JPH0297386A - １ｙｓ―プラスミノーゲンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、少なくとも１７，５力セイン分解単位／Ｍ！
７タンパクおよび少な（とも５０　ｍｙｍｏｌｅ／ｇタ
ンパク窒素の非活性並ひに少なくとも９０％の電気泳動
的純度を有するｌｙｓ−プラスミノーゲンの製造方法で
あって、血漿、プラスミノーゲン含有フラクションまた
は組織培養からのプラスミノーゲンを、精製のために固
定化リシンに吸着させ、溶離し、タンパク沈澱剤によっ
て溶出液から回収することからなる製造方法に関するも
のである。

ｙｓ−プラスミノーゲンは、天然のプラスミノーケン（
＝ｇｌｕ−プラスミノーゲン）のタンパク分解的に修飾
された形態を表すために文献中で使用される一般名であ
り、Ｎ　Ｉ−＋　２末端からポリペプチドを切断するこ
とによって、天然のプラスミノーゲンから得られる。こ
れまで、現在知られている種類の１ｙｓ−プラスミノー
ゲンのＮ−末端アミノ酸として、リシン、メチオニンお
よびバリンか検出されている。文献では、それぞれの分
子量として、ｇｌｕ−プラスミノーゲンについては９０
．０００から９４．．０００の値、１ｙｓ−プラスミノ
ーゲンについては約８０，０００の値か示されている。

線維素溶解活性については、ｌｙｓ−プラスミノーゲン
は、主として２つの点でｇｌｕ−プラスミノーゲンと異
なっている。即ぢ、ｌｙｓ−プラスミノーゲンは、トロ
ンビンのフィブリン網に対してより高い結合親和性を有
し、はるかに速くプラスミンへと活性化され得る（例え
ばウロキナーゼによって）。これらの両特性は、線維素
溶解の効率を高め、血栓症の治療においてｌｙｓ−プラ
スミノーケンを使用するのが好ましいという理由となる
。

ｌｙｓ−プラスミノーゲンの回収のための出発物質は、
血漿のコーン（Ｃｏｈｎ）　ＩＩＩフラクンヨンまたは
血漿それ自体である。文献に記載されている方法は、抽
出、吸着および沈澱工程の様な複数の工程からなる。Ｎ
−末端ポリペプチド鎖の切断およびｌｙｓ−プラスミノ
ーゲンへの変換は、単離したｇｌｕ−プラスミノーゲン
に対して直接性われるか、または存在するタンパク分解
活性のための単離および精製工程の途中で起こる。

ウォーレンおよびワイマン（Ｐ、Ｗａｌｌｅｎ　ａｎｄ
　ＢＷｉｍａｎ、　　Ｂ　ｉｏｃｈｉｍ、　Ｂ　１ｏｐ
ｈｙｓ、　Ａ　ｃｔａλλ↓、２０３０（１，９７０）
）は、洗浄したコーン■沈澱を抽出し、抽出物をｐＨ４
゜８にてメタノールと硫酸アンモニウムで沈澱させるこ
とによって、プラスミノーゲンを単離した。この生成物
は、プラスミン汚染のために、０５〜１９％の自発性タ
ンパク分解活性を有している。アプロチニンの添加後、
ゲル濾過および陰イオン交換体吸着／溶離によって更に
精製すると、Ｎ−末端アミノ酸として主にグルタミンを
示し、０１から０３％の自発性タンパク分解活性を有す
るプラスミノーゲンか得られる。アプロチニンを添加せ
ずに行うと、４％の自発性タンパク分解活性を有し、Ｎ
−末端アミノ酸としてリシン、バリン、更にメチオニン
およびグルタミンを有する生成物の混合物か得られる。

ツノクリおよびキュエンテラｌ□　（Ｅ、　Ｅ、　Ｒ１
ｃｋｌｉａｎｄ　Ｐ、　Ａ、　Ｃｕｅｎｄｅｔ、　　Ｂ
　ｉｏｃｈｉｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ａ　ｃｔａス
且０．４．４．７−４．５１．（］　９７　］乃は、ポ
リアクリルアミドケルにリシンを固定化し、このゲルを
使用して血漿からプラスミノーゲンを単離した。

リン酸バッファーで洗浄後、０．５モル／ρの６アミ／
カプロン酸を含有しているバッファーて溶離する。硫酸
アンモニウムを加えて溶出液からプラスミノーゲンを沈
澱さぜ、沈澱を溶解し、ＮａＣ（２−１−リス−リシン
またはホスフ：ｒ、　　Ｉ・ＮａＣρバッファーに対し
て透析する。Ｎ−末端アミノ酸としてグルタミンのみか
検出される。

コールン等（Ｄ、ＧｏｌｌｅｎｅＬａｌ、　　Ｔｈｒｏ
ｍｂ、Ｒｅｓ。

７．５１．５−５２９（１，９７５乃はまた、アプロチ
ニンを添加するかまたは添加しないで、リンンアカロー
スアフィニティークロマトグラフィーによる、血漿また
はコーンＩＩＩ沈澱からのプラスミノーゲンの製造を記
載している。その結果、アプロチニンを加えた場合、純
粋なｇｌｕ−プラスミノーゲンか血漿から回収され、ア
プロチニンを加えなかった場合、生成物は、Ｎ−末端ア
ミノ酸としてｌｙｓおよびｖａｔを有する微量のタンパ
クを含有する。アプロチニンを添加しないで、コーンＩ
Ｉｌ沈澱から、０１〜１％の自発性タンパク分解活性（
存在するプラスミンによって誘発される）を有する生成
物か単離された。コーン■沈澱］　ｋｇ当たり２５，０
００〜５０，０ＯＯＫＩＵアプロチニン、および洗液お
よび溶離液に５ＫＩＵ／ｍρアプロチニンを加える場合
、自発性タンパク分解活性は０１％以下であり、ｇｌｕ
−および１ｙＳ−プラスミノーゲンの分離は、ＤＥＡＥ
セファテックスＡ−５０イオン交換クロマトグラフィー
によって行なわれた。

クレイズ等（Ｈ，Ｃ１ａｅｙｓ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｔ
ｈｒｏｍｂ、　Ｒｅ５３．５１５−５２３（１，９７３
）および１３ｉ０ｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、
　　３４．２．　３５１　（］　９７４））は、ｌ　Ｑ
　Ｋ　Ｉ　Ｕアプロチニフフｍρを含有しているリン酸
バッファー（０６１モル／ρ、ｐｒ−ｒ７．４）を用い
、コーン■沈澱からプラスミノーゲンを抽出した。リシ
ンアガロースに吸着させ、リン酸バッファーで洗浄した
後、６−アミンカプロン酸（０２モル１０．）およびア
プロチニン（２０Ｋ　Ｉ　Ｕ／靜）を含有するバッファ
ーで溶離する。この様にして単離したプラスミノーゲン
は、約０４％の自発性タンパク分解活性を有し、Ｎ−末
端アミノ酸として、ｇｌｕおよびｌｙｓ以外に微量のｖ
ａｌおよびｍｅｔを含有していた。同様の方法によって
血漿を処理すると、Ｎ−末端アミノ酸としてｇｌｕのみ
が検出され、自発性タンパク分解活性は０１％以下であ
る。ケル濾過（セファテックスＧ１５０）およびイオン
交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−セファデックス　
Ａ−５０）によって更に精製を行う。更に精製する前に
アプロチニン（４００ＫＩＵ／πρ）を加えると、目的
生成物は、出発物質としてコーン■沈澱を使用しても単
離され、この目的生成物は０１％以下の自発性タンパク
分解活性を示し、Ｎ−末端アミノ酸としてｇｌｕを示す
。ｇｌｕ−プラスミノーゲンからｌｙｓプラスミノーゲ
ンへの変換は、著者により、プラスミン（プラスミノー
ゲン／プラスミン　２００１〜２０・３）と−緒に３７
℃でインキュへ−１・することによって行なわれ、トリ
クロロ酢酸またはアプロチニンの添加によって終止され
る。

これらの方法には全て、不都合な点かある。なぜなら、
これらは、例えばケル濾過の様な工程を含むので１ｙｓ
−プラスミノーゲンの大量の単離に適当てないか、また
はこれらは室温で行なわれなければならないので医蘂製
剤の細菌汚染の危険性を含むからである。更に、これら
の方法は通常、プラスミンを含有する製剤を与え、従っ
て、高割合の自発性タンパク分解活性を有する。このこ
とは、製剤を適用するに当たり、凝集系の前酵素に影響
し、前酵素を破壊することがあり、その結果、望ましく
ない副作用を起こすので、治療的観点から全く望ましく
ないことである。このタンパク分解活性は阻害し得るが
、不活性なコンプレックスを形成して、得られた製剤を
汚染する結果となる。

本発明は、これらの不利益を避けることを目的とし、少
なくとも１７５カゼイン分解単位／ｍｇタンパクおよび
少なくとも５０　ｍｙｍｏｌｅプラスミノーゲン／ｇ窒
ケン比活性並ひに少なくとも９０％の電気泳動的純度を
有するｌｙｓ−プラスミノーゲンの製造であって、血漿
、プラスミノーゲン含有フラクションまたは組織培養か
らのプラスミノーゲンを、精製のために固定化リシンに
吸着させ、溶離し、タンパク沈澱剤によって溶出液から
回収することからなる製造を目的とするものである。

本発明によると、この目的は、この様にして精製したプ
ラスミノーゲンの溶液を、プラスミノーゲンからｌｙｓ
−プラスミノーゲンへの酵素的タンパク分解による変換
を誘導するために、色素生成基質であるＨ−Ｄ−バリル
−し−ロイシル−しりシン−ｐ−ニトロアニリド・二塩
酸塩に対してＯ，ＯＯ５〜０．２ｍｙｍｏｌｅｓ／ｉｉ
！　ｍｉｎ、好ましくは０．０１　〜０　、　］　ｍｙ
ｍｏｌｅｓ／　ｍＱ、　ｍｉｎの範囲のプラスミン活性
に調節し、＋１℃〜＋２０’Ｃ１好ましくは」−４℃〜
＋１２℃の温度で６〜６０時間、好ましくは１５〜５０
時間維持腰次いて酵素作用を遮断し、ｌｙｓ−プラスミ
ノーゲンを単離することによって達成される。

本発明によると、プラスミンの活性を調節するために、
セリンプロテアーセ類からなる群の血漿酵素を使用する
ことかできる。これらは、プラスミンおよびプラスミン
様酵素を包含する。００］　〜Ｏ、］　ｍｙｍｏｌｅ／
ｘｃ　ｍｉｎのプラスミン活性は、３０．０００：］〜
３，０００：］のプラスミノーゲン／プラスミン比に相
当する。このことから、ｇＵ−プラスミノーゲンからｌ
ｙｓ−プラスミノーゲンへのタンパク分解的変換は、驚
くほと少量の酵素で行なわれるということかわかる。

プラスミノーゲンに対するプラスミンの作用は、阻害剤
の添加によって遮断するのか好ましい。

本発明の方法は更に、酵素作用を遮断するための少量の
阻害剤を、非常に少量の血漿酵素の使用により処理する
。例えば１０〜２００ＫＩＵ／ｚρアプロチニンまたは
０．０１〜１．、ＯＵ／ｍρＣρエステラーゼ阻害剤の
添加によって、基質、５２２５１に対して０　、０３　
ｍｙｍｏｌｅ／　ｍＱ以下またはそれと同等まで活性を
低下することができる。この値は、濾過、凍結乾燥、お
よび所望により、存在することもある細菌またはウィル
スの不活化のための熱処理の様な処理工程の間、生成物
の安定性を保証するのに十分である。

プラスミンの作用を制限するために、アルファ２−マク
ログロブリンまたはアルファ２−抗プラスミンの様なそ
の他の阻害剤を使用することもできる。

本発明方法の好ましい態様は、透析を行う間にプラスミ
ノーゲンにプラスミンを作用させることである。

血漿または血漿産物から、少なくとも１７．５カゼイン
分解単位／ｍｇタンパクおよび少なくとも５０ナノモル
プラスミノーケン／ｍｇ窒素の比活性並ひに少なくとも
９０％の電気泳動的純度を有する熱安定性１ｙｓ−プラ
スミノーゲンを製造するための本発明方法のとりわけ好
ましい変法は、以下の工程 ａ）０．］　〜１００ＫＩＵ７プｏｆ＝ン／１１（Ｑ緩
衝溶液の存在下、リン酸緩衝液によってコーンフラクン
ヨンＩＩＩ（沈澱）を抽出して、粗製プラスミノーゲン
フラクンヨンを得、 ｂ）この粗製プラスミノーゲンフラクンヨンをエタノー
ルで処理して、抽出物から非プラスミノーゲンタンパク
の大部分を沈澱させてこれを除去し、 Ｃ）固定化リシンに吸着させ、次いで溶離することによ
り、エタノール溶液からプラスミノーゲンを分離し、 ｄ）硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコール（
Ｐ　Ｅ　Ｇ）によって」二の精製プラスミノーゲンを沈
澱さぜ、この沈澱を遠心し、 ｅ）沈澱を溶解し、この溶液をプラスミンの存在下で透
析しくここで、溶液は、色素生成基質である５２２５］
に対して０．０１〜Ｏ，Ｉ　ｍｙｍｏｌｅ／屑ρｍｉｎ
のプラスミン活性を何する）、ｆ）１．０〜２００１１
Ｕのアプロチニンを加えることによって酵素作用を遮断
し、 ｇ）溶液を凍結乾燥し、所望により、凍結乾燥物を熱処
理すること の組合わせを特徴とする。

この様に、この態様は、コーンフラクンヨンＩＩＩ（沈
澱）を出発物質とし、リン酸バッファーを用いてこのフ
ラクションからまず抽出物を得る。

この抽出物は、大量の不活性な随伴タンパク、例えばイ
ムノグロブリンおよびリポタンパクを含有し、とりわけ
後者は、構過特性が不十分であり、相互作用が非特異的
であるために、固定化リシン」−アフィニティークロマ
トグラフィーによって精製することを困難にするもので
ある。

これらの妨害随伴タンパクの大部分は、エタノール沈澱
によって除去することができる。

０．１〜］、　ＯＯＫ　Ｉ　Ｕアプロチニン／靜バッフ
ァー溶液を存在させると、アフィニティークロマトグラ
フィー精製の間、プラスミノーゲンの安定性は保証され
る。アフィニティークロマトグラフィーのためのマトリ
ックスとしては、リカンドとしてリシンを含有している
ケル、好ましくはり／ンポリアクリルアミドゲルを使用
する。吸着後、残存する随伴タンパクを、好ましくはリ
ン酸バッファーで洗浄することによって除去し、次いで
、プラスミノーゲンを溶離する。このアフィニティーク
ロマトグラフィー精製は、カラム法またはバッチ法のい
ずれて行ってもよい。

溶出液を、例えば硫酸アンモニウムまたはポリエチレン
グリコール４０００の様なタンパク沈澱剤で処理するこ
とによって、その特性の点で文献記載のｇｌｕ−プラス
ミノーゲンに対応し、ＳＤＳ　　ＰＡＧＥにおいて９２
，０００の分子量を有する中間体生成物が沈澱する。

この中間体生成物は既に、非常に少量のプラスミンを用
いて線維素溶解前酵素に変換し得、この前酵素は、文献
記載のｌｙｓ−プラスミノーゲンの特性を示し、５ＤＳ
−ＰＡＧＥにおいて８４Ｏｏｏの分子量を有している。

所望によりプラスミンまたはアプロチニンを添加するこ
とによって、精製プラスミノーゲン（−ｇｌｕ−プラス
ミノーゲン）の溶液のタンパク分解活性を、この様にし
て好ましくは０．０１〜０］　ｍｙｍｏｌｅ／　ｍＱと
いう前記範囲か非常に容易に調節され得るように、上昇
または低下さぜることがてきる。アプロチニンによる変
換の後、溶液中の酵素作用を遮断し、溶液を凍結乾燥し
、所望により、凍結乾燥物を熱処理する。

本発明の方法を行うのに必要な工程を、以下に、より詳
細に説明する。

色素生成基質であるＨ−Ｄ−バリル−し−口イシル−Ｌ
　−リシン−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩（Ｓ　２２
５１．　Ｋａｂｉ）に対する自発性タンパク分解活性の
測定 プラスミンおよびその他のタンパク分解酵素は、この色
素生成基質からｐ−二トロアニリンを切断し、その遊離
を、４０５ｎｍにおける吸光の増大として分光光学的に
測定することができる。

まず、試料を１・２．１５．１．　：　１０および１２
０の比て予め希釈する。このために、ｐＨ＝７２であり
、１０ミリモル／ρリシン、０５重量％ＰＥＧ６０００
および５０重量％グリセロールを含有している水性溶媒
を使用する。

色素生成基質を蒸留水中５ミリモル／ρの濃度に〆容解
する。５０ミリモル／ｆ２＋−リスおよび１８０ミリモ
ル／Ｑ　　ＮａＣρを含有しているｐＨ＝　７　。

２の水性溶液を試験バッファーとして使用する。

検定のためには、希釈試料０．２５ｘ＋２と試験バッフ
ァー０５５屑ｇを混合し、３７℃でインキュベートシ、
基質溶’ｔ＆　０　、０５　ｙｐ（ｌ　ヲ添加し、３７
°ｃ−ｃ’４０５ｎｍにおける吸光の増大を観察する。

活性の算出は、式 ％式％ プラスミノーゲンの比活性の測定。

ａ）カセイン分解単位（ＣＵ）／ｍｙタンパクストレプ
トキナーセと反応させることによって、プラスミノーゲ
ンをプラスミンに活性化する。これは、カゼインを切断
して、トリクロロ酢酸に可溶性であり、」１清の２８０
ｎｍにおける吸光の分光光学的測定によって検出し得る
カセインフラクメントとする。

ｐＨ＝９．０であり、５０ミリモル／ρ　トリス、２０
ミリモル／ρ　リシン、０１モル１０−　　ＮａＣρお
よび１ミリモル／ρ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含有している水
性溶液で、試料を０５〜２．５ＣＵ／靜の活性に予め希
釈する。

ハマーステン（Ｈａｍｍａｒｓｔｅｎ）に従い、リン酸
バッファー（ロアミリモル／ρ、ｐＨ７，４，）にカゼ
インを溶解（４％）することによって、基質を調製する
。

活性化するために、ストレプトキナーゼの」−記すン酸
バッファー中溶液（２５００１Ｕ／ｍＱ　）を使用する
。

検定を行うために、カセイン溶’ｔ＆２．０ｍＱ、リン
酸バッファー（ロアミリモル／ρ、ｐＨ７，４）］、。

４ｍρ、希釈試料０　、４　ｆｆ（およびストレプトキ
ナーセ溶液０２岬を水浴中で混合し、フランクとして、
希釈試料の代わりにバッファーをピペットで加える。３
７℃て３０分間加熱した後、試料を再び水浴に入れ、１
５％トリクロロ酢酸６７１（の添加によって、切断され
なかったカゼインを沈澱させる。室温で少なくとも３０
分間放置した後、重ねたフィルターで濾過し、」１清の
吸光をフランクに対し２８０ｎｍで測定する。

カゼイン分解活性の算出は、式 ％式％ によって行う。

測定範囲内で、少なくとも２つの異なる希釈率において
それぞれ２回の検定を行う。

比活性（ＣＯ／ｚｇタンパク）への変換は、カゼイン分
解活性をタンパク値（ケールタール、ｍｇ／ｍＱ　）で
除することによって行う。

ｂ）マイクロモルプラスミノーゲン／タタンパク窒素 この検定法は、゛活性部位交差滴定（ａｃｔｉｖｅ　５
ｉｔｅ　ｃｒｏｓｓ　ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）”として知
られている。まず、ストレプトキナーゼ ることによって、プラスミノーゲンを活性化する。

このコンフレックスは、ｐ−ニトロフェノールｐ−グア
ニジノベンジェ−１・と反応して、ｐ−二トロフェノー
ルを遊離し、これを４００ｎｍにおける吸光を測定する
ことによって分光光学的に調べる。

以下の試薬を使用する 試験バッファー（１）Ｈ＝７．７）： １００ミリモル／ρ　Ｎａ２ＨＰＯ４ １ミリモル／ｆ２　　６−アミノカプロン酸ストレプト
キナーゼバッファー ３０ミリモル／Ｑ．　　Ｎａ，Ｈ　Ｐ　Ｏ４１５０ミリ
モル／ａグルタミン酸ナトリウム滴定溶液： 乾燥ＤＭＳ○（０．４岬ｍモレキュラーシーブで乾燥）
中２　５ミリモル／（ｌｐ−二ｌ−　ａ　フェニル−ｐ
−グアニジ／ベンソニー１・ 標準溶液 １、Ｑｉｙｐ−ニトロフェノール／ｍ（Ｉ乾燥ＤＭＳＯ
０使用時、５祿を乾燥ＤＭＳ○で１００ｆｆｆｆに希釈
する。

検定にあたり、試験バッファ−１ｍρ、ストレプトキナ
ーセ溶液５０ｍｙρ（約２００ナノモル／屑ρ）および
’Ｖ”ｎ＋ｙｌ試料を２５℃にて２０〜３０分間インキ
ュベートし、４　０　０　ｎｍにおいて２　５分間吸光
度を測定する。２０ｍｙ１滴定溶液の添加後、これを混
合し、４００ｎｍで再び吸光度を観察する。

滴定溶液の添加後に測定された吸光度の増大（００８〜
０　１２の範囲まで）を’Ａ　ｔ’″として計算に入れ
る。

ブランクテスト　ストレプトキナーセの代わりにスｊ・
レプトキナーゼハッファ−を加え、試料の代わりに試料
と同一の塩組成を有する等容量のバッファーを加えるか
、方法は試験系と同一である。

吸光の増大を’Ａｂ”″として計算に入れる。

標準テスト、フランクテストと同様の方法であって更に
、滴定溶液の代わりに標準溶液を加える。

吸光度の増大を”Ａｓ”′として計算に入れる。

プラスミノーゲン活性の算出は、式 ％式％ によって行う。

この活性をタンパク窒素の溶液の含量（ケールタール、
ｇ／ρ）で除すると、プラスミノーゲンの比活性（ｍｙ
ｍｏ　Ｉ　ｅ／　ｇタンパク窒素）か得られる。

分子量の決定（ＳＤＳポリアクリルアミドケル電気泳動
、５ｌ）Ｓ　　ＰＡＧＥ） この方法は、タンパクが５ｌ）Ｓの添加によって一様に
荷電され、電位をかけた時、ポリアクリルアミドケル中
をその分子サイスに従って移動するということからなる
。その移動距離を、既知の分子量の較正用タンパクの移
動距離と比較することによって、検定しようとする試料
の分子量を決定することができる。

この方法を行うために、アクリルアミｌ”４７５ｇとＮ
、Ｎ−メチレン−ｂｉｓ−アクリルアミド２５９を、６
モル／ρ尿素、０．１モル／ρトリスおよび０１％５Ｄ
Ｓ（ドデ／ル硫酸すトリウム）を含有しているｐＨ７，
１の水性バッファー溶液に溶解する。

この溶液５７屑ρ、０．５％ベルオクソニ硫酸アンモニ
ウム水性溶液３靜およびＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎテトラメチル
エチレン／アミン９０ｍｙｌを激しく混合し、ゲルキャ
スティングスタンドに充填する。

重合後、ケルを電気泳動装置に入れて使用する。

試料を、９モル／ρ尿素および４５％ＳＤＳを含有する
溶液で２．５屑９／靜のタンパク濃度に希釈１−る。グ
リセロールブロムフェノールブルーて更に希釈（１−１
−１）した後、各々、ｆ３ｍｙｌ試料を使用する。電気
泳動のために、０１モル／ρ　トリス、０１％ＳＤＳお
よび０．００１％アジ化すトリウムを含有するｐＨ＝７
．１のバッファーを使用する。５０Ｖて１０分間、次い
て１００Ｖで３時間、電気泳動を行う。次きに、ケルを
、メタノール４５５靜、水４５５ｎρおよび氷酢酸９０
πａ中クーマンーブルー２９の溶液にて、室温で１時間
染色する。メタノール２．５Ｌ水酢酸１．０夕および水
６５ρの混液によって、染料を除く。

分子量を決定するために、移動距離を測定する。

この距離は分子量の対数に比例する。並行して検定した
較正値から、検量線を引き、これから、調べようとする
試料の分子量を読み取ることができる。

調へようとする試料中に数本のタンパクバントか認めら
れる場合、６０１ｎｍにおける吸光のテンシトメーター
評価によって、その分布か決定されるであろう。

す／ンポリアクリルアミトケルの調製。

バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ｐ−３００（１５０−３
００μｍ１ハイオ一ラド社（Ｂ　１ｏ−Ｒａｄ）製ポリ
アクリルアミドケル）１００ｙを水２．６ｉｉ中、４７
℃て２時間膨潤さぜ、ヒＩＳラジン・水和物１．２ρと
４７℃で２０時間反応させることによって、ヒドラジド
に変換する。これを、８．５以下のｐＨになるまで、蒸
留水で洗浄する（ブフナー漏斗で濾過する）。洗浄した
ゲルを００３ＮＨＣρ６ｇに懸濁し、ｐＨを１１に補正
する。Ｏ′Ｃに冷却後、亜硝酸すトリウム５６ｇの水２
００ｚρ中冷溶液を加え、３分間撹拌する。リンノ７３
０ｇの水２ρ中溶液を加えた後、＋４℃を越えない温度
および９５のｐＨて少なくとも３時間撹拌する。次いで
更に、４℃で１６時間撹拌を続ける。それぞれ２０Ｑ、
の水で３回洗浄し、ブフナー漏斗て講過した後、１０７
ｆ／（！塩化アンモニウムを含有する溶液（ｐＨ＝８．
８）］　５ρを加えて＋４℃で１６〜２０時間撹拌する
。次ぎに、ゲルを水、次いでリン酸バッファーで洗浄す
る。

以下に実施例を挙げ、本発明の方法を更に説明する。

実施例１ コーン■沈澱１に！？を、予め１．０　Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｚ
Ｑアフロチニンを加えたｐＨ７，／４のリン酸バッファ
ー１０Ｑ、に０℃て懸濁する。−２℃に冷却しながら、
１０％の終濃度までエタノールを加える。−２℃の温度
で１５時間撹拌した後、この懸濁液を遠心し、上〆青を
セルロース（ＡＭＦ　　クツ・セノタ・フラス５０Ｓ（
ＡＭＦ　　Ｃｕｎｏ　Ｚｅｔａ　Ｐｌｕｓ　５０　　Ｓ
））をベースとするテプス（ｃｌｅｐｔｈ）フィルター
で濾過した。次いて、これをリン酸ハソファ−５ρで希
釈し、リンンポリアクリルアミトゲル５００ｇを導入し
た。０℃で１時間撹拌した後、プラスミノーゲンか負荷
されたゲルをブフナー漏斗で濾過することにより分離し
、濾液中にタンパクが検出されなくなるまで、リン酸バ
ッファーで数回洗浄した。

６−アミ／カプロン酸のリン酸バッファー中溶液（０，
１モル／のを加えて撹拌することによって、プラスミノ
ーゲンを溶離し、次いで、溶出液１ｋｇ当たり硫酸アン
モニウム２６１ｇを加えることによって沈澱させた。

遠心して得た沈澱を等張性すン酸塩／生理的食塩水ハソ
ファ−３２祿に溶解した。本発明の、生成物のこれ以上
の処理は血漿酵素、即ち前記活性を有するプラスミンの
存在に依存するので、まず、色素生成基質、５２２５１
に対し、溶液のプラスミン活性を測定した。これは、○
　Ｏ４５ｍｙｍｏｌｅ／靜であったので、この場合、補
正的調節は必要ではなかった。透析を行う前には、ＳＤ
Ｓ　　ＰＡＧＥにおいて、９２，０００の分子！（−ｇ
ｌｕプラスミノーゲン）で１本のバンドのみが検出され
た。

等張性リン酸塩／生理的食塩水溶液に対して５゜０℃の
温度で３６時間透析した後、５０ＫＩＵ／１１ρアプロ
チニンを加えた。この時点て、基質、５２２５１に対す
る活性は、０．０１　ｍｙｍｏＩｅ／ｍＱ　ｍｉｎであ
った。カセイン分解活性についての試験では、３４．２
　ＣＵ／ｍＱであることがわかった。１５６９／ρのタ
ンパク含有量（ケールタールによる）の場合、これは、
２］、、９ＣＵ／ｍｙの比活性に対応する。活性部位交
差滴定は、１６４　ｍｙｍｏｌｅｓ／ρの活性および６
５　、７　ｍｙｍｏｌｅ／　ｇタンパク窒素の比活性を
示した。透析の間、９２，０００の分子量を有するタン
パク（−ｇｌｕ−プラスミノーゲン）から、８４，００
０の分子量を有するタンパク（−ｙｓ−プラスミノーゲ
ン）へ変換されたことが、５ＤＳＰＡ、ＧＥにおいて検
出された。この生成物の割合は、９８％であった。

２０ミリモル／（！リシンを加えた後、７．０にｐＨを
調節し、次いて、濾過および凍結乾燥を行った。凍結乾
燥物の水含有量を７．８重量％にし、次いで、これを６
０℃で１０時間加熱し、存在し得る細菌またはウィルス
を不活化した。蒸留水に溶解した後、これを滅菌濾過、
滅菌充填および再び凍結乾燥した。比活性および電気泳
動的純度についての試験では、この様にして得た最終生
成物は、透析して直接得た生成物に比較して変わらない
結果を示した。

実施例２ コーン■沈澱の抽出、エタノール沈澱および濾過を実施
例１と同様にして行った。リン酸バッファーで希釈した
後、リシンポリアクリルアミドゲル１００ｇを充填した
クロマトグラフィー用カラムに溶液を通した。実施例１
に記載の溶液を用い、クロマトグラフィー用カラム中で
洗浄および溶離を行った。実施例１と同様にして、溶出
液から硫酸アンモニウムによる沈澱、および沈澱の溶解
を行った。ＳＤＳ　　ＰＡＧＥにおいて、９２，０００
の分子量を示す１本のバンドのみか検出された。

色素生成基質である３２２５１に対する活性は、０　、
　ＯＯ３ｍｙｍｏｌｅ／　ｖｒ（ｔ　ｍｉｎであった。

プラスミンを加えることによって、これは０　、０１６
　ｍｙｍｏｌｅ／ｍθｍｉｎに上昇した。７℃で４３時
間透析し、１００ＫＩＵ／ｘｃアプロチニンを加えた後
、ＳＤＳ　　ＰＡＧＥにおいて、８４，０００の分子量
（−ｌｙｓ−プラスミノーゲン）におけるバンドの割合
は、９８％以」二であることがわかった。比活性はそれ
ぞれ、２２．３　ＣＵ１０タンパクおよび６Ｑ　、　５
　ｍｙｍｏｌ　ｅ／　ｇ窒素てあった。

頑霞多 ２ＫＩＵ／ｇρアプロチニンを加えた後、リン酸パンフ
ァーでコーン■沈澱の抽出を行った。その後、硫酸アン
モニウムでの沈澱および沈澱の溶解までは、実施例２と
同様にして行った。

色素生成基質である５２２５１に対する溶液の活性は、
Ｏ、Ｏｌ　４．　ｍｙｍｏｌｅ／　ｍρｍｉｎ、てあっ
た。１１゜７℃の温度で２２時間透析し、２０ＫＩＵ／
ｚρアプロチニンを加えた後は、２０．５　ＣＵ／ｍｇ
タンパクおよび５６　、３　ｍｙｍｏｌｅ／　９タンパ
ク窒素の比活性であることがわかった。ＳＤＳ　　ＰＡ
ＧＥにおけるｌｙｓ−プラスミノーゲンの割合は、９６
％であった。

実施例生 リシンポリアクリルアミドゲルの溶離まで実施例３の記
載と同様にして、プラスミノーゲンの単離を行った。溶
出液３５０７１ρにポリエチレンクリコール４０００を
７０ｙ加えることによって、プラスミノーゲンを沈澱さ
ぜた。遠心によって得た沈澱をリン酸塩／ＮａＣρバッ
ファー１５屑ρに溶解すると、ＳＤＳ　　ＰＡＧＥにお
いて、９２，０００の分子量を有する゛ｇｌｕ−プラス
ミノーゲン°ケンみが検出された。プラスミンを加えた
後、基質である５２２５１に対して測定した活性は０．
０１ｍｙｍｏｌｅ／　ｍＱ　ｍｉｎとなり、６，６℃の
温度で４２時間透析した後、アプロチニン（５０ＫＩＵ
／ｇのを加えた。

ＳＤＳ　　ＰＡＧＥにおけるｌｙｓ−プラスミノーゲン
の割合は９５％であり、それぞれ、２３４ＣＵ／ｍｇタ
ンパクおよび５９　、０　ｍｙｍｏｌｅ／　ｇタンパク
窒素の比活性が得られた。

平成

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血漿、プラスミノーゲン含有フラクションまたは組
   織培養からのプラスミノーゲンを、精製のために固定化
   リシンに吸着させ、溶離し、タンパク沈澱剤によって溶
   出液から精製プラスミノーゲンを回収する工程を含む、
   少なくとも１７．５カゼイン分解単位／ｍｇタンパクお
   よび少なくとも５０ｍｙｍｏｌｅ／ｇタンパク窒素の比
   活性、並びに少なくとも９０％の電気泳動的純度を有す
   るｌｙｓ−プラスミノーゲンの製造方法であって、精製
   プラスミノーゲンの溶液を、色素生成基質であるＨ−Ｄ
   −バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシン−ｐ−ニトロアニ
   リド・二塩酸塩に対して０．００５〜０．２ｍｙｍｏｌ
   ｅ／ｍｌｍｉｎの範囲のプラスミン活性に調節し、＋１
   ℃〜＋２０℃の温度で６〜６０時間維持して該プラスミ
   ノーゲンの酵素的タンパク分解によるｌｙｓ−プラスミ
   ノーゲンへの変換を誘導し、次いで、酵素作用を遮断し
   、該ｌｙｓ−プラスミノーゲンを単離することを特徴と
   する製造方法。 ２、該プラスミンの活性が０．０１〜０．１ｍｙｍｏｌ
   ｅ／ｍｌｍｉｎの範囲であり、該湿度が＋４℃〜＋１２
   ℃の範囲であり、該時間が１５〜５０時間の範囲である
   請求項１に記載の方法。 ３、プラスミノーゲンに対するプラスミンの作用を、阻
   害剤を加えることによって遮断する請求項１に記載の方
   法。 ４、該阻害剤が、１０〜２００ＫＩＵ／ｍｌの量のアプ
   ロチニン、０．０１〜１．０Ｕ／ｍｌの量のＣｌ−エス
   テラーゼ阻害剤、アルファ２−マクログロブリンおよび
   アルファ２−抗プラスミンからなる群から選択される請
   求項３に記載の方法。 ５、透析を行う間に該プラスミンを該プラスミノーゲン
   に作用させる請求項１に記載の方法。 ６、血漿または血漿産物から、少なくとも１７．５カゼ
   イン分解単位／ｍｇタンパクおよび少なくとも５０ナノ
   モルプラスミノーゲン／ｍｇ窒素の比活性、並びに少な
   くとも９０％の電気泳動的純度を有する熱安定性ｌｙｓ
   −プラスミノーゲンを製造するための方法であって、以
   下の工程： ａ）０．１〜１００ＫＩＵアプロチニン／ｍｌ緩衝溶液
   の存在下、リン酸緩衝液によってコーンフラクションI
   II（沈澱）を抽出して、粗製プラスミノーゲンフラクシ
   ョンを得、 ｂ）該粗製プラスミノーゲンフラクションをエタノール
   で処理して、抽出物から非プラスミノーゲンタンパクの
   大部分を沈澱させてこれを除去し、 ｃ）固定化リシンに吸着させ、次いで溶離することによ
   り、エタノール溶液からプラスミノーゲンを分離して、
   精製プラスミノーゲンを得、 ｄ）硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコール（
   ＰＥＧ）からなる群から選択される沈澱剤によって該精
   製プラスミノーゲンを沈澱させて沈澱を得、次いで、該
   沈澱を遠心し、 ｅ）該沈澱を溶解して溶液とし、該溶液をプラスミンの
   存在下で透析し（ここで、該溶液は、色素生成基質であ
   るＨ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシン−ｐ−ニ
   トロアニリド・二塩酸塩に対して０．０１〜０．１ｍｙ
   ｍｏｌｅ／ｍｌｍｉｎのプラスミン活性を有する）、 ｆ）１０〜２００ＫＩＵのアプロチニンを加えることに
   よって酵素作用を遮断し、 ｇ）この溶液を凍結乾燥し、凍結乾燥物を得ること を組合わせてなる方法。