JPH0297386A - 1ys―プラスミノーゲンの製造方法 - Google Patents
1ys―プラスミノーゲンの製造方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、少なくとも17,5力セイン分解単位/M!
7タンパクおよび少な(とも50 mymole/gタ
ンパク窒素の非活性並ひに少なくとも90%の電気泳動
的純度を有するlys−プラスミノーゲンの製造方法で
あって、血漿、プラスミノーゲン含有フラクションまた
は組織培養からのプラスミノーゲンを、精製のために固
定化リシンに吸着させ、溶離し、タンパク沈澱剤によっ
て溶出液から回収することからなる製造方法に関するも
のである。
7タンパクおよび少な(とも50 mymole/gタ
ンパク窒素の非活性並ひに少なくとも90%の電気泳動
的純度を有するlys−プラスミノーゲンの製造方法で
あって、血漿、プラスミノーゲン含有フラクションまた
は組織培養からのプラスミノーゲンを、精製のために固
定化リシンに吸着させ、溶離し、タンパク沈澱剤によっ
て溶出液から回収することからなる製造方法に関するも
のである。
ys−プラスミノーゲンは、天然のプラスミノーケン(
=glu−プラスミノーゲン)のタンパク分解的に修飾
された形態を表すために文献中で使用される一般名であ
り、N I−+ 2末端からポリペプチドを切断するこ
とによって、天然のプラスミノーゲンから得られる。こ
れまで、現在知られている種類の1ys−プラスミノー
ゲンのN−末端アミノ酸として、リシン、メチオニンお
よびバリンか検出されている。文献では、それぞれの分
子量として、glu−プラスミノーゲンについては90
.000から94..000の値、1ys−プラスミノ
ーゲンについては約80,000の値か示されている。
=glu−プラスミノーゲン)のタンパク分解的に修飾
された形態を表すために文献中で使用される一般名であ
り、N I−+ 2末端からポリペプチドを切断するこ
とによって、天然のプラスミノーゲンから得られる。こ
れまで、現在知られている種類の1ys−プラスミノー
ゲンのN−末端アミノ酸として、リシン、メチオニンお
よびバリンか検出されている。文献では、それぞれの分
子量として、glu−プラスミノーゲンについては90
.000から94..000の値、1ys−プラスミノ
ーゲンについては約80,000の値か示されている。
線維素溶解活性については、lys−プラスミノーゲン
は、主として2つの点でglu−プラスミノーゲンと異
なっている。即ぢ、lys−プラスミノーゲンは、トロ
ンビンのフィブリン網に対してより高い結合親和性を有
し、はるかに速くプラスミンへと活性化され得る(例え
ばウロキナーゼによって)。これらの両特性は、線維素
溶解の効率を高め、血栓症の治療においてlys−プラ
スミノーケンを使用するのが好ましいという理由となる
。
は、主として2つの点でglu−プラスミノーゲンと異
なっている。即ぢ、lys−プラスミノーゲンは、トロ
ンビンのフィブリン網に対してより高い結合親和性を有
し、はるかに速くプラスミンへと活性化され得る(例え
ばウロキナーゼによって)。これらの両特性は、線維素
溶解の効率を高め、血栓症の治療においてlys−プラ
スミノーケンを使用するのが好ましいという理由となる
。
lys−プラスミノーゲンの回収のための出発物質は、
血漿のコーン(Cohn) IIIフラクンヨンまたは
血漿それ自体である。文献に記載されている方法は、抽
出、吸着および沈澱工程の様な複数の工程からなる。N
−末端ポリペプチド鎖の切断およびlys−プラスミノ
ーゲンへの変換は、単離したglu−プラスミノーゲン
に対して直接性われるか、または存在するタンパク分解
活性のための単離および精製工程の途中で起こる。
血漿のコーン(Cohn) IIIフラクンヨンまたは
血漿それ自体である。文献に記載されている方法は、抽
出、吸着および沈澱工程の様な複数の工程からなる。N
−末端ポリペプチド鎖の切断およびlys−プラスミノ
ーゲンへの変換は、単離したglu−プラスミノーゲン
に対して直接性われるか、または存在するタンパク分解
活性のための単離および精製工程の途中で起こる。
ウォーレンおよびワイマン(P、Wallen and
BWiman、 B iochim、 B 1op
hys、 A ctaλλ↓、2030(1,970)
)は、洗浄したコーン■沈澱を抽出し、抽出物をpH4
゜8にてメタノールと硫酸アンモニウムで沈澱させるこ
とによって、プラスミノーゲンを単離した。この生成物
は、プラスミン汚染のために、05〜19%の自発性タ
ンパク分解活性を有している。アプロチニンの添加後、
ゲル濾過および陰イオン交換体吸着/溶離によって更に
精製すると、N−末端アミノ酸として主にグルタミンを
示し、01から03%の自発性タンパク分解活性を有す
るプラスミノーゲンか得られる。アプロチニンを添加せ
ずに行うと、4%の自発性タンパク分解活性を有し、N
−末端アミノ酸としてリシン、バリン、更にメチオニン
およびグルタミンを有する生成物の混合物か得られる。
BWiman、 B iochim、 B 1op
hys、 A ctaλλ↓、2030(1,970)
)は、洗浄したコーン■沈澱を抽出し、抽出物をpH4
゜8にてメタノールと硫酸アンモニウムで沈澱させるこ
とによって、プラスミノーゲンを単離した。この生成物
は、プラスミン汚染のために、05〜19%の自発性タ
ンパク分解活性を有している。アプロチニンの添加後、
ゲル濾過および陰イオン交換体吸着/溶離によって更に
精製すると、N−末端アミノ酸として主にグルタミンを
示し、01から03%の自発性タンパク分解活性を有す
るプラスミノーゲンか得られる。アプロチニンを添加せ
ずに行うと、4%の自発性タンパク分解活性を有し、N
−末端アミノ酸としてリシン、バリン、更にメチオニン
およびグルタミンを有する生成物の混合物か得られる。
ツノクリおよびキュエンテラl□ (E、 E、 R1
ckliand P、 A、 Cuendet、 B
iochim、 B 1ophys、 A ctaス
且0.4.4.7−4.51.(] 97 ]乃は、ポ
リアクリルアミドケルにリシンを固定化し、このゲルを
使用して血漿からプラスミノーゲンを単離した。
ckliand P、 A、 Cuendet、 B
iochim、 B 1ophys、 A ctaス
且0.4.4.7−4.51.(] 97 ]乃は、ポ
リアクリルアミドケルにリシンを固定化し、このゲルを
使用して血漿からプラスミノーゲンを単離した。
リン酸バッファーで洗浄後、0.5モル/ρの6アミ/
カプロン酸を含有しているバッファーて溶離する。硫酸
アンモニウムを加えて溶出液からプラスミノーゲンを沈
澱さぜ、沈澱を溶解し、NaC(2−1−リス−リシン
またはホスフ:r、 I・NaCρバッファーに対し
て透析する。N−末端アミノ酸としてグルタミンのみか
検出される。
カプロン酸を含有しているバッファーて溶離する。硫酸
アンモニウムを加えて溶出液からプラスミノーゲンを沈
澱さぜ、沈澱を溶解し、NaC(2−1−リス−リシン
またはホスフ:r、 I・NaCρバッファーに対し
て透析する。N−末端アミノ酸としてグルタミンのみか
検出される。
コールン等(D、GolleneLal、 Thro
mb、Res。
mb、Res。
7.51.5−529(1,975乃はまた、アプロチ
ニンを添加するかまたは添加しないで、リンンアカロー
スアフィニティークロマトグラフィーによる、血漿また
はコーンIII沈澱からのプラスミノーゲンの製造を記
載している。その結果、アプロチニンを加えた場合、純
粋なglu−プラスミノーゲンか血漿から回収され、ア
プロチニンを加えなかった場合、生成物は、N−末端ア
ミノ酸としてlysおよびvatを有する微量のタンパ
クを含有する。アプロチニンを添加しないで、コーンI
Il沈澱から、01〜1%の自発性タンパク分解活性(
存在するプラスミンによって誘発される)を有する生成
物か単離された。コーン■沈澱] kg当たり25,0
00〜50,0OOKIUアプロチニン、および洗液お
よび溶離液に5KIU/mρアプロチニンを加える場合
、自発性タンパク分解活性は01%以下であり、glu
−および1yS−プラスミノーゲンの分離は、DEAE
セファテックスA−50イオン交換クロマトグラフィー
によって行なわれた。
ニンを添加するかまたは添加しないで、リンンアカロー
スアフィニティークロマトグラフィーによる、血漿また
はコーンIII沈澱からのプラスミノーゲンの製造を記
載している。その結果、アプロチニンを加えた場合、純
粋なglu−プラスミノーゲンか血漿から回収され、ア
プロチニンを加えなかった場合、生成物は、N−末端ア
ミノ酸としてlysおよびvatを有する微量のタンパ
クを含有する。アプロチニンを添加しないで、コーンI
Il沈澱から、01〜1%の自発性タンパク分解活性(
存在するプラスミンによって誘発される)を有する生成
物か単離された。コーン■沈澱] kg当たり25,0
00〜50,0OOKIUアプロチニン、および洗液お
よび溶離液に5KIU/mρアプロチニンを加える場合
、自発性タンパク分解活性は01%以下であり、glu
−および1yS−プラスミノーゲンの分離は、DEAE
セファテックスA−50イオン交換クロマトグラフィー
によって行なわれた。
クレイズ等(H,C1aeys et al、、 T
hromb、 Re53.515−523(1,973
)および13i0chimBiophys、Acta、
34.2. 351 (] 974))は、l Q
K I Uアプロチニフフmρを含有しているリン酸
バッファー(061モル/ρ、pr−r7.4)を用い
、コーン■沈澱からプラスミノーゲンを抽出した。リシ
ンアガロースに吸着させ、リン酸バッファーで洗浄した
後、6−アミンカプロン酸(02モル10.)およびア
プロチニン(20K I U/靜)を含有するバッファ
ーで溶離する。この様にして単離したプラスミノーゲン
は、約04%の自発性タンパク分解活性を有し、N−末
端アミノ酸として、gluおよびlys以外に微量のv
alおよびmetを含有していた。同様の方法によって
血漿を処理すると、N−末端アミノ酸としてgluのみ
が検出され、自発性タンパク分解活性は01%以下であ
る。ケル濾過(セファテックスG150)およびイオン
交換クロマトグラフィー(DEAE−セファデックス
A−50)によって更に精製を行う。更に精製する前に
アプロチニン(400KIU/πρ)を加えると、目的
生成物は、出発物質としてコーン■沈澱を使用しても単
離され、この目的生成物は01%以下の自発性タンパク
分解活性を示し、N−末端アミノ酸としてgluを示す
。glu−プラスミノーゲンからlysプラスミノーゲ
ンへの変換は、著者により、プラスミン(プラスミノー
ゲン/プラスミン 2001〜20・3)と−緒に37
℃でインキュへ−1・することによって行なわれ、トリ
クロロ酢酸またはアプロチニンの添加によって終止され
る。
hromb、 Re53.515−523(1,973
)および13i0chimBiophys、Acta、
34.2. 351 (] 974))は、l Q
K I Uアプロチニフフmρを含有しているリン酸
バッファー(061モル/ρ、pr−r7.4)を用い
、コーン■沈澱からプラスミノーゲンを抽出した。リシ
ンアガロースに吸着させ、リン酸バッファーで洗浄した
後、6−アミンカプロン酸(02モル10.)およびア
プロチニン(20K I U/靜)を含有するバッファ
ーで溶離する。この様にして単離したプラスミノーゲン
は、約04%の自発性タンパク分解活性を有し、N−末
端アミノ酸として、gluおよびlys以外に微量のv
alおよびmetを含有していた。同様の方法によって
血漿を処理すると、N−末端アミノ酸としてgluのみ
が検出され、自発性タンパク分解活性は01%以下であ
る。ケル濾過(セファテックスG150)およびイオン
交換クロマトグラフィー(DEAE−セファデックス
A−50)によって更に精製を行う。更に精製する前に
アプロチニン(400KIU/πρ)を加えると、目的
生成物は、出発物質としてコーン■沈澱を使用しても単
離され、この目的生成物は01%以下の自発性タンパク
分解活性を示し、N−末端アミノ酸としてgluを示す
。glu−プラスミノーゲンからlysプラスミノーゲ
ンへの変換は、著者により、プラスミン(プラスミノー
ゲン/プラスミン 2001〜20・3)と−緒に37
℃でインキュへ−1・することによって行なわれ、トリ
クロロ酢酸またはアプロチニンの添加によって終止され
る。
これらの方法には全て、不都合な点かある。なぜなら、
これらは、例えばケル濾過の様な工程を含むので1ys
−プラスミノーゲンの大量の単離に適当てないか、また
はこれらは室温で行なわれなければならないので医蘂製
剤の細菌汚染の危険性を含むからである。更に、これら
の方法は通常、プラスミンを含有する製剤を与え、従っ
て、高割合の自発性タンパク分解活性を有する。このこ
とは、製剤を適用するに当たり、凝集系の前酵素に影響
し、前酵素を破壊することがあり、その結果、望ましく
ない副作用を起こすので、治療的観点から全く望ましく
ないことである。このタンパク分解活性は阻害し得るが
、不活性なコンプレックスを形成して、得られた製剤を
汚染する結果となる。
これらは、例えばケル濾過の様な工程を含むので1ys
−プラスミノーゲンの大量の単離に適当てないか、また
はこれらは室温で行なわれなければならないので医蘂製
剤の細菌汚染の危険性を含むからである。更に、これら
の方法は通常、プラスミンを含有する製剤を与え、従っ
て、高割合の自発性タンパク分解活性を有する。このこ
とは、製剤を適用するに当たり、凝集系の前酵素に影響
し、前酵素を破壊することがあり、その結果、望ましく
ない副作用を起こすので、治療的観点から全く望ましく
ないことである。このタンパク分解活性は阻害し得るが
、不活性なコンプレックスを形成して、得られた製剤を
汚染する結果となる。
本発明は、これらの不利益を避けることを目的とし、少
なくとも175カゼイン分解単位/mgタンパクおよび
少なくとも50 mymoleプラスミノーゲン/g窒
ケン比活性並ひに少なくとも90%の電気泳動的純度を
有するlys−プラスミノーゲンの製造であって、血漿
、プラスミノーゲン含有フラクションまたは組織培養か
らのプラスミノーゲンを、精製のために固定化リシンに
吸着させ、溶離し、タンパク沈澱剤によって溶出液から
回収することからなる製造を目的とするものである。
なくとも175カゼイン分解単位/mgタンパクおよび
少なくとも50 mymoleプラスミノーゲン/g窒
ケン比活性並ひに少なくとも90%の電気泳動的純度を
有するlys−プラスミノーゲンの製造であって、血漿
、プラスミノーゲン含有フラクションまたは組織培養か
らのプラスミノーゲンを、精製のために固定化リシンに
吸着させ、溶離し、タンパク沈澱剤によって溶出液から
回収することからなる製造を目的とするものである。
本発明によると、この目的は、この様にして精製したプ
ラスミノーゲンの溶液を、プラスミノーゲンからlys
−プラスミノーゲンへの酵素的タンパク分解による変換
を誘導するために、色素生成基質であるH−D−バリル
−し−ロイシル−しりシン−p−ニトロアニリド・二塩
酸塩に対してO,OO5〜0.2mymoles/ii
! min、好ましくは0.01 〜0 、 ] my
moles/ mQ、 minの範囲のプラスミン活性
に調節し、+1℃〜+20’C1好ましくは」−4℃〜
+12℃の温度で6〜60時間、好ましくは15〜50
時間維持腰次いて酵素作用を遮断し、lys−プラスミ
ノーゲンを単離することによって達成される。
ラスミノーゲンの溶液を、プラスミノーゲンからlys
−プラスミノーゲンへの酵素的タンパク分解による変換
を誘導するために、色素生成基質であるH−D−バリル
−し−ロイシル−しりシン−p−ニトロアニリド・二塩
酸塩に対してO,OO5〜0.2mymoles/ii
! min、好ましくは0.01 〜0 、 ] my
moles/ mQ、 minの範囲のプラスミン活性
に調節し、+1℃〜+20’C1好ましくは」−4℃〜
+12℃の温度で6〜60時間、好ましくは15〜50
時間維持腰次いて酵素作用を遮断し、lys−プラスミ
ノーゲンを単離することによって達成される。
本発明によると、プラスミンの活性を調節するために、
セリンプロテアーセ類からなる群の血漿酵素を使用する
ことかできる。これらは、プラスミンおよびプラスミン
様酵素を包含する。00] 〜O、] mymole/
xc minのプラスミン活性は、30.000:]〜
3,000:]のプラスミノーゲン/プラスミン比に相
当する。このことから、gU−プラスミノーゲンからl
ys−プラスミノーゲンへのタンパク分解的変換は、驚
くほと少量の酵素で行なわれるということかわかる。
セリンプロテアーセ類からなる群の血漿酵素を使用する
ことかできる。これらは、プラスミンおよびプラスミン
様酵素を包含する。00] 〜O、] mymole/
xc minのプラスミン活性は、30.000:]〜
3,000:]のプラスミノーゲン/プラスミン比に相
当する。このことから、gU−プラスミノーゲンからl
ys−プラスミノーゲンへのタンパク分解的変換は、驚
くほと少量の酵素で行なわれるということかわかる。
プラスミノーゲンに対するプラスミンの作用は、阻害剤
の添加によって遮断するのか好ましい。
の添加によって遮断するのか好ましい。
本発明の方法は更に、酵素作用を遮断するための少量の
阻害剤を、非常に少量の血漿酵素の使用により処理する
。例えば10〜200KIU/zρアプロチニンまたは
0.01〜1.、OU/mρCρエステラーゼ阻害剤の
添加によって、基質、52251に対して0 、03
mymole/ mQ以下またはそれと同等まで活性を
低下することができる。この値は、濾過、凍結乾燥、お
よび所望により、存在することもある細菌またはウィル
スの不活化のための熱処理の様な処理工程の間、生成物
の安定性を保証するのに十分である。
阻害剤を、非常に少量の血漿酵素の使用により処理する
。例えば10〜200KIU/zρアプロチニンまたは
0.01〜1.、OU/mρCρエステラーゼ阻害剤の
添加によって、基質、52251に対して0 、03
mymole/ mQ以下またはそれと同等まで活性を
低下することができる。この値は、濾過、凍結乾燥、お
よび所望により、存在することもある細菌またはウィル
スの不活化のための熱処理の様な処理工程の間、生成物
の安定性を保証するのに十分である。
プラスミンの作用を制限するために、アルファ2−マク
ログロブリンまたはアルファ2−抗プラスミンの様なそ
の他の阻害剤を使用することもできる。
ログロブリンまたはアルファ2−抗プラスミンの様なそ
の他の阻害剤を使用することもできる。
本発明方法の好ましい態様は、透析を行う間にプラスミ
ノーゲンにプラスミンを作用させることである。
ノーゲンにプラスミンを作用させることである。
血漿または血漿産物から、少なくとも17.5カゼイン
分解単位/mgタンパクおよび少なくとも50ナノモル
プラスミノーケン/mg窒素の比活性並ひに少なくとも
90%の電気泳動的純度を有する熱安定性1ys−プラ
スミノーゲンを製造するための本発明方法のとりわけ好
ましい変法は、以下の工程 a)0.] 〜100KIU7プof=ン/11(Q緩
衝溶液の存在下、リン酸緩衝液によってコーンフラクン
ヨンIII(沈澱)を抽出して、粗製プラスミノーゲン
フラクンヨンを得、 b)この粗製プラスミノーゲンフラクンヨンをエタノー
ルで処理して、抽出物から非プラスミノーゲンタンパク
の大部分を沈澱させてこれを除去し、 C)固定化リシンに吸着させ、次いで溶離することによ
り、エタノール溶液からプラスミノーゲンを分離し、 d)硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコール(
P E G)によって」二の精製プラスミノーゲンを沈
澱さぜ、この沈澱を遠心し、 e)沈澱を溶解し、この溶液をプラスミンの存在下で透
析しくここで、溶液は、色素生成基質である5225]
に対して0.01〜O,I mymole/屑ρmin
のプラスミン活性を何する)、f)1.0〜20011
Uのアプロチニンを加えることによって酵素作用を遮断
し、 g)溶液を凍結乾燥し、所望により、凍結乾燥物を熱処
理すること の組合わせを特徴とする。
分解単位/mgタンパクおよび少なくとも50ナノモル
プラスミノーケン/mg窒素の比活性並ひに少なくとも
90%の電気泳動的純度を有する熱安定性1ys−プラ
スミノーゲンを製造するための本発明方法のとりわけ好
ましい変法は、以下の工程 a)0.] 〜100KIU7プof=ン/11(Q緩
衝溶液の存在下、リン酸緩衝液によってコーンフラクン
ヨンIII(沈澱)を抽出して、粗製プラスミノーゲン
フラクンヨンを得、 b)この粗製プラスミノーゲンフラクンヨンをエタノー
ルで処理して、抽出物から非プラスミノーゲンタンパク
の大部分を沈澱させてこれを除去し、 C)固定化リシンに吸着させ、次いで溶離することによ
り、エタノール溶液からプラスミノーゲンを分離し、 d)硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコール(
P E G)によって」二の精製プラスミノーゲンを沈
澱さぜ、この沈澱を遠心し、 e)沈澱を溶解し、この溶液をプラスミンの存在下で透
析しくここで、溶液は、色素生成基質である5225]
に対して0.01〜O,I mymole/屑ρmin
のプラスミン活性を何する)、f)1.0〜20011
Uのアプロチニンを加えることによって酵素作用を遮断
し、 g)溶液を凍結乾燥し、所望により、凍結乾燥物を熱処
理すること の組合わせを特徴とする。
この様に、この態様は、コーンフラクンヨンIII(沈
澱)を出発物質とし、リン酸バッファーを用いてこのフ
ラクションからまず抽出物を得る。
澱)を出発物質とし、リン酸バッファーを用いてこのフ
ラクションからまず抽出物を得る。
この抽出物は、大量の不活性な随伴タンパク、例えばイ
ムノグロブリンおよびリポタンパクを含有し、とりわけ
後者は、構過特性が不十分であり、相互作用が非特異的
であるために、固定化リシン」−アフィニティークロマ
トグラフィーによって精製することを困難にするもので
ある。
ムノグロブリンおよびリポタンパクを含有し、とりわけ
後者は、構過特性が不十分であり、相互作用が非特異的
であるために、固定化リシン」−アフィニティークロマ
トグラフィーによって精製することを困難にするもので
ある。
これらの妨害随伴タンパクの大部分は、エタノール沈澱
によって除去することができる。
によって除去することができる。
0.1〜]、 OOK I Uアプロチニン/靜バッフ
ァー溶液を存在させると、アフィニティークロマトグラ
フィー精製の間、プラスミノーゲンの安定性は保証され
る。アフィニティークロマトグラフィーのためのマトリ
ックスとしては、リカンドとしてリシンを含有している
ケル、好ましくはり/ンポリアクリルアミドゲルを使用
する。吸着後、残存する随伴タンパクを、好ましくはリ
ン酸バッファーで洗浄することによって除去し、次いで
、プラスミノーゲンを溶離する。このアフィニティーク
ロマトグラフィー精製は、カラム法またはバッチ法のい
ずれて行ってもよい。
ァー溶液を存在させると、アフィニティークロマトグラ
フィー精製の間、プラスミノーゲンの安定性は保証され
る。アフィニティークロマトグラフィーのためのマトリ
ックスとしては、リカンドとしてリシンを含有している
ケル、好ましくはり/ンポリアクリルアミドゲルを使用
する。吸着後、残存する随伴タンパクを、好ましくはリ
ン酸バッファーで洗浄することによって除去し、次いで
、プラスミノーゲンを溶離する。このアフィニティーク
ロマトグラフィー精製は、カラム法またはバッチ法のい
ずれて行ってもよい。
溶出液を、例えば硫酸アンモニウムまたはポリエチレン
グリコール4000の様なタンパク沈澱剤で処理するこ
とによって、その特性の点で文献記載のglu−プラス
ミノーゲンに対応し、SDS PAGEにおいて92
,000の分子量を有する中間体生成物が沈澱する。
グリコール4000の様なタンパク沈澱剤で処理するこ
とによって、その特性の点で文献記載のglu−プラス
ミノーゲンに対応し、SDS PAGEにおいて92
,000の分子量を有する中間体生成物が沈澱する。
この中間体生成物は既に、非常に少量のプラスミンを用
いて線維素溶解前酵素に変換し得、この前酵素は、文献
記載のlys−プラスミノーゲンの特性を示し、5DS
−PAGEにおいて84Oooの分子量を有している。
いて線維素溶解前酵素に変換し得、この前酵素は、文献
記載のlys−プラスミノーゲンの特性を示し、5DS
−PAGEにおいて84Oooの分子量を有している。
所望によりプラスミンまたはアプロチニンを添加するこ
とによって、精製プラスミノーゲン(−glu−プラス
ミノーゲン)の溶液のタンパク分解活性を、この様にし
て好ましくは0.01〜0] mymole/ mQと
いう前記範囲か非常に容易に調節され得るように、上昇
または低下さぜることがてきる。アプロチニンによる変
換の後、溶液中の酵素作用を遮断し、溶液を凍結乾燥し
、所望により、凍結乾燥物を熱処理する。
とによって、精製プラスミノーゲン(−glu−プラス
ミノーゲン)の溶液のタンパク分解活性を、この様にし
て好ましくは0.01〜0] mymole/ mQと
いう前記範囲か非常に容易に調節され得るように、上昇
または低下さぜることがてきる。アプロチニンによる変
換の後、溶液中の酵素作用を遮断し、溶液を凍結乾燥し
、所望により、凍結乾燥物を熱処理する。
本発明の方法を行うのに必要な工程を、以下に、より詳
細に説明する。
細に説明する。
色素生成基質であるH−D−バリル−し−口イシル−L
−リシン−p−ニトロアニリド・二塩酸塩(S 22
51. Kabi)に対する自発性タンパク分解活性の
測定 プラスミンおよびその他のタンパク分解酵素は、この色
素生成基質からp−二トロアニリンを切断し、その遊離
を、405nmにおける吸光の増大として分光光学的に
測定することができる。
−リシン−p−ニトロアニリド・二塩酸塩(S 22
51. Kabi)に対する自発性タンパク分解活性の
測定 プラスミンおよびその他のタンパク分解酵素は、この色
素生成基質からp−二トロアニリンを切断し、その遊離
を、405nmにおける吸光の増大として分光光学的に
測定することができる。
まず、試料を1・2.15.1. : 10および12
0の比て予め希釈する。このために、pH=72であり
、10ミリモル/ρリシン、05重量%PEG6000
および50重量%グリセロールを含有している水性溶媒
を使用する。
0の比て予め希釈する。このために、pH=72であり
、10ミリモル/ρリシン、05重量%PEG6000
および50重量%グリセロールを含有している水性溶媒
を使用する。
色素生成基質を蒸留水中5ミリモル/ρの濃度に〆容解
する。50ミリモル/f2+−リスおよび180ミリモ
ル/Q NaCρを含有しているpH= 7 。
する。50ミリモル/f2+−リスおよび180ミリモ
ル/Q NaCρを含有しているpH= 7 。
2の水性溶液を試験バッファーとして使用する。
検定のためには、希釈試料0.25x+2と試験バッフ
ァー055屑gを混合し、37℃でインキュベートシ、
基質溶’t& 0 、05 yp(l ヲ添加し、37
°c−c’405nmにおける吸光の増大を観察する。
ァー055屑gを混合し、37℃でインキュベートシ、
基質溶’t& 0 、05 yp(l ヲ添加し、37
°c−c’405nmにおける吸光の増大を観察する。
活性の算出は、式
%式%
プラスミノーゲンの比活性の測定。
a)カセイン分解単位(CU)/myタンパクストレプ
トキナーセと反応させることによって、プラスミノーゲ
ンをプラスミンに活性化する。これは、カゼインを切断
して、トリクロロ酢酸に可溶性であり、」1清の280
nmにおける吸光の分光光学的測定によって検出し得る
カセインフラクメントとする。
トキナーセと反応させることによって、プラスミノーゲ
ンをプラスミンに活性化する。これは、カゼインを切断
して、トリクロロ酢酸に可溶性であり、」1清の280
nmにおける吸光の分光光学的測定によって検出し得る
カセインフラクメントとする。
pH=9.0であり、50ミリモル/ρ トリス、20
ミリモル/ρ リシン、01モル10− NaCρお
よび1ミリモル/ρ E D T Aを含有している水
性溶液で、試料を05〜2.5CU/靜の活性に予め希
釈する。
ミリモル/ρ リシン、01モル10− NaCρお
よび1ミリモル/ρ E D T Aを含有している水
性溶液で、試料を05〜2.5CU/靜の活性に予め希
釈する。
ハマーステン(Hammarsten)に従い、リン酸
バッファー(ロアミリモル/ρ、pH7,4,)にカゼ
インを溶解(4%)することによって、基質を調製する
。
バッファー(ロアミリモル/ρ、pH7,4,)にカゼ
インを溶解(4%)することによって、基質を調製する
。
活性化するために、ストレプトキナーゼの」−記すン酸
バッファー中溶液(25001U/mQ )を使用する
。
バッファー中溶液(25001U/mQ )を使用する
。
検定を行うために、カセイン溶’t&2.0mQ、リン
酸バッファー(ロアミリモル/ρ、pH7,4)]、。
酸バッファー(ロアミリモル/ρ、pH7,4)]、。
4mρ、希釈試料0 、4 ff(およびストレプトキ
ナーセ溶液02岬を水浴中で混合し、フランクとして、
希釈試料の代わりにバッファーをピペットで加える。3
7℃て30分間加熱した後、試料を再び水浴に入れ、1
5%トリクロロ酢酸671(の添加によって、切断され
なかったカゼインを沈澱させる。室温で少なくとも30
分間放置した後、重ねたフィルターで濾過し、」1清の
吸光をフランクに対し280nmで測定する。
ナーセ溶液02岬を水浴中で混合し、フランクとして、
希釈試料の代わりにバッファーをピペットで加える。3
7℃て30分間加熱した後、試料を再び水浴に入れ、1
5%トリクロロ酢酸671(の添加によって、切断され
なかったカゼインを沈澱させる。室温で少なくとも30
分間放置した後、重ねたフィルターで濾過し、」1清の
吸光をフランクに対し280nmで測定する。
カゼイン分解活性の算出は、式
%式%
によって行う。
測定範囲内で、少なくとも2つの異なる希釈率において
それぞれ2回の検定を行う。
それぞれ2回の検定を行う。
比活性(CO/zgタンパク)への変換は、カゼイン分
解活性をタンパク値(ケールタール、mg/mQ )で
除することによって行う。
解活性をタンパク値(ケールタール、mg/mQ )で
除することによって行う。
b)マイクロモルプラスミノーゲン/タタンパク窒素
この検定法は、゛活性部位交差滴定(active 5
ite cross titration)”として知
られている。まず、ストレプトキナーゼ ることによって、プラスミノーゲンを活性化する。
ite cross titration)”として知
られている。まず、ストレプトキナーゼ ることによって、プラスミノーゲンを活性化する。
このコンフレックスは、p−ニトロフェノールp−グア
ニジノベンジェ−1・と反応して、p−二トロフェノー
ルを遊離し、これを400nmにおける吸光を測定する
ことによって分光光学的に調べる。
ニジノベンジェ−1・と反応して、p−二トロフェノー
ルを遊離し、これを400nmにおける吸光を測定する
ことによって分光光学的に調べる。
以下の試薬を使用する
試験バッファー(1)H=7.7):
100ミリモル/ρ Na2HPO4
1ミリモル/f2 6−アミノカプロン酸ストレプト
キナーゼバッファー 30ミリモル/Q. Na,H P O4150ミリ
モル/aグルタミン酸ナトリウム滴定溶液: 乾燥DMS○(0.4岬mモレキュラーシーブで乾燥)
中2 5ミリモル/(lp−二l− a フェニル−p
−グアニジ/ベンソニー1・ 標準溶液 1、Qiyp−ニトロフェノール/m(I乾燥DMSO
0使用時、5祿を乾燥DMS○で100ffffに希釈
する。
キナーゼバッファー 30ミリモル/Q. Na,H P O4150ミリ
モル/aグルタミン酸ナトリウム滴定溶液: 乾燥DMS○(0.4岬mモレキュラーシーブで乾燥)
中2 5ミリモル/(lp−二l− a フェニル−p
−グアニジ/ベンソニー1・ 標準溶液 1、Qiyp−ニトロフェノール/m(I乾燥DMSO
0使用時、5祿を乾燥DMS○で100ffffに希釈
する。
検定にあたり、試験バッファ−1mρ、ストレプトキナ
ーセ溶液50myρ(約200ナノモル/屑ρ)および
’V”n+yl試料を25℃にて20〜30分間インキ
ュベートし、4 0 0 nmにおいて2 5分間吸光
度を測定する。20my1滴定溶液の添加後、これを混
合し、400nmで再び吸光度を観察する。
ーセ溶液50myρ(約200ナノモル/屑ρ)および
’V”n+yl試料を25℃にて20〜30分間インキ
ュベートし、4 0 0 nmにおいて2 5分間吸光
度を測定する。20my1滴定溶液の添加後、これを混
合し、400nmで再び吸光度を観察する。
滴定溶液の添加後に測定された吸光度の増大(008〜
0 12の範囲まで)を’A t’″として計算に入れ
る。
0 12の範囲まで)を’A t’″として計算に入れ
る。
ブランクテスト ストレプトキナーセの代わりにスj・
レプトキナーゼハッファ−を加え、試料の代わりに試料
と同一の塩組成を有する等容量のバッファーを加えるか
、方法は試験系と同一である。
レプトキナーゼハッファ−を加え、試料の代わりに試料
と同一の塩組成を有する等容量のバッファーを加えるか
、方法は試験系と同一である。
吸光の増大を’Ab”″として計算に入れる。
標準テスト、フランクテストと同様の方法であって更に
、滴定溶液の代わりに標準溶液を加える。
、滴定溶液の代わりに標準溶液を加える。
吸光度の増大を”As”′として計算に入れる。
プラスミノーゲン活性の算出は、式
%式%
によって行う。
この活性をタンパク窒素の溶液の含量(ケールタール、
g/ρ)で除すると、プラスミノーゲンの比活性(my
mo I e/ gタンパク窒素)か得られる。
g/ρ)で除すると、プラスミノーゲンの比活性(my
mo I e/ gタンパク窒素)か得られる。
分子量の決定(SDSポリアクリルアミドケル電気泳動
、5l)S PAGE) この方法は、タンパクが5l)Sの添加によって一様に
荷電され、電位をかけた時、ポリアクリルアミドケル中
をその分子サイスに従って移動するということからなる
。その移動距離を、既知の分子量の較正用タンパクの移
動距離と比較することによって、検定しようとする試料
の分子量を決定することができる。
、5l)S PAGE) この方法は、タンパクが5l)Sの添加によって一様に
荷電され、電位をかけた時、ポリアクリルアミドケル中
をその分子サイスに従って移動するということからなる
。その移動距離を、既知の分子量の較正用タンパクの移
動距離と比較することによって、検定しようとする試料
の分子量を決定することができる。
この方法を行うために、アクリルアミl”475gとN
、N−メチレン−bis−アクリルアミド259を、6
モル/ρ尿素、0.1モル/ρトリスおよび01%5D
S(ドデ/ル硫酸すトリウム)を含有しているpH7,
1の水性バッファー溶液に溶解する。
、N−メチレン−bis−アクリルアミド259を、6
モル/ρ尿素、0.1モル/ρトリスおよび01%5D
S(ドデ/ル硫酸すトリウム)を含有しているpH7,
1の水性バッファー溶液に溶解する。
この溶液57屑ρ、0.5%ベルオクソニ硫酸アンモニ
ウム水性溶液3靜およびN、N、N’、Nテトラメチル
エチレン/アミン90mylを激しく混合し、ゲルキャ
スティングスタンドに充填する。
ウム水性溶液3靜およびN、N、N’、Nテトラメチル
エチレン/アミン90mylを激しく混合し、ゲルキャ
スティングスタンドに充填する。
重合後、ケルを電気泳動装置に入れて使用する。
試料を、9モル/ρ尿素および45%SDSを含有する
溶液で2.5屑9/靜のタンパク濃度に希釈1−る。グ
リセロールブロムフェノールブルーて更に希釈(1−1
−1)した後、各々、f3myl試料を使用する。電気
泳動のために、01モル/ρ トリス、01%SDSお
よび0.001%アジ化すトリウムを含有するpH=7
.1のバッファーを使用する。50Vて10分間、次い
て100Vで3時間、電気泳動を行う。次きに、ケルを
、メタノール455靜、水455nρおよび氷酢酸90
πa中クーマンーブルー29の溶液にて、室温で1時間
染色する。メタノール2.5L水酢酸1.0夕および水
65ρの混液によって、染料を除く。
溶液で2.5屑9/靜のタンパク濃度に希釈1−る。グ
リセロールブロムフェノールブルーて更に希釈(1−1
−1)した後、各々、f3myl試料を使用する。電気
泳動のために、01モル/ρ トリス、01%SDSお
よび0.001%アジ化すトリウムを含有するpH=7
.1のバッファーを使用する。50Vて10分間、次い
て100Vで3時間、電気泳動を行う。次きに、ケルを
、メタノール455靜、水455nρおよび氷酢酸90
πa中クーマンーブルー29の溶液にて、室温で1時間
染色する。メタノール2.5L水酢酸1.0夕および水
65ρの混液によって、染料を除く。
分子量を決定するために、移動距離を測定する。
この距離は分子量の対数に比例する。並行して検定した
較正値から、検量線を引き、これから、調べようとする
試料の分子量を読み取ることができる。
較正値から、検量線を引き、これから、調べようとする
試料の分子量を読み取ることができる。
調へようとする試料中に数本のタンパクバントか認めら
れる場合、601nmにおける吸光のテンシトメーター
評価によって、その分布か決定されるであろう。
れる場合、601nmにおける吸光のテンシトメーター
評価によって、その分布か決定されるであろう。
す/ンポリアクリルアミトケルの調製。
バイオゲル(Biogel) P−300(150−3
00μm1ハイオ一ラド社(B 1o−Rad)製ポリ
アクリルアミドケル)100yを水2.6ii中、47
℃て2時間膨潤さぜ、ヒISラジン・水和物1.2ρと
47℃で20時間反応させることによって、ヒドラジド
に変換する。これを、8.5以下のpHになるまで、蒸
留水で洗浄する(ブフナー漏斗で濾過する)。洗浄した
ゲルを003NHCρ6gに懸濁し、pHを11に補正
する。O′Cに冷却後、亜硝酸すトリウム56gの水2
00zρ中冷溶液を加え、3分間撹拌する。リンノ73
0gの水2ρ中溶液を加えた後、+4℃を越えない温度
および95のpHて少なくとも3時間撹拌する。次いで
更に、4℃で16時間撹拌を続ける。それぞれ20Q、
の水で3回洗浄し、ブフナー漏斗て講過した後、107
f/(!塩化アンモニウムを含有する溶液(pH=8.
8)] 5ρを加えて+4℃で16〜20時間撹拌する
。次ぎに、ゲルを水、次いでリン酸バッファーで洗浄す
る。
00μm1ハイオ一ラド社(B 1o−Rad)製ポリ
アクリルアミドケル)100yを水2.6ii中、47
℃て2時間膨潤さぜ、ヒISラジン・水和物1.2ρと
47℃で20時間反応させることによって、ヒドラジド
に変換する。これを、8.5以下のpHになるまで、蒸
留水で洗浄する(ブフナー漏斗で濾過する)。洗浄した
ゲルを003NHCρ6gに懸濁し、pHを11に補正
する。O′Cに冷却後、亜硝酸すトリウム56gの水2
00zρ中冷溶液を加え、3分間撹拌する。リンノ73
0gの水2ρ中溶液を加えた後、+4℃を越えない温度
および95のpHて少なくとも3時間撹拌する。次いで
更に、4℃で16時間撹拌を続ける。それぞれ20Q、
の水で3回洗浄し、ブフナー漏斗て講過した後、107
f/(!塩化アンモニウムを含有する溶液(pH=8.
8)] 5ρを加えて+4℃で16〜20時間撹拌する
。次ぎに、ゲルを水、次いでリン酸バッファーで洗浄す
る。
以下に実施例を挙げ、本発明の方法を更に説明する。
実施例1
コーン■沈澱1に!?を、予め1.0 K I U/z
Qアフロチニンを加えたpH7,/4のリン酸バッファ
ー10Q、に0℃て懸濁する。−2℃に冷却しながら、
10%の終濃度までエタノールを加える。−2℃の温度
で15時間撹拌した後、この懸濁液を遠心し、上〆青を
セルロース(AMF クツ・セノタ・フラス50S(
AMF Cuno Zeta Plus 50 S
))をベースとするテプス(clepth)フィルター
で濾過した。次いて、これをリン酸ハソファ−5ρで希
釈し、リンンポリアクリルアミトゲル500gを導入し
た。0℃で1時間撹拌した後、プラスミノーゲンか負荷
されたゲルをブフナー漏斗で濾過することにより分離し
、濾液中にタンパクが検出されなくなるまで、リン酸バ
ッファーで数回洗浄した。
Qアフロチニンを加えたpH7,/4のリン酸バッファ
ー10Q、に0℃て懸濁する。−2℃に冷却しながら、
10%の終濃度までエタノールを加える。−2℃の温度
で15時間撹拌した後、この懸濁液を遠心し、上〆青を
セルロース(AMF クツ・セノタ・フラス50S(
AMF Cuno Zeta Plus 50 S
))をベースとするテプス(clepth)フィルター
で濾過した。次いて、これをリン酸ハソファ−5ρで希
釈し、リンンポリアクリルアミトゲル500gを導入し
た。0℃で1時間撹拌した後、プラスミノーゲンか負荷
されたゲルをブフナー漏斗で濾過することにより分離し
、濾液中にタンパクが検出されなくなるまで、リン酸バ
ッファーで数回洗浄した。
6−アミ/カプロン酸のリン酸バッファー中溶液(0,
1モル/のを加えて撹拌することによって、プラスミノ
ーゲンを溶離し、次いで、溶出液1kg当たり硫酸アン
モニウム261gを加えることによって沈澱させた。
1モル/のを加えて撹拌することによって、プラスミノ
ーゲンを溶離し、次いで、溶出液1kg当たり硫酸アン
モニウム261gを加えることによって沈澱させた。
遠心して得た沈澱を等張性すン酸塩/生理的食塩水ハソ
ファ−32祿に溶解した。本発明の、生成物のこれ以上
の処理は血漿酵素、即ち前記活性を有するプラスミンの
存在に依存するので、まず、色素生成基質、52251
に対し、溶液のプラスミン活性を測定した。これは、○
O45mymole/靜であったので、この場合、補
正的調節は必要ではなかった。透析を行う前には、SD
S PAGEにおいて、92,000の分子!(−g
luプラスミノーゲン)で1本のバンドのみが検出され
た。
ファ−32祿に溶解した。本発明の、生成物のこれ以上
の処理は血漿酵素、即ち前記活性を有するプラスミンの
存在に依存するので、まず、色素生成基質、52251
に対し、溶液のプラスミン活性を測定した。これは、○
O45mymole/靜であったので、この場合、補
正的調節は必要ではなかった。透析を行う前には、SD
S PAGEにおいて、92,000の分子!(−g
luプラスミノーゲン)で1本のバンドのみが検出され
た。
等張性リン酸塩/生理的食塩水溶液に対して5゜0℃の
温度で36時間透析した後、50KIU/11ρアプロ
チニンを加えた。この時点て、基質、52251に対す
る活性は、0.01 mymoIe/mQ minであ
った。カセイン分解活性についての試験では、34.2
CU/mQであることがわかった。1569/ρのタ
ンパク含有量(ケールタールによる)の場合、これは、
2]、、9CU/myの比活性に対応する。活性部位交
差滴定は、164 mymoles/ρの活性および6
5 、7 mymole/ gタンパク窒素の比活性を
示した。透析の間、92,000の分子量を有するタン
パク(−glu−プラスミノーゲン)から、84,00
0の分子量を有するタンパク(−ys−プラスミノーゲ
ン)へ変換されたことが、5DSPA、GEにおいて検
出された。この生成物の割合は、98%であった。
温度で36時間透析した後、50KIU/11ρアプロ
チニンを加えた。この時点て、基質、52251に対す
る活性は、0.01 mymoIe/mQ minであ
った。カセイン分解活性についての試験では、34.2
CU/mQであることがわかった。1569/ρのタ
ンパク含有量(ケールタールによる)の場合、これは、
2]、、9CU/myの比活性に対応する。活性部位交
差滴定は、164 mymoles/ρの活性および6
5 、7 mymole/ gタンパク窒素の比活性を
示した。透析の間、92,000の分子量を有するタン
パク(−glu−プラスミノーゲン)から、84,00
0の分子量を有するタンパク(−ys−プラスミノーゲ
ン)へ変換されたことが、5DSPA、GEにおいて検
出された。この生成物の割合は、98%であった。
20ミリモル/(!リシンを加えた後、7.0にpHを
調節し、次いて、濾過および凍結乾燥を行った。凍結乾
燥物の水含有量を7.8重量%にし、次いで、これを6
0℃で10時間加熱し、存在し得る細菌またはウィルス
を不活化した。蒸留水に溶解した後、これを滅菌濾過、
滅菌充填および再び凍結乾燥した。比活性および電気泳
動的純度についての試験では、この様にして得た最終生
成物は、透析して直接得た生成物に比較して変わらない
結果を示した。
調節し、次いて、濾過および凍結乾燥を行った。凍結乾
燥物の水含有量を7.8重量%にし、次いで、これを6
0℃で10時間加熱し、存在し得る細菌またはウィルス
を不活化した。蒸留水に溶解した後、これを滅菌濾過、
滅菌充填および再び凍結乾燥した。比活性および電気泳
動的純度についての試験では、この様にして得た最終生
成物は、透析して直接得た生成物に比較して変わらない
結果を示した。
実施例2
コーン■沈澱の抽出、エタノール沈澱および濾過を実施
例1と同様にして行った。リン酸バッファーで希釈した
後、リシンポリアクリルアミドゲル100gを充填した
クロマトグラフィー用カラムに溶液を通した。実施例1
に記載の溶液を用い、クロマトグラフィー用カラム中で
洗浄および溶離を行った。実施例1と同様にして、溶出
液から硫酸アンモニウムによる沈澱、および沈澱の溶解
を行った。SDS PAGEにおいて、92,000
の分子量を示す1本のバンドのみか検出された。
例1と同様にして行った。リン酸バッファーで希釈した
後、リシンポリアクリルアミドゲル100gを充填した
クロマトグラフィー用カラムに溶液を通した。実施例1
に記載の溶液を用い、クロマトグラフィー用カラム中で
洗浄および溶離を行った。実施例1と同様にして、溶出
液から硫酸アンモニウムによる沈澱、および沈澱の溶解
を行った。SDS PAGEにおいて、92,000
の分子量を示す1本のバンドのみか検出された。
色素生成基質である32251に対する活性は、0 、
OO3mymole/ vr(t minであった。
OO3mymole/ vr(t minであった。
プラスミンを加えることによって、これは0 、016
mymole/mθminに上昇した。7℃で43時
間透析し、100KIU/xcアプロチニンを加えた後
、SDS PAGEにおいて、84,000の分子量
(−lys−プラスミノーゲン)におけるバンドの割合
は、98%以」二であることがわかった。比活性はそれ
ぞれ、22.3 CU10タンパクおよび6Q 、 5
mymol e/ g窒素てあった。
mymole/mθminに上昇した。7℃で43時
間透析し、100KIU/xcアプロチニンを加えた後
、SDS PAGEにおいて、84,000の分子量
(−lys−プラスミノーゲン)におけるバンドの割合
は、98%以」二であることがわかった。比活性はそれ
ぞれ、22.3 CU10タンパクおよび6Q 、 5
mymol e/ g窒素てあった。
頑霞多
2KIU/gρアプロチニンを加えた後、リン酸パンフ
ァーでコーン■沈澱の抽出を行った。その後、硫酸アン
モニウムでの沈澱および沈澱の溶解までは、実施例2と
同様にして行った。
ァーでコーン■沈澱の抽出を行った。その後、硫酸アン
モニウムでの沈澱および沈澱の溶解までは、実施例2と
同様にして行った。
色素生成基質である52251に対する溶液の活性は、
O、Ol 4. mymole/ mρmin、てあっ
た。11゜7℃の温度で22時間透析し、20KIU/
zρアプロチニンを加えた後は、20.5 CU/mg
タンパクおよび56 、3 mymole/ 9タンパ
ク窒素の比活性であることがわかった。SDS PA
GEにおけるlys−プラスミノーゲンの割合は、96
%であった。
O、Ol 4. mymole/ mρmin、てあっ
た。11゜7℃の温度で22時間透析し、20KIU/
zρアプロチニンを加えた後は、20.5 CU/mg
タンパクおよび56 、3 mymole/ 9タンパ
ク窒素の比活性であることがわかった。SDS PA
GEにおけるlys−プラスミノーゲンの割合は、96
%であった。
実施例生
リシンポリアクリルアミドゲルの溶離まで実施例3の記
載と同様にして、プラスミノーゲンの単離を行った。溶
出液35071ρにポリエチレンクリコール4000を
70y加えることによって、プラスミノーゲンを沈澱さ
ぜた。遠心によって得た沈澱をリン酸塩/NaCρバッ
ファー15屑ρに溶解すると、SDS PAGEにお
いて、92,000の分子量を有する゛glu−プラス
ミノーゲン°ケンみが検出された。プラスミンを加えた
後、基質である52251に対して測定した活性は0.
01mymole/ mQ minとなり、6,6℃の
温度で42時間透析した後、アプロチニン(50KIU
/gのを加えた。
載と同様にして、プラスミノーゲンの単離を行った。溶
出液35071ρにポリエチレンクリコール4000を
70y加えることによって、プラスミノーゲンを沈澱さ
ぜた。遠心によって得た沈澱をリン酸塩/NaCρバッ
ファー15屑ρに溶解すると、SDS PAGEにお
いて、92,000の分子量を有する゛glu−プラス
ミノーゲン°ケンみが検出された。プラスミンを加えた
後、基質である52251に対して測定した活性は0.
01mymole/ mQ minとなり、6,6℃の
温度で42時間透析した後、アプロチニン(50KIU
/gのを加えた。
SDS PAGEにおけるlys−プラスミノーゲン
の割合は95%であり、それぞれ、234CU/mgタ
ンパクおよび59 、0 mymole/ gタンパク
窒素の比活性が得られた。
の割合は95%であり、それぞれ、234CU/mgタ
ンパクおよび59 、0 mymole/ gタンパク
窒素の比活性が得られた。
平成
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、血漿、プラスミノーゲン含有フラクションまたは組
織培養からのプラスミノーゲンを、精製のために固定化
リシンに吸着させ、溶離し、タンパク沈澱剤によって溶
出液から精製プラスミノーゲンを回収する工程を含む、
少なくとも17.5カゼイン分解単位/mgタンパクお
よび少なくとも50mymole/gタンパク窒素の比
活性、並びに少なくとも90%の電気泳動的純度を有す
るlys−プラスミノーゲンの製造方法であって、精製
プラスミノーゲンの溶液を、色素生成基質であるH−D
−バリル−L−ロイシル−L−リシン−p−ニトロアニ
リド・二塩酸塩に対して0.005〜0.2mymol
e/mlminの範囲のプラスミン活性に調節し、+1
℃〜+20℃の温度で6〜60時間維持して該プラスミ
ノーゲンの酵素的タンパク分解によるlys−プラスミ
ノーゲンへの変換を誘導し、次いで、酵素作用を遮断し
、該lys−プラスミノーゲンを単離することを特徴と
する製造方法。 2、該プラスミンの活性が0.01〜0.1mymol
e/mlminの範囲であり、該湿度が+4℃〜+12
℃の範囲であり、該時間が15〜50時間の範囲である
請求項1に記載の方法。 3、プラスミノーゲンに対するプラスミンの作用を、阻
害剤を加えることによって遮断する請求項1に記載の方
法。 4、該阻害剤が、10〜200KIU/mlの量のアプ
ロチニン、0.01〜1.0U/mlの量のCl−エス
テラーゼ阻害剤、アルファ2−マクログロブリンおよび
アルファ2−抗プラスミンからなる群から選択される請
求項3に記載の方法。 5、透析を行う間に該プラスミンを該プラスミノーゲン
に作用させる請求項1に記載の方法。 6、血漿または血漿産物から、少なくとも17.5カゼ
イン分解単位/mgタンパクおよび少なくとも50ナノ
モルプラスミノーゲン/mg窒素の比活性、並びに少な
くとも90%の電気泳動的純度を有する熱安定性lys
−プラスミノーゲンを製造するための方法であって、以
下の工程: a)0.1〜100KIUアプロチニン/ml緩衝溶液
の存在下、リン酸緩衝液によってコーンフラクションI
II(沈澱)を抽出して、粗製プラスミノーゲンフラクシ
ョンを得、 b)該粗製プラスミノーゲンフラクションをエタノール
で処理して、抽出物から非プラスミノーゲンタンパクの
大部分を沈澱させてこれを除去し、 c)固定化リシンに吸着させ、次いで溶離することによ
り、エタノール溶液からプラスミノーゲンを分離して、
精製プラスミノーゲンを得、 d)硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコール(
PEG)からなる群から選択される沈澱剤によって該精
製プラスミノーゲンを沈澱させて沈澱を得、次いで、該
沈澱を遠心し、 e)該沈澱を溶解して溶液とし、該溶液をプラスミンの
存在下で透析し(ここで、該溶液は、色素生成基質であ
るH−D−バリル−L−ロイシル−L−リシン−p−ニ
トロアニリド・二塩酸塩に対して0.01〜0.1my
mole/mlminのプラスミン活性を有する)、 f)10〜200KIUのアプロチニンを加えることに
よって酵素作用を遮断し、 g)この溶液を凍結乾燥し、凍結乾燥物を得ること を組合わせてなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AT0191988A AT390801B (de) | 1988-07-28 | 1988-07-28 | Verfahren zur herstellung von lys-plasminogen |
AT1919/88 | 1988-07-28 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0297386A true JPH0297386A (ja) | 1990-04-09 |
JP2521354B2 JP2521354B2 (ja) | 1996-08-07 |
Family
ID=3523862
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1197908A Expired - Lifetime JP2521354B2 (ja) | 1988-07-28 | 1989-07-28 | 1ys―プラスミノ―ゲンの製造方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
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EP (1) | EP0353218B1 (ja) |
JP (1) | JP2521354B2 (ja) |
AT (2) | AT390801B (ja) |
CA (1) | CA1334079C (ja) |
DE (1) | DE58901530D1 (ja) |
DK (1) | DK371689A (ja) |
ES (1) | ES2043113T3 (ja) |
FI (1) | FI93518C (ja) |
NO (1) | NO175260C (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4989922A (en) * | 1988-11-23 | 1991-02-05 | Lucas Industries Public Limited Company | Method of anti-lock brake control for motorcycle vehicle |
WO1995004077A1 (fr) * | 1993-07-29 | 1995-02-09 | The Green Cross Corporation | Procede de purification du plasminogene |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AT390801B (de) * | 1988-07-28 | 1990-07-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von lys-plasminogen |
AT402367B (de) * | 1990-10-11 | 1997-04-25 | Immuno Ag | Pharmazeutische zubereitung auf basis von lys-plasminogen |
AT402891B (de) * | 1991-06-20 | 1997-09-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines inaktivierten blutproduktes |
AT399818B (de) * | 1992-04-24 | 1995-07-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer hochgereinigten virussicheren faktor viii-präparation |
JP3133338B2 (ja) * | 1992-12-16 | 2001-02-05 | イムノ・アクチエンゲゼルシャフト | ウイルス的に安全な生物学的組成物の調製方法 |
DE4320294A1 (de) * | 1993-06-18 | 1994-12-22 | Immuno Ag | Verwendung von humanem Protein C zur Verhinderung und Behandlung von Thrombozytenablagerungen |
US5520912A (en) * | 1993-07-02 | 1996-05-28 | Immuno Aktiengesellschaft | Prevention and treatment of ischemic events and reperfusion injury resulting therefrom using lys-plasminogen |
DE4411143C2 (de) * | 1994-03-30 | 1996-08-01 | Immuno Ag | Thrombosemittel |
US6068838A (en) * | 1996-04-29 | 2000-05-30 | Baxter Aktiengesellschaft | Purified multimerase |
US6207066B1 (en) * | 1996-07-23 | 2001-03-27 | Nuvue Technologies, L.L.C. | Method for purification of a blood component |
US7544500B2 (en) * | 1999-11-13 | 2009-06-09 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Process for the production of a reversibly inactive acidified plasmin composition |
US6355243B1 (en) | 1999-11-13 | 2002-03-12 | Bayer Corporation | Method of thrombolysis by local delivery of active plasmin |
US6969515B2 (en) * | 1999-11-13 | 2005-11-29 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Method of thrombolysis by local delivery of reversibly inactivated acidified plasmin |
US6964764B2 (en) | 1999-11-13 | 2005-11-15 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Method of thrombolysis by local delivery of reversibly inactivated acidified plasmin |
US6855263B2 (en) | 2002-07-23 | 2005-02-15 | Nuvue Technologies, Inc. | Rapid process for purification and concentration of plasmin |
CN1303413C (zh) * | 2003-06-17 | 2007-03-07 | 余伟明 | 蛋白质、病毒快速富集方法 |
KR20110017903A (ko) * | 2008-06-04 | 2011-02-22 | 테일크리스 바이오쎄러퓨틱스 아이엔씨. | 플라스민의 제조를 위한 조성물, 방법 및 키트 |
WO2010101903A2 (en) | 2009-03-03 | 2010-09-10 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Compositions, methods and kits for preparing plasminogen; and plasmin prepared therefrom |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AT390801B (de) * | 1988-07-28 | 1990-07-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von lys-plasminogen |
-
1988
- 1988-07-28 AT AT0191988A patent/AT390801B/de not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-07-10 AT AT89890184T patent/ATE76578T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-07-10 EP EP89890184A patent/EP0353218B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-10 ES ES89890184T patent/ES2043113T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-10 DE DE8989890184T patent/DE58901530D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-07-21 FI FI893519A patent/FI93518C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-07-27 CA CA000606799A patent/CA1334079C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-07-27 DK DK371689A patent/DK371689A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-07-27 NO NO893071A patent/NO175260C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-07-28 JP JP1197908A patent/JP2521354B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-04-01 US US08/041,332 patent/US5371007A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-08-18 US US08/292,290 patent/US5556766A/en not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4989922A (en) * | 1988-11-23 | 1991-02-05 | Lucas Industries Public Limited Company | Method of anti-lock brake control for motorcycle vehicle |
WO1995004077A1 (fr) * | 1993-07-29 | 1995-02-09 | The Green Cross Corporation | Procede de purification du plasminogene |
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---|---|
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EP0353218A3 (en) | 1990-05-16 |
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