CN104498445B - 一种从水体中高效浓缩病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从水体中高效浓缩病毒的方法。它是将待测水样去除杂质不溶物后，在其中加入足量的Mg²⁺和PO₄ ³⁺，以形成絮凝物沉淀待测水样中的病毒，然后再经负压抽滤过混合纤维滤膜，取下滤膜，用pH值3.5～4.5的溶液冲洗并溶解滤膜上的凝固物，得到洗涤液，洗涤液再经超滤浓缩，得到病毒浓缩液。本发明的方法除了能高浓缩效率的特点外，还有如下优点：一是快速：絮凝快，洗脱也快；二是比较简便：目前正电荷膜全部依靠进口，材料不易获得，应用本发明的方法，使用任何一种普通的微孔滤膜均可；三是可用于现场快速浓缩病毒：在现场采样时，不需要采取大量水样回到实验室进行检测，只需待水样絮凝静止沉降后，即可获得小体积的初步浓缩样品。

Description

一种从水体中高效浓缩病毒的方法

技术领域：

本发明属于病毒浓缩领域，具体涉及一种从水体中高效浓缩病毒的方法。

背景技术：

病毒感染性疾病的传播途径多种多样，但在许多病毒性疾病发生和流行过程中，水是病毒传播的一种重要媒介。许多病毒可以长期存活于水或污水中，并随水流动四处传播。水或污水中的病毒可以通过污染饮用水或食物而被人体摄入、或通过接触粘膜或伤口进入人体、也可以借助气溶胶被人体吸入导致感染。近年来，全球范围内由病毒污染水源引起疾病暴发事件不断发生。据报道，排入环境水体中的病毒多于140种，它们对消毒剂耐受力强、存活时间长、感染剂量低，易于穿透污水及供水处理屏障，进入各种环境水体甚至饮用水系统，威胁人体健康和自然生态系统。近年来，经由地表水和饮用水传播病毒各类疾病的报道很多，水源性传播病毒成为一个严重的公共安全问题。

由于环境水体中可能存在的病毒量少，因而必须通过浓缩数升至数千升的水样至数毫升，提高其中病毒的浓度后再加以检测。但水样中的杂质也一同被浓集，并将干扰后续的检测结果，如浓缩液中的有毒物质可毒害细胞使之死亡而无法感染病毒，其中的腐殖酸等有机物质可干扰PCR使模板无法扩增，因而使检测出现假阴性或假阳性结果。因此，采用有效的前处理方法，浓集病毒并去除干扰杂质是水中病毒检测的关键。

水中病毒的浓缩与细菌不同。细菌的浓缩可完全依靠机械阻留于膜上，而病毒因颗粒直径很小。一般多基于吸附、相分离、强离心沉淀、电泳及免疫化学等作用。已有报告的方法有二类：(1)吸附洗脱法。包括膜吸附法、可沉淀的盐类、氧化铁，聚电电解质吸附方法、氢氧化铝和植物絮凝吸附法和玻璃粉吸附法、相分离法等。(2)以病毒物理学特征为基础的方法，如超速离心法、反渗透法、电渗析法和脱水透析法等。在上述方法中一般认为超速离心及电渗析法等不仅需要一定的设备条件，而且检水量有限，作为辅助手段用于病毒再浓缩是可行的，但在大量水中病毒的浓缩检验中未能广泛应用。聚合物两相分离法适用于定量检验或分离小量浑浊水中的病毒。膜吸附法因操作简单，可检验相当大量的水样，而且随着滤材研究的发展，效能不断提高，研究与应用比较广泛。目前水病毒的浓缩主要采用吸附洗脱法，如阳电膜过滤法，氯化铝沉淀法等，这些方法的回收率都不太高，前者在60％左右，后者<50％。此外，两种方法在洗脱时均需要耗费较长的时间，而且正电荷滤膜需要进口，材料不易获得。特别是在用分子方法进行后续检测时，还存在有机洗脱液可能会分子反应过程产生抑制作用的现象。

发明内容：

本发明的目的是提供一种成本低廉，能够简便高效浓缩病毒的从水体中高效浓缩病毒的方法。

本发明的从水体中高效浓缩病毒的方法，其特征在于，将待测水样去除杂质不溶物后，在其中加入足量的Mg²⁺和PO₄ ³⁺，以形成絮凝物沉淀待测水样中的病毒，然后再经负压抽滤过混合纤维滤膜，取下滤膜，用pH值3.5～4.5的溶液冲洗并溶解滤膜上的凝固物，得到洗涤液，洗涤液再经超滤浓缩，得到病毒浓缩液。

所述的将待测水样去除杂质不溶物，其可以为离心，优选步骤为：待检测水样在3000r/min转速下离心，取上清。

优选，所述的Mg²⁺和PO₄ ³⁺的加入量相同，其终浓度为0.002～0.01mol/L，所述的pH值3.5～4.5的溶液优选为pH值4.0的溶液。

所述的加入Mg²⁺和PO₄ ³⁺，优选是分别以1mol/L MgCl₂和1mol/L Na₂HPO₄的形式加入，Mg²⁺和PO₄ ³⁺的终浓度都为0.002mol/L，所述的pH值4.0的溶液优选为pH值4.0的柠檬酸缓冲液。

利用本发明的方法能有效地浓缩病毒，其中以f2噬菌体为例，其平均回收率分别达到88.64％，而用正电荷滤膜法的回收率分别只有58.74％，因此本专利的方法显著高于通常所用的正电荷滤膜法，也高于目前国内外的报道。与其它方法相比，本发明的方法除了能高浓缩效率的特点外，还有如下优点：一是快速：絮凝快，洗脱也快；二是比较简便：目前正电荷膜全部依靠进口，材料不易获得，应用本发明的方法，使用任何一种普通的微孔滤膜均可；三是可用于现场快速浓缩病毒：在现场采样时，不需要采取大量水样回到实验室进行检测，只需待水样絮凝静止沉降后，即可获得小体积的初步浓缩样品。

附图说明：

图1是经本发明的方法浓缩处理后的诺如病毒检测结果，M：DNA marker，N：阴性对照，1：未经浓缩处理的阳性对照，2:10^-2稀释度100ul样品，3:10^-2稀释度50ul样品，4:10^-3稀释度100ul样品，5：10^-3稀释度50ul样品，6:10^-4稀释度100ul样品，7:10^-4稀释度50ul样品，8-9:10^-5稀释度各100ul和50ul样品；

图2是经正电荷滤膜法浓缩处理后的诺如病毒检测结果，M：DNA marker，N：阴性对照，1:10^-1稀释度100ul样品；2:10^-2稀释度100ul样品，3:10^-2稀释度50ul样品，4:10^-3稀释度100ul样品，5：10^-3稀释度50ul样品，6:10^-4稀释度100ul样品；

图3是经本发明的方法浓缩处理后的轮状病毒检测结果，M：DNA marker，N：阴性对照，1:10^-2稀释度100ul样品，2:10^-3稀释度100ul样品，3:10^-3稀释度50ul样品，4:10^-4稀释度100ul样品，5：10^-4稀释度50ul样品，6:10^-5稀释度100ul样品；

图4是经正电荷滤膜法浓缩处理后的轮状病毒检测结果，M：DNA marker，N：阴性对照，1:10^-2稀释度100ul样品，2:10^-3稀释度100ul样品，3:10^-3稀释度50ul样品，4:10^-4稀释度100ul样品，5：10^-4稀释度50ul样品。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1材料和方法

1.1实验材料

f2噬菌体和大肠杆菌(Escherichia coli)285。f2噬菌体原液的效价约为10⁹pfu/mL。

1.2镁离子絮凝法

1.2.1样品制备

取f2噬菌体原液用无菌蒸馏水按体积比1:10梯度稀释至10^-4，取1mL稀释液添加到1L灭菌的纯净水中(作为待检测水样)，取样测定f2噬斑数，作为浓缩前的样品f2噬斑数。

1.2.2f2噬菌体浓缩

待检水样在3000r/min转速下离心10min，取上清。①1L上清水样中加入2mL MgCl₂溶液(1mol/L)，再加入2mL Na₂HPO₄溶液(1mol/L)，充分搅拌均匀；②负压抽滤，过普通混合纤维滤膜(孔径0.45μm，直径50mm)；③取下滤膜，用约4mL 0.3mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液冲洗并溶解滤膜上的凝固物；④超滤：用15mL超滤管在7500r/min下离心1h，最后得到约为100μL的浓缩液，即得浓缩10000倍的病毒浓缩液。

1.2.3f2噬菌体浓缩

将上一步骤病毒浓缩液用无菌蒸馏水复原至1L，测定噬斑数，即为浓缩后样品回复的噬斑数，该噬斑数与浓缩前噬斑数之百分比即为回收率。

1.3f2噬菌体噬斑数测定方法

把融化的营养琼脂(琼脂含量1.5％)12mL-15mL倾入无菌平皿内作为底层，待凝固后加入被检样品1mL，再加入0.4mL培养至对数生长期的大肠杆菌(Escherichia coli)285，然后覆盖一层半固体营养琼脂(琼脂含量0.8％，约5mL-8mL)，轻度平面摇匀，37℃培养18h－24h，计数噬斑数量。

1.4洗脱液的pH值对镁离子絮凝法效果的影响

以f2噬菌体为模型进行研究。

首先配制不同pH值的柠檬酸缓冲液。取柠檬酸溶液及磷酸溶液各100mL(每种都相当于100mL 1mol/L的NaOH溶液)，加入3.54g原硼酸及343mL的1mol/L的NaOH溶液，加水至1L。从中取20mL，用一定量的0.1mol/L的HCl溶液调节pH值，加蒸馏水至100mL，分别得到pH值为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的柠檬酸缓冲液。

然后和之前的方法一样，对f2噬菌体进行添加回收试验，只是其中的柠檬酸缓冲液的pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，同时用4mL 0.1mol/L HCl作对照研究。比较不同pH值缓冲液对镁离子絮凝法效果的影响，确定优化的镁离子絮凝法条件。

1.5正电荷膜过滤法

水样添毒方法如前所述。取1L待测水样通过一阳电滤膜(Zetapore，孔径0.45μm，直径47mm)，然后用4mL含有1％小牛血清的甘氨酸缓冲液(50mmol/L，pH 9.5)洗脱30min,再用20μL的HCl调节pH至8.0，最后超滤浓缩至100μL。

2结果

2.1镁离子絮凝法对f2噬菌体浓缩效果的观察

f2噬菌体的添加回收试验进行了9次(用的是pH4.5的柠檬酸缓冲液洗脱)，添加回收试验的结果如表1所示。

表1镁离子絮凝法浓缩水中f2噬菌体效果观察

从表1中可以看出，镁离子絮凝法试验得出的f2的回收率在79.61％至97.14％之间，平均回收率为88.64％。

2.2正电荷滤膜法对f2噬菌体浓缩效果的观察

正电荷滤膜法对f2噬菌体浓缩试验结果如表2所示。

表2正电荷滤膜法浓缩水中f2噬菌体试验结果

从表2中可以看出，采用正电荷滤膜过滤浓缩后，f2噬菌体的回收率在52.53％至66.67％，平均回收率为58.74％。

2.3不同pH值的洗脱液对镁离子絮凝法效果影响的观察

在f2噬菌体添加回收试验过程中，对镁离子絮凝浓缩物分别用pH值为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的0.3mol/L柠檬酸缓冲液和0.1mol/L的HCl溶液洗脱，试验共进行3次，测得f2噬菌体的回收率如表3所示。

从表3中可以看出，洗脱液的pH值为4.0时，f2噬菌体的回收率最高，平均为96.3％，随着pH值降低，回收率也降低，pH值为3.5时，回收率为74.9％，而用0.1mol/L HCl(pH<2.0)洗脱时，回收率为0。当pH值在4.5时，回收率为91.08％，但当升高为5.0及5.5时，试验过程中发现该pH值条件下的缓冲液不能充分溶解镁离子絮凝物，即病毒未能充分洗脱，所以回收率只有68.03％和60.19％。因此，确定镁离子絮凝法中洗脱液的pH值为3.5～4.5，最优pH值为4.0。

表3洗脱液pH值对f2噬菌体回收率的影响结果

实施例2：

1、镁离子絮凝法与正电荷滤膜法浓缩水体诺如病毒的比较研究

1.1人工污染播毒

取100μL诺如病毒粪悬液，按10倍递度稀释至10^-5，各取每个稀释度100ul和50ul，分别添加到1L灭菌纯净水中。

1.2病毒浓缩

用镁离子絮凝法和正电荷滤膜法分别做浓缩回收试验，正电荷滤膜法同实施例1。镁离子絮凝法的步骤为：将各稀释度的加有诺如病毒粪悬液的灭菌纯净水在3000r/min转速下离心10min，取上清。①1L上清水样中加入2mL MgCl₂溶液(1mol/L)，再加入2mL Na₂HPO4溶液(1mol/L)，充分搅拌均匀；②负压抽滤，过普通混合纤维滤膜(孔径0.45μm，直径50mm)；③取下滤膜，用约4mL 0.3mol/L pH4.0的柠檬酸缓冲液冲洗并溶解滤膜上的凝固物；④超滤：用15mL超滤管在7500r/min下离心1h，最后得到约为100μL的浓缩液，即得浓缩10000倍的病毒浓缩液。

1.3RT-PCR检测

对回收后的病毒浓缩液用Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Kit试剂盒提取病毒RNA，然后做RT-PCR。检测引物采用JV12和JV13。上游引物JV12(+)：(4552-4572)5’-ATACCACTATGATGCAGATTA-3’，下游引物JV13(-)：(4858-4878)5’-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3’。反应条件为：

RT和PCR一步完成。反应体系为：2.5μL 10×PCR buffer、300μmol/L dNTP、20URNasin、引物各0.5μmol/L、MLV 200U、TaqE 1.5U、MgCl₂3.5mmol/L、RNA模板2.5μL，加水至25μL，42℃40min合成第一链cDNA；紧接着94℃5min；94℃40s，37℃90s，72℃40s，循环35次；72℃10min。扩增产物大小均为327bp。以不做添加回收试验的病毒稀释液作对照。

1.4结果验证：

取10μL反应产物加10μL在2.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系统观察扩增结果。阳性结果会扩增出一条327bp的条带。电泳图如图1和图2所示。

由电泳图可以看出，经镁离子絮凝法浓缩处理后，最低可检测到10^-4稀释度50ul的诺如病毒，而经正电荷滤膜浓缩处理后，最低只可检测到的10^-3稀释度50ul诺如病毒，因此，结果证明将镁离子絮凝法运用到水中诺如病毒的检测，浓缩效率是正电荷滤膜法的10倍，效果明显优于正电荷滤膜法。

实施例3：

1、镁离子絮凝法与正电荷滤膜法浓缩水体轮状病毒的比较研究

1.1人工污染播毒

取100μL阳性轮状病毒混悬液，按10倍递度稀释至10^-5，各取每个稀释度100ul和50ul，分别添加到1L灭菌纯净水中。

1.2病毒浓缩

用镁离子絮凝法和正电荷滤膜法分别做浓缩回收试验，过程同实施例2。

1.3RT-PCR检测

对回收后的病毒液用Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Kit试剂盒提取病毒RNA，然后做RT-PCR。检测引物采用上游引物5’-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3’，下游引物5’-GATCCTGTTGGCCATCC-3’。反应条件为：

RT和PCR一步完成。反应体系为：2.5μL 10×PCR buffer、300μmol/L dNTP、20URNasin、引物各0.5μmol/L、MLV 200U、TaqE 1.5U、MgCl₂3.5mmol/L、RNA模板2.5μL，加水至25μL，42℃40min合成第一链cDNA；紧接着94℃5min；94℃40s，50℃50s，72℃40s，循环30次；72℃10min。扩增产物大小均为392bp。以不做添加回收试验的病毒稀释液作对照。

1.4结果验证

取10μL反应产物加10μL在2.0％琼脂糖中电泳，在紫外成像系统观察扩增结果。阳性结果会扩增出一条392bp的条带。电泳图如图3和图4所示。

由电泳图可以看出，经镁离子絮凝法浓缩处理后，最低可检测到10^-4稀释度50ul的轮状病毒，而经正电荷滤膜浓缩处理后，最低可检测到10^-4稀释度100ul轮状病毒，因此，镁离子絮凝法的浓缩效率是正电荷滤膜法的两倍，效果明显优于正电荷滤膜法。

实施例4：

本实施例与实施例2基本相同，只是加入MgCl₂溶液(1mol/L)的量为10mL，加入Na₂HPO4溶液(1mol/L)的量为10mL，其他同实施例2。

最后经过RT-PCR检测证明，本发明的浓缩效率比正电荷滤膜法好。

Claims (2)

1.一种从水体中高效浓缩病毒的方法，其特征在于，将待测水样去除杂质不溶物后，在其中加入足量的Mg²⁺和PO₄ ^3- ，以形成絮凝物沉淀待测水样中的病毒，然后再经负压抽滤过混合纤维滤膜，取下滤膜，用pH值4的溶液冲洗并溶解滤膜上的凝固物，得到洗涤液，洗涤液再经超滤浓缩，得到病毒浓缩液；

所述的加入Mg²⁺和PO₄ ^3- ，其是分别以1mol/L MgCl₂和1mol/L Na₂HPO₄的形式加入，Mg²⁺和PO₄ ^3- 的终浓度都为0.002mol/L，所述的pH值4.0的溶液为pH值4.0的柠檬酸缓冲液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的将待测水样去除杂质不溶物，步骤为：待检测水样在3000r/min转速下离心，取上清。