JPH0354119B2 - - Google Patents
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- JPH0354119B2 JPH0354119B2 JP57057374A JP5737482A JPH0354119B2 JP H0354119 B2 JPH0354119 B2 JP H0354119B2 JP 57057374 A JP57057374 A JP 57057374A JP 5737482 A JP5737482 A JP 5737482A JP H0354119 B2 JPH0354119 B2 JP H0354119B2
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Description
本発明は、小麦種子ないしは小麦粉からの新規
なα−アミラーゼ阻害物質（以下場合により
「WAI−53」という）およびその製法ならびに本
物質を用いた体液中のα−アミラーゼアイソザイ
ムの分別定量に関する。 α−アミラーゼは各種生物に広く存在する加水
分解酵素でヒトに関して云えば主として唾液腺お
よび膵臓から由来し、その動態は各種疾病特に膵
炎、耳下腺炎、肝疾患、ある種の癌等の病態によ
り健康時と比較して大きく変動することが知られ
ている。従つてこれらの病態を正しく診断するた
めには、総アミラーゼ活性定量だけでなく、唾液
腺および膵臓由来のα−アミラーゼアイソザイム
の正確な逐次的動向を把握することが望まれてい
る。 従来臨床検査の場でヒトのα−アミラーゼアイ
ソザイムの分別定量には電気泳動法が用いられて
いるが、この方法は非常に煩瑣であり迅速に検体
を処理する方法としては難点が多く、更に結果の
判定には熟練を要し、容易な方法とは云い難い。
この問題点の解決として小麦粉由来のアミラーゼ
阻害物質を用いての分析方法がオドンネル氏らに
よつて研究されてきたが、いまだ満足するもので
なく実用的でなかつた〔J.Clin.Chem.23，560〜
566（1977）参照〕。 本発明者らは、上記従来の欠点にかんがみて鋭
意研究の結果本発明を完成した。 本発明は、小麦粉を給源するとα−アミラーゼ
阻害物質（WAI−53）であり、小麦種子または
小麦粉中の水溶性区分よりの抽出液を少くともエ
タノール沈殿処理、加熱処理、アニオン交換クロ
マト処理、ゲル過クロマト処理およびカチオン
交換クロマト処理の工程により精製してなる新規
なα−アミラーゼ阻害物質（WAI−53）の製法
であり、そしてまたα−アミラーゼ阻害物質
（WAI−53）を用いてなるヒト体液中のα−アミ
ラーゼの分別定量方法を提供するものである。 本発明による新規なα−アミラーゼ阻害物質を
うるための原料となる小麦種子または小麦粉は硬
質小麦、内地小麦、軟質小麦、デユラム小麦ない
しはそれらより由来する強力小麦粉、中力小麦
粉、薄力小麦粉の種類および等級を問わない。含
有量の差異こそあれすべての小麦の胚乳部分には
所望のα−アミラーゼ阻害物質が含まれている。 本発明のα−アミラーゼ阻害物質（WAI−53）
の取得方法としては次の工程によつて行なえる。 原料としての小麦または小麦粉を原料に対し３
〜10倍量の水好ましくは精製水で１〜５時間室温
において撹拌してWAI−53物質の抽出を行なう。
所定の時間撹拌した後、例えば遠心分離、傾瀉、
過等の適宜な操作で上澄みを採取する。この上
澄みは真空または常圧下での加熱により処理され
る。通常約50°〜70℃において10分ないし１時間
の加熱が行なわれる。70℃で30分の加熱が好まし
い。所望によつてはこの加熱処理された液を再び
遠心分離、傾瀉または過等の操作に付して上澄
みを採取する。 ここで加熱処理された抽出液（またはその上澄
み）を水性アセトン、エタノールまたはメタノー
ルのような含水有機溶媒〔濃度40〜70％（ｖ／
ｖ）〕で処理して生成する沈殿物を除去し、得ら
れた残留液に更に上記溶媒を加えて溶媒濃度90％
（ｖ／ｖ）とし且つその混合物を低温（０〜10℃）
に放置して沈殿を形成させ、そして得られた沈殿
を採取し且つ精製水に溶解させる。次いで得られ
た溶液をPH6.5〜8.5のトリス塩酸緩衝液（イオン
濃度0.005〜0.5）で平衡にしたDEAEセルロース、
DEAEセフアデツクス、DEAEセフアロースのよ
うなアニオン系イオン交換体カラムに通して吸着
せしめる。溶出はPH7.0〜7.8においてNaClで塩濃
度を増大せしめたトリス塩酸緩衝液で行なう。溶
出物をセフアデツクス、バイオゲルまたはウルト
ロゲル、好ましくはセフアデツクスＧ−75を担体
として使用してゲル過クロマトグラフにかけ
る、過速度のおそい部分（分子量20000〜
30000）をとる。その後、得られる生成物を所望
によつてはCM−セフアロース、CM−セフアデ
ツクス等のイオン交換体による処理を行い、次い
で凍結乾燥して目的物をうる。 このようにして得られたWAI−53物質の理化
学的性状は次のとおりである。 １） 水または希薄塩（塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、硫酸アンモニウム、燐酸カリウム、燐
酸ナトリウム）溶液に可溶、メタノール、エタ
ノール、アセトン、クロロホルムおよびヘキサ
ンに不溶である。 ２） 紫外吸収Ｅ279 １％＝12.8（水溶液中１cm） λnax279nm ３） 分子量 超遠心法により23000〜23800 ゲル過法により24000 ４） Oath氏等の方法によるSDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動〔Cereal Chemistry50，
190〜７（1973）参照〕においては分子量13000
の単一のバンドを与える。 ５） サブユニツト解離剤であるグアニジン塩酸
塩溶液の存在下で超遠心分離しそして沈降平衡
法により計算すると分子量12600である。 ６） 岩永氏等の方法〔蛋白・核酸・酵素15，
1037〜54（1970）参照〕によりＮ−末端を分析
するとセリンのみが得られる。 ７） Davis氏等の方法によるポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動〔Annals New York
Academy of Science121，404（1964）参照〕
における泳動度は0.53に単一バンドを示す。 ８） 6M尿素溶液中で２−メルカプトエタノー
ルで還元し次いでモノヨード酢酸でカルボキシ
メチル化したものの電気泳動（Davis氏等の方
法に準じ水の代りに6M尿素溶液を使用）では
泳動度0.60の単一バンドを与えること、 ９） 本物質は蛋白質であり、そのアミノ酸組成
分析結果は
なα−アミラーゼ阻害物質（以下場合により
「WAI−53」という）およびその製法ならびに本
物質を用いた体液中のα−アミラーゼアイソザイ
ムの分別定量に関する。 α−アミラーゼは各種生物に広く存在する加水
分解酵素でヒトに関して云えば主として唾液腺お
よび膵臓から由来し、その動態は各種疾病特に膵
炎、耳下腺炎、肝疾患、ある種の癌等の病態によ
り健康時と比較して大きく変動することが知られ
ている。従つてこれらの病態を正しく診断するた
めには、総アミラーゼ活性定量だけでなく、唾液
腺および膵臓由来のα−アミラーゼアイソザイム
の正確な逐次的動向を把握することが望まれてい
る。 従来臨床検査の場でヒトのα−アミラーゼアイ
ソザイムの分別定量には電気泳動法が用いられて
いるが、この方法は非常に煩瑣であり迅速に検体
を処理する方法としては難点が多く、更に結果の
判定には熟練を要し、容易な方法とは云い難い。
この問題点の解決として小麦粉由来のアミラーゼ
阻害物質を用いての分析方法がオドンネル氏らに
よつて研究されてきたが、いまだ満足するもので
なく実用的でなかつた〔J.Clin.Chem.23，560〜
566（1977）参照〕。 本発明者らは、上記従来の欠点にかんがみて鋭
意研究の結果本発明を完成した。 本発明は、小麦粉を給源するとα−アミラーゼ
阻害物質（WAI−53）であり、小麦種子または
小麦粉中の水溶性区分よりの抽出液を少くともエ
タノール沈殿処理、加熱処理、アニオン交換クロ
マト処理、ゲル過クロマト処理およびカチオン
交換クロマト処理の工程により精製してなる新規
なα−アミラーゼ阻害物質（WAI−53）の製法
であり、そしてまたα−アミラーゼ阻害物質
（WAI−53）を用いてなるヒト体液中のα−アミ
ラーゼの分別定量方法を提供するものである。 本発明による新規なα−アミラーゼ阻害物質を
うるための原料となる小麦種子または小麦粉は硬
質小麦、内地小麦、軟質小麦、デユラム小麦ない
しはそれらより由来する強力小麦粉、中力小麦
粉、薄力小麦粉の種類および等級を問わない。含
有量の差異こそあれすべての小麦の胚乳部分には
所望のα−アミラーゼ阻害物質が含まれている。 本発明のα−アミラーゼ阻害物質（WAI−53）
の取得方法としては次の工程によつて行なえる。 原料としての小麦または小麦粉を原料に対し３
〜10倍量の水好ましくは精製水で１〜５時間室温
において撹拌してWAI−53物質の抽出を行なう。
所定の時間撹拌した後、例えば遠心分離、傾瀉、
過等の適宜な操作で上澄みを採取する。この上
澄みは真空または常圧下での加熱により処理され
る。通常約50°〜70℃において10分ないし１時間
の加熱が行なわれる。70℃で30分の加熱が好まし
い。所望によつてはこの加熱処理された液を再び
遠心分離、傾瀉または過等の操作に付して上澄
みを採取する。 ここで加熱処理された抽出液（またはその上澄
み）を水性アセトン、エタノールまたはメタノー
ルのような含水有機溶媒〔濃度40〜70％（ｖ／
ｖ）〕で処理して生成する沈殿物を除去し、得ら
れた残留液に更に上記溶媒を加えて溶媒濃度90％
（ｖ／ｖ）とし且つその混合物を低温（０〜10℃）
に放置して沈殿を形成させ、そして得られた沈殿
を採取し且つ精製水に溶解させる。次いで得られ
た溶液をPH6.5〜8.5のトリス塩酸緩衝液（イオン
濃度0.005〜0.5）で平衡にしたDEAEセルロース、
DEAEセフアデツクス、DEAEセフアロースのよ
うなアニオン系イオン交換体カラムに通して吸着
せしめる。溶出はPH7.0〜7.8においてNaClで塩濃
度を増大せしめたトリス塩酸緩衝液で行なう。溶
出物をセフアデツクス、バイオゲルまたはウルト
ロゲル、好ましくはセフアデツクスＧ−75を担体
として使用してゲル過クロマトグラフにかけ
る、過速度のおそい部分（分子量20000〜
30000）をとる。その後、得られる生成物を所望
によつてはCM−セフアロース、CM−セフアデ
ツクス等のイオン交換体による処理を行い、次い
で凍結乾燥して目的物をうる。 このようにして得られたWAI−53物質の理化
学的性状は次のとおりである。 １） 水または希薄塩（塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、硫酸アンモニウム、燐酸カリウム、燐
酸ナトリウム）溶液に可溶、メタノール、エタ
ノール、アセトン、クロロホルムおよびヘキサ
ンに不溶である。 ２） 紫外吸収Ｅ279 １％＝12.8（水溶液中１cm） λnax279nm ３） 分子量 超遠心法により23000〜23800 ゲル過法により24000 ４） Oath氏等の方法によるSDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動〔Cereal Chemistry50，
190〜７（1973）参照〕においては分子量13000
の単一のバンドを与える。 ５） サブユニツト解離剤であるグアニジン塩酸
塩溶液の存在下で超遠心分離しそして沈降平衡
法により計算すると分子量12600である。 ６） 岩永氏等の方法〔蛋白・核酸・酵素15，
1037〜54（1970）参照〕によりＮ−末端を分析
するとセリンのみが得られる。 ７） Davis氏等の方法によるポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動〔Annals New York
Academy of Science121，404（1964）参照〕
における泳動度は0.53に単一バンドを示す。 ８） 6M尿素溶液中で２−メルカプトエタノー
ルで還元し次いでモノヨード酢酸でカルボキシ
メチル化したものの電気泳動（Davis氏等の方
法に準じ水の代りに6M尿素溶液を使用）では
泳動度0.60の単一バンドを与えること、 ９） 本物質は蛋白質であり、そのアミノ酸組成
分析結果は
【表】
である。
10） ヒト唾液腺および膵臓各アミラーゼとの本
物質の飽和曲線はそれぞれを50％阻害する本物
質の所要量比が１：250以上であることを示す
（第１図参照）。 上記のとおり本発明のα−アミラーゼ阻害物質
は分子量ならびに電気泳動において特異な性状を
有する新規な蛋白質である。 本発明のα−アミラーゼ阻害物質（WAI−53）
はヒトの唾液腺α−アミラーゼに対して極めて特
異性に阻害作用を示し、一方ヒトの膵臓α−アミ
ラーゼに対する阻害作用は極めて微弱である。更
に本発明の物質は広域な酵素濃度範囲で唾液腺型
α−アミラーゼおよび膵臓型α−アミラーゼアイ
ソザイムに対する阻害比が大きな値をとりうるの
でヒトの体液をはじめとした各種臨床検体のα−
アミラーゼアイソザイムの分別定量のための優れ
た手段となりうるものである。 既にオドンネル氏等は、小麦粉中にヒトの唾液
腺型α−アミラーゼを膵臓型のそれよりも強く阻
害するα−アミラーゼ阻害物質を報告し、この物
質を利用した臨床検体中のα−アミラーゼアイソ
ザイムの分別定量の可能性を示している。
〔Clinical Chemistry23，560〜566（1977）〕。しか
しながらオドンネル氏等の報告したα−アミラー
ゼ阻害物質はその電気泳動の易動度において、本
物質が0.53であるのに対して0.20であり、著るし
く相違している。また両α−アミラーゼアイソザ
イムに対する阻害比が本発明の物質に比してオド
ンネル氏等のものは極度に狭く分別定量に好適と
は云えない。すなわち、オドンネル氏等のα−ア
ミラーゼ阻害物質の両アミラーゼアイソザイムに
対する50％阻害比が高々100に過ぎないのに対し
本物質は200〜300の高い阻害比をとりうる。一例
を示せば第１図から明らかになるように15IUの
唾液腺型α−アミラーゼを50％阻害する本物質の
必要量は約0.3μgであるのに対して15IUのヒト膵
液α−アミラーゼを50％阻害するためには本発明
のα−アミラーゼ阻害物質約70〜80μgを必要と
した。更にヒトの唾液腺型および膵臓型のα−ア
ミラーゼの存在量比を変動させた検体に本発明の
物質を作用させた場合、定量されうるα−アミラ
ーゼ実測値は膵臓型α−アミラーゼの存在量と極
めて高い相関々係をとりうることが判明した。従
つて本発明のα−アミラーゼ阻害物質はアミラー
ゼ分別定量に際して極めて有効かつ簡便な方法を
提供する。 以下に本発明のα−アミラーゼ阻害物質の製造
および使用方法を実施例により詳述する。 実施例 １ 小麦粉３Kgに精製水９を加えて１時間ゆるや
かに撹拌し、そして遠心分離により上清７を得
た。得られた上清を500mlに濃縮しそしてこの溶
液を70℃において30分加熱処理した。生成した不
溶物を遠心分離により除去した。得られた透明な
上澄み液に最終濃度が60％（ｖ／ｖ）になるよう
に無水エタノールを加えそして生成した不溶物を
遠心分離により除去した。得られた透明な液に更
に濃度が90％（ｖ／ｖ）になるように無水エタノ
ールを加え一晩放置して沈殿を形成させた。生成
した沈殿物を遠心分離によつて採取し、99％エタ
ノールで２回洗浄し、そして室温で減圧乾燥し
た。かくして23ｇの粗α−アミラーゼ阻害物質を
得た。 次いで0.02Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）に上
記粗乾固物を10％濃度で溶解させ8.5の樹脂量
を含むDEAE−セフアロースカラムに通塔してα
−アミラーゼ阻害物質を吸着させた。次にこのカ
ラムを最初0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH7.1）17
で洗浄し続いて同じ緩衝液中に0.0Mから0.2M
の塩化ナトリウムを連続勾配で含む溶液で活性物
質の溶出を行ない10.2の溶出液を得た。この溶
液を減圧濃縮して75mlのα−アミラーゼ阻害物質
を含む液を得た。この液を0.05Mアセテート緩衝
液（PH5.0）を用いてセフアデツクスＧ−75のゲ
ル過クロマトグラフイーを行ない414mlの活性
区分を含む溶液を得た。更に続いてこの液をCM
−セフアロースに通し、最初に1.5の0.05M酢
酸緩衝液（PH5.0）で洗浄し、次いで同じ緩衝液
に0.0Mより0.3Mの塩化ナトリウムを連続勾配で
含む溶液で活性画分を溶出した。得られた活性画
分531mlを減圧濃縮した。得られた濃縮液をセフ
アデツクスＧ−25ゲル過クロマトで脱塩した後
609mlの蛋白含有溶出液を得た。得られた溶液を
凍結乾燥して20mgの乾固物を得た。このものは先
の理化学的性状に示すとおり分子量ならびに電気
泳動において特異な性状を有する新規なα−アミ
ラーゼ阻害物質（WAI−53）であつた。得られ
たα−アミラーゼ阻害物質（WAI−53）のヒト
唾液α−アミラーゼおよびヒト膵液α−アミラー
ゼに対する50％阻害量比は約250：１であつた。
また阻害活性は150AIU／mg蛋白であつた。 実施例 ２ 実施例１で得られたα−アミラーゼ阻害物質
（WAI−53）１mgを10mMの塩化ナトリウムを含
む10mMのトリス塩酸緩衝液（PH8.0）10mlに溶
解した（試験Ａ）。一方精製したヒト唾液腺型α
−アミラーゼ（Ｓ−AMY）と、ヒト膵液から精
製したヒト膵臓型α−アミラーゼ（Ｐ−AMY）
を、それぞれ50mMの塩化ナトリウムおよび
0.5mMの塩化カルシウムおよび５％の牛血清ア
ルブミン（フラクシヨンＶ）を含む50mMの燐酸
緩衝液（PH7.0）によりそれぞれ100μ／に稀釈
した。次いでＰ−AMYとＳ−AMYを第１表に
示す種々の割合で混合して30μの検体を調製し
た。
物質の飽和曲線はそれぞれを50％阻害する本物
質の所要量比が１：250以上であることを示す
（第１図参照）。 上記のとおり本発明のα−アミラーゼ阻害物質
は分子量ならびに電気泳動において特異な性状を
有する新規な蛋白質である。 本発明のα−アミラーゼ阻害物質（WAI−53）
はヒトの唾液腺α−アミラーゼに対して極めて特
異性に阻害作用を示し、一方ヒトの膵臓α−アミ
ラーゼに対する阻害作用は極めて微弱である。更
に本発明の物質は広域な酵素濃度範囲で唾液腺型
α−アミラーゼおよび膵臓型α−アミラーゼアイ
ソザイムに対する阻害比が大きな値をとりうるの
でヒトの体液をはじめとした各種臨床検体のα−
アミラーゼアイソザイムの分別定量のための優れ
た手段となりうるものである。 既にオドンネル氏等は、小麦粉中にヒトの唾液
腺型α−アミラーゼを膵臓型のそれよりも強く阻
害するα−アミラーゼ阻害物質を報告し、この物
質を利用した臨床検体中のα−アミラーゼアイソ
ザイムの分別定量の可能性を示している。
〔Clinical Chemistry23，560〜566（1977）〕。しか
しながらオドンネル氏等の報告したα−アミラー
ゼ阻害物質はその電気泳動の易動度において、本
物質が0.53であるのに対して0.20であり、著るし
く相違している。また両α−アミラーゼアイソザ
イムに対する阻害比が本発明の物質に比してオド
ンネル氏等のものは極度に狭く分別定量に好適と
は云えない。すなわち、オドンネル氏等のα−ア
ミラーゼ阻害物質の両アミラーゼアイソザイムに
対する50％阻害比が高々100に過ぎないのに対し
本物質は200〜300の高い阻害比をとりうる。一例
を示せば第１図から明らかになるように15IUの
唾液腺型α−アミラーゼを50％阻害する本物質の
必要量は約0.3μgであるのに対して15IUのヒト膵
液α−アミラーゼを50％阻害するためには本発明
のα−アミラーゼ阻害物質約70〜80μgを必要と
した。更にヒトの唾液腺型および膵臓型のα−ア
ミラーゼの存在量比を変動させた検体に本発明の
物質を作用させた場合、定量されうるα−アミラ
ーゼ実測値は膵臓型α−アミラーゼの存在量と極
めて高い相関々係をとりうることが判明した。従
つて本発明のα−アミラーゼ阻害物質はアミラー
ゼ分別定量に際して極めて有効かつ簡便な方法を
提供する。 以下に本発明のα−アミラーゼ阻害物質の製造
および使用方法を実施例により詳述する。 実施例 １ 小麦粉３Kgに精製水９を加えて１時間ゆるや
かに撹拌し、そして遠心分離により上清７を得
た。得られた上清を500mlに濃縮しそしてこの溶
液を70℃において30分加熱処理した。生成した不
溶物を遠心分離により除去した。得られた透明な
上澄み液に最終濃度が60％（ｖ／ｖ）になるよう
に無水エタノールを加えそして生成した不溶物を
遠心分離により除去した。得られた透明な液に更
に濃度が90％（ｖ／ｖ）になるように無水エタノ
ールを加え一晩放置して沈殿を形成させた。生成
した沈殿物を遠心分離によつて採取し、99％エタ
ノールで２回洗浄し、そして室温で減圧乾燥し
た。かくして23ｇの粗α−アミラーゼ阻害物質を
得た。 次いで0.02Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）に上
記粗乾固物を10％濃度で溶解させ8.5の樹脂量
を含むDEAE−セフアロースカラムに通塔してα
−アミラーゼ阻害物質を吸着させた。次にこのカ
ラムを最初0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH7.1）17
で洗浄し続いて同じ緩衝液中に0.0Mから0.2M
の塩化ナトリウムを連続勾配で含む溶液で活性物
質の溶出を行ない10.2の溶出液を得た。この溶
液を減圧濃縮して75mlのα−アミラーゼ阻害物質
を含む液を得た。この液を0.05Mアセテート緩衝
液（PH5.0）を用いてセフアデツクスＧ−75のゲ
ル過クロマトグラフイーを行ない414mlの活性
区分を含む溶液を得た。更に続いてこの液をCM
−セフアロースに通し、最初に1.5の0.05M酢
酸緩衝液（PH5.0）で洗浄し、次いで同じ緩衝液
に0.0Mより0.3Mの塩化ナトリウムを連続勾配で
含む溶液で活性画分を溶出した。得られた活性画
分531mlを減圧濃縮した。得られた濃縮液をセフ
アデツクスＧ−25ゲル過クロマトで脱塩した後
609mlの蛋白含有溶出液を得た。得られた溶液を
凍結乾燥して20mgの乾固物を得た。このものは先
の理化学的性状に示すとおり分子量ならびに電気
泳動において特異な性状を有する新規なα−アミ
ラーゼ阻害物質（WAI−53）であつた。得られ
たα−アミラーゼ阻害物質（WAI−53）のヒト
唾液α−アミラーゼおよびヒト膵液α−アミラー
ゼに対する50％阻害量比は約250：１であつた。
また阻害活性は150AIU／mg蛋白であつた。 実施例 ２ 実施例１で得られたα−アミラーゼ阻害物質
（WAI−53）１mgを10mMの塩化ナトリウムを含
む10mMのトリス塩酸緩衝液（PH8.0）10mlに溶
解した（試験Ａ）。一方精製したヒト唾液腺型α
−アミラーゼ（Ｓ−AMY）と、ヒト膵液から精
製したヒト膵臓型α−アミラーゼ（Ｐ−AMY）
を、それぞれ50mMの塩化ナトリウムおよび
0.5mMの塩化カルシウムおよび５％の牛血清ア
ルブミン（フラクシヨンＶ）を含む50mMの燐酸
緩衝液（PH7.0）によりそれぞれ100μ／に稀釈
した。次いでＰ−AMYとＳ−AMYを第１表に
示す種々の割合で混合して30μの検体を調製し
た。
【表】
混合した検体No.１〜９の各30μに10μの試
液Ａを添加混合しこれを室温で30分間保温した
（予備反応）。次いで自動分析機（アボツト社製型
式ABA−100）により酵素法〔第１化学(株)製アミ
ラーゼ測定キツト〕でα−アミラーゼ活性を測定
した。なお対照として試験Ａの代りに精製水10μ
を添加混合したもののα−アミラーゼ活性を測
定した。これからＰ−AMYおよびＳ−AMY両
方のα−アミラーゼアイソザイムの分別定量のた
めの検量線を得た（第２図参照）。 ここで得られた検量線を用いて人血清中のα−
アミラーゼアイソザイムの分別定量を行なう。下
記に示す11例の人血清各30μについて試液Ａを
10μずつ添加混合しそして室温で30分間予備反
応させる。これを前記と同様の測定法でα−アミ
ラーゼ活性を測定する。また対照として11例の人
血清30μについて精製水各10μを添加混合し、
そしてそれらのα−アミラーゼ活性を測定する。
その結果は第２表のとおりである。
液Ａを添加混合しこれを室温で30分間保温した
（予備反応）。次いで自動分析機（アボツト社製型
式ABA−100）により酵素法〔第１化学(株)製アミ
ラーゼ測定キツト〕でα−アミラーゼ活性を測定
した。なお対照として試験Ａの代りに精製水10μ
を添加混合したもののα−アミラーゼ活性を測
定した。これからＰ−AMYおよびＳ−AMY両
方のα−アミラーゼアイソザイムの分別定量のた
めの検量線を得た（第２図参照）。 ここで得られた検量線を用いて人血清中のα−
アミラーゼアイソザイムの分別定量を行なう。下
記に示す11例の人血清各30μについて試液Ａを
10μずつ添加混合しそして室温で30分間予備反
応させる。これを前記と同様の測定法でα−アミ
ラーゼ活性を測定する。また対照として11例の人
血清30μについて精製水各10μを添加混合し、
そしてそれらのα−アミラーゼ活性を測定する。
その結果は第２表のとおりである。
【表】
【表】
本発明のα−アミラーゼ阻害物質を用いたα−
アミラーゼの分別定量法では電気泳動法〔「臨床
化学」第５巻第118頁（1976）〕に比べて簡易な操
作で迅速にα−アミラーゼの分別定量ができた。
アミラーゼの分別定量法では電気泳動法〔「臨床
化学」第５巻第118頁（1976）〕に比べて簡易な操
作で迅速にα−アミラーゼの分別定量ができた。
第１図は唾液α−アミラーゼおよび膵臓α−ア
ミラーゼに対する本発明によるWAI−53物質の
阻害曲線であり、そして第２図は本発明によるα
−アミラーゼの分別定量のための膵臓のアミラー
ゼ検量曲線である。
ミラーゼに対する本発明によるWAI−53物質の
阻害曲線であり、そして第２図は本発明によるα
−アミラーゼの分別定量のための膵臓のアミラー
ゼ検量曲線である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性状すなわち (1) 水または希薄塩溶液に可溶、メタノール、エ
タノール、アセトン、クロロホルムおよびヘキ
サンに不溶であること、 (2) 紫外吸収Ｅ279 １％＝12.8（水溶液中１cm） λnax279nm (3) 分子量 超遠心法により23000〜23800 ゲル過法により24000 (4) Oath氏等の方法によるSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動においては分子量13000の単
一のバンドを与えること、 (5) サブユニツト解離剤であるグアニジン塩酸塩
溶液の存在下で超遠心分離しそして沈降平衡法
により計算すると分子量12600であること、 (6) 岩永氏等の方法によりＮ−末端を分析すると
セリンのみが得られること、 (7) Davis氏等の方法によるポリアクリルアミド
ゲル電気泳動における泳動度は0.53に単一バン
ドを示すこと、 (8) 6M尿素溶液中で２−メルカプトエタノール
で還元し次いでモノヨード酢酸でカルボキシメ
チル化したものの電気泳動（Davis氏等の方法
に準じ水の代りに6M尿素溶液を使用）では泳
動度0.60の単一バンドを与えること、 (9) 本物質は蛋白質であり、そのアミノ酸組成分
析結果は 【表】 【表】 トリプトフアン ＋ 定量せず
であること、そして (10) ヒト唾液腺および膵臓各アミラーゼとの
WAI−53物質の飽和曲線はそれぞれを50％阻
害するWAI−53物質の所要量比が１：250以上
であること を特徴とする、小麦由来の新規なα−アミラーゼ
阻害物質。 ２ 下記の理化学的性状すなわち (1) 水または希薄塩溶液に可溶、メタノール、エ
タノール、アセトン、クロロホルムおよびヘキ
サンに不溶であること、 (2) 紫外吸収Ｅ279 １％＝12.8（水溶液中１cm） λnax279nm (3) 分子量 超遠心法により23000〜23800 ゲル過法により24000 (4) Oath氏等の方法によるSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動においては分子量13000の単
一のバンドを与えること、 (5) サブユニツト解離剤であるグアニジン塩酸塩
溶液の存在下で超遠心分離しそして沈降平衡法
により計算すると分子量12600であること、 (6) 岩永氏等の方法によりＮ−末端を分析すると
セリンのみが得られること、 (7) Davis氏等の方法によるポリアクリルアミド
ゲル電気泳動における泳動度は0.53に単一バン
ドを示すこと、 (8) 6M尿素溶液中で２−メルカプトエタノール
で還元し次いでモノヨード酢酸でカルボキシメ
チル化したものの電気泳動（Davis氏等の方法
に準じ水の代りに6M尿素溶液を使用）では泳
動度0.60の単一バンドを与えること、 (9) 本物質は蛋白質であり、そのアミノ酸組成分
析結果は 【表】 【表】 であること、そして (10) ヒト唾液腺および膵臓各アミラーゼとの
WAI−53物質の飽和曲線はそれぞれを50％阻
害するWAI−53物質の所要量比が１：250以上
であること を有する小麦由来のα−アミラーゼ阻害物質を活
性成分とすることを特徴とする、α−アミラーゼ
アイソザイムの分別定量試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5737482A JPS58174332A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 新規なα−アミラ−ゼ阻害物質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5737482A JPS58174332A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 新規なα−アミラ−ゼ阻害物質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58174332A JPS58174332A (ja) | 1983-10-13 |
| JPH0354119B2 true JPH0354119B2 (ja) | 1991-08-19 |
Family
ID=13053813
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5737482A Granted JPS58174332A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 新規なα−アミラ−ゼ阻害物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58174332A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57140727A (en) * | 1981-02-10 | 1982-08-31 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | Novel alpha-amylase inhibitor substance |
| JPS5885899A (ja) * | 1981-11-16 | 1983-05-23 | Fujirebio Inc | アミラ−ゼインヒビタ−およびその製造法 |
-
1982
- 1982-04-08 JP JP5737482A patent/JPS58174332A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57140727A (en) * | 1981-02-10 | 1982-08-31 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | Novel alpha-amylase inhibitor substance |
| JPS5885899A (ja) * | 1981-11-16 | 1983-05-23 | Fujirebio Inc | アミラ−ゼインヒビタ−およびその製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58174332A (ja) | 1983-10-13 |
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