CN1303413C - 蛋白质、病毒快速富集方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蛋白质、病毒富集方法。它需要解决的技术问题是提高浓缩和纯化速度，使蛋白质、病毒检出率和准确性提高。其步骤为：1)蛋白絮凝：稀释样品释放蛋白质、病毒颗粒，加90～100%饱和度的硫酸铵为凝集溶剂，使蛋白质、病毒颗粒和细胞形成凝集物；2)分相沉淀：加异丙醇∶无水乙醇＝3～10∶1为分相溶剂，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到相间；3)二次沉淀：加10～30%聚二醇6000为沉淀溶剂，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到管底；4)弃清留沉：弃上清，洗涤，离心，再弃上清，再离心，吸尽上清得富集液；所述的样品体积∶凝集溶剂体积∶分相溶剂体积∶沉淀溶剂体积＝5∶2～3∶6～8∶5～6。

Description

蛋白质、病毒快速富集方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白质、病毒快速富集方法，适合从人或动物的各种样品(包括漱口液、培养上清、尿液、粪便抽提液、血清、咳痰抽提液、鼻拭子抽提液、咽拭子抽提液)，以及其它动植物试样中快速富集并部分纯化蛋白质、病毒颗粒的方法。
背景技术
在化验所需的样品中，蛋白质、病毒的数量相差很大。如因病毒致患病人在不同病程的尿液、粪便、血清等临床样品以及潜伏期病人中的病毒数量就极少。目前的检验方法对样品体积大小都有一定的限制，不能从大体积的样品中提取蛋白质、病毒RNA，常常导致假阴性的检测结果。中国专利文献CN1285878公开了一种“用于富集和寻找微生物样品的方法和装置”，该方法对微生物的富集培养是在注射器或同等物中完成的，由于常规培养周期较长，不适应快速检测的需要。对蛋白质、病毒颗粒进行快速浓缩和部分纯化技术，中国医学文献和中国专利文献未见公开报道。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，克服已有技术所存在的不足，提供一种从大体积样品中对蛋白质、病毒颗粒浓缩和部分纯化速度快，浓缩率高的蛋白质、病毒快速富集方法，使蛋白质、病毒检出率和准确性大大提高。
本发明蛋白质、病毒富集方法，其特征在于在由以下操作步骤构成：
1)蛋白絮凝：稀释样品释放蛋白质、病毒颗粒，加凝集溶剂，使蛋白质、病毒颗粒和细胞形成凝集物；
2)分相沉淀：加分相溶剂，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到相间；
3)二次沉淀：加沉淀溶剂，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到管底；
4)弃清留沉：弃上清，洗涤，离心，再弃上清，再离心，吸尽上清得富集液。
上述操作步骤一般在10～20分钟完成。
在含蛋白质、病毒颗粒的样品中加入凝集溶剂，使蛋白质、病毒颗粒呈脱水状态或部分盐析而得到保护。加入分相溶剂后，立即形成二相体系，下相的水分被抽提到上相，而下相的凝集溶剂几乎达到100％的饱和度，蛋白质在两相中均不相容，而被有效地析出形成沉淀分布在相间，并在离心过程中沉淀到相间。加入沉淀溶剂消除两相，再经离心沉淀回收蛋白质、病毒颗粒。同时蛋白质、病毒颗粒也得到部分纯化(如粪便中的细菌、食物残渣及RT-PCR[逆转录-多聚酶链式样反应]抑制物都被去除)，使检测灵敏性得到进一步的提高。用50％乙醇(或异丙醇)洗涤去除残留的盐离子后，蛋白质、病毒颗粒沉淀即可用于蛋白质、病毒RNA的纯化。另外，分相溶剂能直接杀死病毒，减少实验室感染的危险；凝集溶剂和分相溶剂均能抑制RNA酶活性，防止RNA的降解。
所述的蛋白质凝集溶剂是：90～100％饱和度的硫酸铵；
所述的分相溶剂是：异丙醇∶无水乙醇＝3～10∶1；
所述的蛋白质沉淀溶剂是：10～30％聚乙二醇6000；
如果在蛋白质凝集溶剂中添加有80mM NaH2PO4和80mM Na2HPO4，在分相溶剂中添加有冰乙酸2～5ml/L则富集效果更好。这可以降低PH值，促使凝结块更加紧实，易于沉淀回收。
所述的分相溶剂和离心机预冷后使用，其分相效果更好，预冷通常不高于10℃。
根据不同的样品体积，它和三种溶剂一般有如下比例关系，即样品体积∶凝集溶剂体积∶分相溶剂体积∶沉淀溶剂体积＝5∶2～3∶6～8∶5～6；操作中常用比例关系为5∶2∶6.5∶5。
为了规范操作，各样品体积都需要定量，并符合上述比例关系。I类样品5ml中凝集溶剂加量是2ml；分相溶剂加量是6.5ml，沉淀溶剂加量是5ml；II类样品2ml中凝集溶剂加量是0.8ml；分相溶剂加量是2.5ml，沉淀溶剂加量是2ml。上述I类样品是指：漱口液，培养上清，尿液，粪便抽提液；II类样品是指：血清，咳痰抽提液，鼻拭子抽提液，咽拭子抽提液。
本发明方法构思合理，操作简单易行，从大体积样品中对蛋白质、病毒颗粒浓缩和部分纯化速度快，可浓缩约100倍，使蛋白质、病毒检出率、准确率提高100～1000倍。特别是富集速度快，对于控制高传染性病毒流行具有重要意义。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
一、富集实验准备：
从所有样品中富集蛋白质、病毒颗粒需作如下准备：
1.含消毒液的废物缸。
2.吸管。
3.4℃预冷分相溶剂。
4.50％乙醇，4℃预冷。
5.将离心机预冷至4℃。
从各种样品中富集蛋白质、病毒颗粒分别作以下准备：
1.漱口液、培养上清、尿液：50ml离心管。
2.血清：15ml离心管。
3.粪便：50ml离心管；生理盐水或PBS。
4.咳痰：50ml离心管；生理盐水或PBS，使用前加乙酰半胱氨酸(acetylcysteine)至终浓度为1％。
5.鼻拭子：15ml离心管；生理盐水或PBS。
6.咽拭子：15ml和50ml离心管；生理盐水或PBS。
其中，生理盐水：0.9％NaCl；PBS：1.44g Na2HPO1·2H2O(或1.15g Na2HPO1)，0.2g KH2PO4，0.2g KCl，8.0g NaCl，加水至1升，调节pH至7.2，高压灭菌。
本例的蛋白质、病毒凝集溶剂是96％饱和度的硫酸铵；分相溶剂是异丙醇∶无水乙醇＝3∶1；蛋白质、病毒沉淀溶剂是10％聚二醇6000。
二、操作步骤
此操作步骤是按以下体积的样品为例而设计的：
A.5ml漱口液、培养上清、尿液、粪便抽提液；
B.2ml血清、咳痰抽提液、鼻拭子抽提液、咽拭子抽提液。
(一)从I类样品——漱口液、培养上清、尿液、粪便抽提液中富集蛋白质、病毒颗粒：
1、蛋白絮凝：释放蛋白质、病毒颗粒，加凝集溶剂
A.漱口液、培养上清、尿液取5ml样品，转入50ml离心管中，加2ml凝集溶剂。
B.新鲜粪便
(1)称取2克样品，转入50ml离心管中。
(2)加6ml生理盐水或PBS，用吸管搅拌捣碎，再反复吹打彻底混合均匀(注意，勿溅到管外)，充分释放蛋白质、病毒颗粒。4℃，5000×g离心5分钟。
(3)吸取5ml上清，转入50ml离心管中，加2ml凝集溶剂。
2、分相沉淀：加6.5ml 4℃预冷的分相溶剂，用吸管反复吹打混匀，室温静置5分钟后剧烈振摇混合均匀。4℃，≥5000×g离心5分钟，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到相间。
注意：分相溶剂能杀死蛋白质、病毒。为防止实验室污染，加入凝集溶剂和分相溶剂后勿先剧烈震摇，以免溅出，造成污染。宜用吸管吹打混匀，并等待分相溶剂作用5分钟杀死蛋白质、病毒颗粒后再剧烈振摇混合均匀。
3、二次沉淀：加5ml沉淀溶剂，混合均匀，4℃，≥5000×g离心3分钟，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到管底。
4、弃清留沉：倒置离心管丢弃上清，加5ml 4℃预冷的50％乙醇，轻轻转动离心管洗下沾在管壁上的溶液(勿搅动管底沉淀)。4℃，≥5000×g离心3分钟。倒置离心管丢弃上清，简短离心，用滴头吸尽残留的上清。注意，勿吸走管底沉淀。
沉淀的蛋白质、病毒颗粒应立即用于RNA纯化，或置-20℃保存。
(二)从从II类样品——血清、咳痰抽提液、鼻拭子抽提液或咽拭子抽提液中富集蛋白质、病毒颗粒
1、蛋白絮凝：释放蛋白质、病毒颗粒，加凝集溶剂
A.血清
取2ml血清，加入15ml离心管中，加0.8ml凝集溶剂。
B.咳痰
(1)收集咳痰，转入50ml离心管中。
(2)加3ml含1％乙酰半胱氨酸(acetylcysteine)的生理盐水或PBS，旋涡振荡3～10分钟(旋涡振荡时间视咳痰的粘稠度而定)，充分释放蛋白质、病毒颗粒。≥5000×g离心5分钟。
(3)吸取2ml上清，转入15ml离心管中，加0.8ml凝集溶剂。
C.鼻拭子
(1)将鼻拭子转入15ml离心管中。
(2)加3ml生理盐水或PBS，旋涡振荡1分钟充分释放蛋白质、病毒颗粒。用有齿镊夹持住鼻拭子，轻轻压在管壁上挤出残余抽提液，仔细取出(勿沾染到管的出口)，丢弃到含消毒液的废物缸中。
(3)吸取2ml溶液，转入15ml离心管中，加0.8ml凝集溶剂。
D.咽拭子
(1)将咽拭子转入50ml离心管中。
(2)加3ml生理盐水或PBS，反复搅动咽拭子1～2分钟充分释放蛋白质、病毒颗粒。将咽拭子轻轻压在管壁上，挤出残余抽提液。取出咽拭子并丢弃到含消毒液的废物缸中。
(3)吸取2ml溶液，转入15ml离心管中，若溶液体积不足2ml，加生理盐水或PBS补足到2ml；加0.8ml凝集溶剂。
2、分相沉淀：加2.5ml 4℃预冷的分相溶剂，用吸管反复吹打混匀，室温静置5分钟后剧烈振摇混合均匀。4℃，≥5000×g离心5分钟，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到相间。
3、二次沉淀：加2ml沉淀溶剂，混合均匀，4℃，≥5000×g离心3分钟，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到管底。
4、弃清留沉：同上。

Claims (5)

1、一种蛋白质、病毒富集方法，其特征在于在由以下操作步骤构成：
1)蛋白絮凝：稀释样品释放蛋白质、病毒颗粒，加凝集溶剂，使蛋白质、病毒颗粒和细胞形成凝集物，所述的蛋白质凝集溶剂是90～100％饱和度的硫酸铵；
2)分相沉淀：加分相溶剂，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到相间，所述的分相溶剂是异丙醇∶无水乙醇＝3～10∶1；
3)二次沉淀：加沉淀溶剂，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到管底，所述的蛋白质沉淀溶剂是10～30％聚二醇6000；
4)弃清留沉：弃上清，洗涤，离心，再弃上清，再离心，吸尽上清得富集液；
所述的样品体积：凝集溶剂体积∶分相溶剂体积∶沉淀溶剂体积＝5∶2～3∶6～8∶5～6。
2、根据权利要求1所述的蛋白质、病毒富集方法，其特征在于：所述的蛋白质凝集溶剂中还含有80mM NaH2PO4和80mM Na2HPO4；所述的分相溶剂中还有冰乙酸2～5ml/L；
3、根据权利要求1或2所述的蛋白质、病毒富集方法，其特征在于所述的分相溶剂和离心机均预冷。
4、根据权利要求1或2所述的蛋白质、病毒富集方法，其特征在于：在I类样品即漱口液，培养上清，尿液，粪便抽提液中的一种5ml中凝集溶剂加量是2ml；分相溶剂加量是6.5ml，沉淀溶剂加量是5ml；在II类样品即血清，咳痰抽提液，鼻拭子抽提液，咽拭子抽提液中的一种2ml中凝集溶剂加量是0.8ml；分相溶剂加量是2.5ml，沉淀溶剂加量是2ml。
5、根据权利要求3所述的蛋白质、病毒富集方法，其特征在于：在I类样品即漱口液，培养上清，尿液，粪便抽提液中的一种5ml中凝集溶剂加量是2ml；分相溶剂加量是6.5ml，沉淀溶剂加量是5ml；在II类样品即血清，咳痰抽提液，鼻拭子抽提液，咽拭子抽提液中的一种2ml中凝集溶剂加量是0.8ml；分相溶剂加量是2.5ml，沉淀溶剂加量是2ml。
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