター
は従来のものと基本的に相違する。例えば、小麦由来の
アミラーゼインヒビターについて言及すれば、公知のも
のはいず汎も膵臓由来アミラーゼを阻害する点で本発明
のアミラーゼインヒビターと′相違するが、そのほか分
子量も公知のものは１３．ＯＯＯ〜２０，０００である
点でも本発明品と相違する。そこで、本廃明のアミラー
ゼインヒビターは新規なものであると認定するにいたシ
、アミラーゼインヒビター５ａｉｎと命名した。
本発明のアミラーゼインヒビターは唾液アミラーゼを特
異的に阻害するところから、医学分野、臨床検査分野に
おいてアミラーゼのアインザイム測定に威力を発揮する
ものであり、従来多大な労力を要していた電気泳動法な
どに代わりつるものである。
異的に阻害するところから、医学分野、臨床検査分野に
おいてアミラーゼのアインザイム測定に威力を発揮する
ものであり、従来多大な労力を要していた電気泳動法な
どに代わりつるものである。
アミラーゼ活性の測定方法およびアミラーゼ阻害活性の
測定方法を次に示す。
測定方法を次に示す。
アミラーゼ活性の測定方法
アミラーゼ溶液１００μｔにブルースターチ（ファルマ
シア社製）１錠を加えて３７℃で１５分間反応させ、６
２０ ｎｍにおける吸光度を測定して求めた。なお、ア
ミラーゼ活性は国際単位で表示した。
シア社製）１錠を加えて３７℃で１５分間反応させ、６
２０ ｎｍにおける吸光度を測定して求めた。なお、ア
ミラーゼ活性は国際単位で表示した。
アミラーゼ阻害活性の測定法
アミラーゼ溶液としてヒト血清または尿を用い、この１
００μｔにアミラーゼインヒビター溶液を１００μｔを
加えて３７℃で５分間反応さす、ブルースターチ（ファ
ルマシア社製）１錠’に加えて３７℃で１５分間反応さ
せ、６２０ｎｍにおける吸光度を測定して求めた。なお
、唾液由来のアミラーゼの５０％を阻害する活性をアミ
ラーゼ阻害活性の１単位とした。
００μｔにアミラーゼインヒビター溶液を１００μｔを
加えて３７℃で５分間反応さす、ブルースターチ（ファ
ルマシア社製）１錠’に加えて３７℃で１５分間反応さ
せ、６２０ｎｍにおける吸光度を測定して求めた。なお
、唾液由来のアミラーゼの５０％を阻害する活性をアミ
ラーゼ阻害活性の１単位とした。
ＤＬＡＣ法の吸着剤の製造例
セファロース４Ｂ（商品名、ファルマシア社製）１００
ｍｔ’ｉ水２００ｍｔに懸濁させ、この懸濁液に炭酸ナ
トリウム４ｇを加えてアルカリ性にした。
ｍｔ’ｉ水２００ｍｔに懸濁させ、この懸濁液に炭酸ナ
トリウム４ｇを加えてアルカリ性にした。
続いてリアクティブΦレッド（ングマ社製）１９を加え
、４０℃で４０時間反応させた。反応終了後、懸濁物を
濾過し、水５００ｍｔで１０回、つづいてアセトン５０
０ｒｎｔで２回洗浄し、赤色のりアクティブ・レッド固
定化物を得た。得らｎた固定化物を４℃に保、存してお
いたところ数カ月間以上安定であった。
、４０℃で４０時間反応させた。反応終了後、懸濁物を
濾過し、水５００ｍｔで１０回、つづいてアセトン５０
０ｒｎｔで２回洗浄し、赤色のりアクティブ・レッド固
定化物を得た。得らｎた固定化物を４℃に保、存してお
いたところ数カ月間以上安定であった。
実施例 １゜
市販強力小麦粉（日清製粉（株）製） １ｏｏｏｙに８
倍容の水を加えて室温で１時間攪拌した。小麦粉’ｋＰ
別し、少量の水で洗浄して粗抽出液６ｔを得た。
倍容の水を加えて室温で１時間攪拌した。小麦粉’ｋＰ
別し、少量の水で洗浄して粗抽出液６ｔを得た。
この粗抽出液に硫安３ＫＰ’ｅ添加して溶解し、１時間
室温に放置して生じた沈澱物を遠心沈降法で分別した。
室温に放置して生じた沈澱物を遠心沈降法で分別した。
沈澱物蒸溜水に対して一昼夜透析し、残留物を凍結乾燥
した。
した。
前記の製造例′Ｃ得たりアクティブレッド固定化物１２
０ｍｔをカラムに充填し、そこへ、凍結乾燥物１ノをＰ
Ｈ６，０の１０ｍＭリン酸緩衝液１００ｍｔに溶解し
た液を上方から通液し、つづいて、Ｐ Ｈ６，０の１０
ｍＭリン酸緩衝液をスタートとしてその緩衝液の溶媒の
アセトン濃度をＯから４０％（ｖ／ｖ）まで連続的に変
化させた展開液を通液し、カラムからの流出液ｆ９ｍｌ
づつフラクションコレクターで分取した。各フラクシ
ョンの唾液由来アミラーゼおよび膵臓由来アミラーゼに
対する阻害活性を測定踵唾液由来アミラーゼを特異的に
阻害する活性区分を集めた。
０ｍｔをカラムに充填し、そこへ、凍結乾燥物１ノをＰ
Ｈ６，０の１０ｍＭリン酸緩衝液１００ｍｔに溶解し
た液を上方から通液し、つづいて、Ｐ Ｈ６，０の１０
ｍＭリン酸緩衝液をスタートとしてその緩衝液の溶媒の
アセトン濃度をＯから４０％（ｖ／ｖ）まで連続的に変
化させた展開液を通液し、カラムからの流出液ｆ９ｍｌ
づつフラクションコレクターで分取した。各フラクシ
ョンの唾液由来アミラーゼおよび膵臓由来アミラーゼに
対する阻害活性を測定踵唾液由来アミラーゼを特異的に
阻害する活性区分を集めた。
この唾液アミラーゼ阻害活性区分を半透膜に入れて水に
対して一昼夜透析し、残留物を１／１０になるまで濃縮
した。濃縮物を希釈し、この液を塩基性陰イオン交換側
１１ＷＤＥ−５２（ワットマン社製）２０ｍｔｔ−充填
したカラムに３ｍｔ／ｈｒで通液した。カラムからの流
出液を２．１ ｍＡづつフラクションコレクターで分取
して各フラクションの２ ｆ３０ ｎｍにおける紫外線
吸収を測定し、紫外線吸収のちるフラクションについて
は、さらにアミラーゼ阻害活性を測定してアミラーゼ阻
害活性区分を集めた。このアミラーゼ阻害活性区分を半
透膜に入ｎて一昼夜蒸溜水に対して透析し、残留物を凍
結乾燥したところ０．１２の白色粉末が得られた。この
白色粉末を前述の理化学的性質の測定に供した。
対して一昼夜透析し、残留物を１／１０になるまで濃縮
した。濃縮物を希釈し、この液を塩基性陰イオン交換側
１１ＷＤＥ−５２（ワットマン社製）２０ｍｔｔ−充填
したカラムに３ｍｔ／ｈｒで通液した。カラムからの流
出液を２．１ ｍＡづつフラクションコレクターで分取
して各フラクションの２ ｆ３０ ｎｍにおける紫外線
吸収を測定し、紫外線吸収のちるフラクションについて
は、さらにアミラーゼ阻害活性を測定してアミラーゼ阻
害活性区分を集めた。このアミラーゼ阻害活性区分を半
透膜に入ｎて一昼夜蒸溜水に対して透析し、残留物を凍
結乾燥したところ０．１２の白色粉末が得られた。この
白色粉末を前述の理化学的性質の測定に供した。
実施例 ２
デユーラム小麦粒（イースタンマリーナ社製ＡＡＤ）１
０００Ｐ’ｌｒ、イオン交換クロマトグラフィー’１Ｄ
ＬＡｃ法で代替したほかは実施例１と同様に処理して０
．１１９の白色乾燥粉末を得た。この白色粉末について
、アミラーゼ阻害活性、分子量、秀＝＝［１挾紫外線吸
収スペクトルおよび等電点を測定し、この白色粉末品は
実質的・に実施例１と同一のアミラーゼインヒビターで
あることを確認した。
０００Ｐ’ｌｒ、イオン交換クロマトグラフィー’１Ｄ
ＬＡｃ法で代替したほかは実施例１と同様に処理して０
．１１９の白色乾燥粉末を得た。この白色粉末について
、アミラーゼ阻害活性、分子量、秀＝＝［１挾紫外線吸
収スペクトルおよび等電点を測定し、この白色粉末品は
実質的・に実施例１と同一のアミラーゼインヒビターで
あることを確認した。
第１図は実施例１で得らｎた本発明のアミラーゼインヒ
ビターの紫外線吸収スペクトルであり、第２図はその赤
外線吸収スペクトルである。第３図は唾液由来アミラー
ゼおよび膵臓由来アミラーゼに対する阻害作用を示すも
のであり、第４図は阻害型式を測定した結果を示すもの
である。また、第５図はＰＨ安定性をそして第６図は温
度安定性をそｎそｎ測定した結果を示している。 特 許 出 願 人 富士臓器製薬株式会社代理人
弁理士 田中政浩 第１図 ＋ｉ長 ｎｍ 第６図 ０４０ ６０ ８０ １００１度（
’Ｃ） 手続補正書（自発） 昭和５８年２月９日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 ■事件の表示 特願昭５６−１８２３１６号 ２発明の名称 アミラーゼインヒビターおよびその製造法３輛正をする
者 事件との関係 特許出願人 名称 富士臓器製薬株式会社 ４代理人 居所 〒１０４東京都中央区京橋二丁目１番３号６補正
の内容 （１） 明細書を以下の通シに補正する。 １） ２頁４行 ｒ Ｏ’ｄｏｎ Ｊ ｒＯ’Ｄ
ｏｎ Ｊ３頁ｌＯ行 「小麦粒あるいは」 削
除１２頁１５行 「沈澱物蒸」 「沈澱物を
蒸」１４頁５行 「小麦粒」 「小麦粉」１１）第８
頁第１１〜１７行に記載された全文を以下の通シに補正
する。 ［象を第３図に示す。また、基質にブルースターチ（フ
ァルマシア社製）を用いてこれらのアミラーゼに対する
阻害作用を測定した結果を第７図に、マルトテトラオー
スを用いて測定した結果を第８図に、そして、ｐ−ニト
ロフェニルマルトへブタオサイドを用いて測定した結果
を第９図に、それぞれ示す。これらの図における四角印
はいずれも唾液由来アミラーゼを、そして三角印は膵臓
由来アミラーゼをそれぞれ表わしている。 １１１）第９頁の下から第２行と最下行の間に次の記載
を加入する。 １− （１０）アミノ酸組成 ６Ｎ塩酸を用い１１０℃で２２時間加水分解して測定し
たアミノ酸組成を次に示す。 Ｔｙｒ１７ Ｌｅｕ ６ １１ｅ ４Ｍ
ｅｔ １０ Ｖａｌ ２４ Ａｌ
ａ２４Ｇｌｙ ２２ Ｐｒｏ １１ Ｇｌ
ｕ ２２Ｓｅｒ１２ Ｔｈｒ ６ Ａｓ
ｐ１７Ａｒｇ ９ Ｈｉｓ ２ Ｌｙ
ｓ ９Ｐｈｅ ５ １／２Ｃｙｓ１４
Ｊｉｖ） 第１６頁下から第２行の「である。」の
後に次の記載を加入する。 ［アミラーゼのアイソザイムを種々の濃度で含む人尿に
ついて、実、流側１で得られたアミラーゼインヒビター
５ａｉｎを用いて測定した結果と、従来の電気泳動法で
測定した結果の相関関係を第１Ｏ図に示す。図から明ら
１．、かな如く、本発明のアミラーゼインヒビターを用
いた方法で得られた結果は従来法とよい相関関係を示し
た。」 ■）第１４頁下から第３行の「図は唾液由来」を次のよ
うに訂正する。 「図及び第７〜９図は各種基質を用いて測定した本発明
のアミラーゼインヒビターの唾液由来」ｖｉ） 第１
４頁下から第２行の「作用を示す」を「作用をそれぞれ
示す」と訂正する。 ｖＨ） 第１５頁第２行の後に次の記載を加入するＯ
ｒ第１０図は本発明のアミラーゼインヒビターを用いた
方法で得られたアミラーゼアイソザイム濃度と従来の電
気泳動法で得られたアミラーゼアイソザイム濃度の相関
関係を示すものである〇（２）添付別紙のとおりの第７
〜ｌＯ図を加入する。 以上 第７図 第８図 １′／ピビ？ −；ＪＬＬ ｔ ｍａミル第９図 ４〉ヒビ？ ３１Ｌ Ｌ （ｆｎｌＭＬ ｌ第１０図 アミラーゼインヒビ９−（υ／Ｌ）
ビターの紫外線吸収スペクトルであり、第２図はその赤
外線吸収スペクトルである。第３図は唾液由来アミラー
ゼおよび膵臓由来アミラーゼに対する阻害作用を示すも
のであり、第４図は阻害型式を測定した結果を示すもの
である。また、第５図はＰＨ安定性をそして第６図は温
度安定性をそｎそｎ測定した結果を示している。 特 許 出 願 人 富士臓器製薬株式会社代理人
弁理士 田中政浩 第１図 ＋ｉ長 ｎｍ 第６図 ０４０ ６０ ８０ １００１度（
’Ｃ） 手続補正書（自発） 昭和５８年２月９日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 ■事件の表示 特願昭５６−１８２３１６号 ２発明の名称 アミラーゼインヒビターおよびその製造法３輛正をする
者 事件との関係 特許出願人 名称 富士臓器製薬株式会社 ４代理人 居所 〒１０４東京都中央区京橋二丁目１番３号６補正
の内容 （１） 明細書を以下の通シに補正する。 １） ２頁４行 ｒ Ｏ’ｄｏｎ Ｊ ｒＯ’Ｄ
ｏｎ Ｊ３頁ｌＯ行 「小麦粒あるいは」 削
除１２頁１５行 「沈澱物蒸」 「沈澱物を
蒸」１４頁５行 「小麦粒」 「小麦粉」１１）第８
頁第１１〜１７行に記載された全文を以下の通シに補正
する。 ［象を第３図に示す。また、基質にブルースターチ（フ
ァルマシア社製）を用いてこれらのアミラーゼに対する
阻害作用を測定した結果を第７図に、マルトテトラオー
スを用いて測定した結果を第８図に、そして、ｐ−ニト
ロフェニルマルトへブタオサイドを用いて測定した結果
を第９図に、それぞれ示す。これらの図における四角印
はいずれも唾液由来アミラーゼを、そして三角印は膵臓
由来アミラーゼをそれぞれ表わしている。 １１１）第９頁の下から第２行と最下行の間に次の記載
を加入する。 １− （１０）アミノ酸組成 ６Ｎ塩酸を用い１１０℃で２２時間加水分解して測定し
たアミノ酸組成を次に示す。 Ｔｙｒ１７ Ｌｅｕ ６ １１ｅ ４Ｍ
ｅｔ １０ Ｖａｌ ２４ Ａｌ
ａ２４Ｇｌｙ ２２ Ｐｒｏ １１ Ｇｌ
ｕ ２２Ｓｅｒ１２ Ｔｈｒ ６ Ａｓ
ｐ１７Ａｒｇ ９ Ｈｉｓ ２ Ｌｙ
ｓ ９Ｐｈｅ ５ １／２Ｃｙｓ１４
Ｊｉｖ） 第１６頁下から第２行の「である。」の
後に次の記載を加入する。 ［アミラーゼのアイソザイムを種々の濃度で含む人尿に
ついて、実、流側１で得られたアミラーゼインヒビター
５ａｉｎを用いて測定した結果と、従来の電気泳動法で
測定した結果の相関関係を第１Ｏ図に示す。図から明ら
１．、かな如く、本発明のアミラーゼインヒビターを用
いた方法で得られた結果は従来法とよい相関関係を示し
た。」 ■）第１４頁下から第３行の「図は唾液由来」を次のよ
うに訂正する。 「図及び第７〜９図は各種基質を用いて測定した本発明
のアミラーゼインヒビターの唾液由来」ｖｉ） 第１
４頁下から第２行の「作用を示す」を「作用をそれぞれ
示す」と訂正する。 ｖＨ） 第１５頁第２行の後に次の記載を加入するＯ
ｒ第１０図は本発明のアミラーゼインヒビターを用いた
方法で得られたアミラーゼアイソザイム濃度と従来の電
気泳動法で得られたアミラーゼアイソザイム濃度の相関
関係を示すものである〇（２）添付別紙のとおりの第７
〜ｌＯ図を加入する。 以上 第７図 第８図 １′／ピビ？ −；ＪＬＬ ｔ ｍａミル第９図 ４〉ヒビ？ ３１Ｌ Ｌ （ｆｎｌＭＬ ｌ第１０図 アミラーゼインヒビ９−（υ／Ｌ）
Claims (2)
- （１） 膵臓由来アミラーゼに対する阻害率が唾液由
来′アミラーゼに対する阻害率の０．１以下であること
によって特徴づけらｆｉたアミラーゼインヒビター５ａ
ｉｎｎ - （２）小麦よシアミラーゼインヒビター５ａｉｎを分離
精製するにあたり、その一工程にグイ・リガンド・アフ
ィニティー・クロマトグラフィーを用いること全特徴と
するアミラーゼインヒビター５ａｉｎの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56182316A JPS5885899A (ja) | 1981-11-16 | 1981-11-16 | アミラ−ゼインヒビタ−およびその製造法 |
| US06/428,918 US4634763A (en) | 1981-11-16 | 1982-09-30 | Amylase inhibitor and preparation and use thereof |
| EP82306077A EP0079793B1 (en) | 1981-11-16 | 1982-11-15 | Amylase inhibitor and preparation thereof |
| DE8282306077T DE3273231D1 (en) | 1981-11-16 | 1982-11-15 | Amylase inhibitor and preparation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56182316A JPS5885899A (ja) | 1981-11-16 | 1981-11-16 | アミラ−ゼインヒビタ−およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5885899A true JPS5885899A (ja) | 1983-05-23 |
| JPS6111593B2 JPS6111593B2 (ja) | 1986-04-03 |
Family
ID=16116170
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56182316A Granted JPS5885899A (ja) | 1981-11-16 | 1981-11-16 | アミラ−ゼインヒビタ−およびその製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4634763A (ja) |
| EP (1) | EP0079793B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5885899A (ja) |
| DE (1) | DE3273231D1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58174332A (ja) * | 1982-04-08 | 1983-10-13 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | 新規なα−アミラ−ゼ阻害物質 |
| JPS604132A (ja) * | 1983-06-21 | 1985-01-10 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | 新規なα−アミラ−ゼ阻害物質 |
| US11109137B2 (en) | 2017-04-04 | 2021-08-31 | Sony Corporation | Headphone |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3404876A1 (de) * | 1984-02-11 | 1985-09-05 | Gödecke AG, 1000 Berlin | Verfahren zur verbesserung der selektiven aktivitaetshemmung von humaner pankreas- und speichelamylase sowie eine hierfuer geeignete inhibitorzubereitung |
| DE3525926A1 (de) * | 1985-07-19 | 1987-01-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung von pankreas-alpha-amylase |
| US4910297A (en) * | 1987-06-29 | 1990-03-20 | Abi Biotechnology Inc. | Alpha-amylase inhibitor |
| IT1258938B (it) * | 1992-06-15 | 1996-03-08 | Sclavo Spa | Metodo per la determinazione di profili isoenzimatici in automazione ed apparecchiatura per l'applicazione di detto metodo |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3950319A (en) * | 1970-01-29 | 1976-04-13 | Farbenfabriken Bayer Aktiengesellschaft | Amylase inhibitor from wheat gluten using alcohol |
| US3944537A (en) * | 1974-11-26 | 1976-03-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Preparation of alpha-amylase inhibitor |
| DE2701890C2 (de) * | 1977-01-19 | 1983-08-04 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Peptielischer Glycosidhydrolase-Inhibitor aus einem Streptomyceten und seine Verwendung |
| JPS5910193B2 (ja) * | 1980-06-04 | 1984-03-07 | 富士レビオ株式会社 | アミラ−ゼ阻害物質ａｉ−ｂの製造法 |
| ES505959A0 (es) * | 1980-10-09 | 1982-09-01 | Hoechst Ag | Procedimiento para la preparacion de un inactivador de alfa-amilasa |
| US4444760A (en) * | 1983-06-17 | 1984-04-24 | Merck & Co., Inc. | Purification and characterization of a protein fibroblast growth factor |
-
1981
- 1981-11-16 JP JP56182316A patent/JPS5885899A/ja active Granted
-
1982
- 1982-09-30 US US06/428,918 patent/US4634763A/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-11-15 EP EP82306077A patent/EP0079793B1/en not_active Expired
- 1982-11-15 DE DE8282306077T patent/DE3273231D1/de not_active Expired
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58174332A (ja) * | 1982-04-08 | 1983-10-13 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | 新規なα−アミラ−ゼ阻害物質 |
| JPH0354119B2 (ja) * | 1982-04-08 | 1991-08-19 | ||
| JPS604132A (ja) * | 1983-06-21 | 1985-01-10 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | 新規なα−アミラ−ゼ阻害物質 |
| JPH0427997B2 (ja) * | 1983-06-21 | 1992-05-13 | Nitsushin Seifun Kk | |
| US11109137B2 (en) | 2017-04-04 | 2021-08-31 | Sony Corporation | Headphone |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0079793A3 (en) | 1984-02-01 |
| EP0079793B1 (en) | 1986-09-10 |
| JPS6111593B2 (ja) | 1986-04-03 |
| DE3273231D1 (en) | 1986-10-16 |
| EP0079793A2 (en) | 1983-05-25 |
| US4634763A (en) | 1987-01-06 |
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