CN109810951B

CN109810951B - 一种从活性污泥中提取富集噬菌体的方法

Info

Publication number: CN109810951B
Application number: CN201910280829.4A
Authority: CN
Inventors: 俞卓栋; 张智明; 朱亮; 徐向阳
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-04-09
Filing date: 2019-04-09
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2039-04-09
Also published as: CN109810951A

Abstract

本发明公开了一种从好氧颗粒污泥中高效提取富集噬菌体的方法。该方法按照以下步骤进行：(1)污泥研磨；(2)胞外多聚物水解；(3)超声/涡旋震荡(4)上清液提取；(5)二级超滤浓缩；(6)样品保存固定。该方法操作简便，反应条件温和，无有毒试剂使用，可有效解决颗粒污泥体系由于EPS包裹产生的提取效率低下，细菌胞溶导致的宿主DNA污染等问题，是一种高效可行的噬菌体提取方法。相比于传统使用PEG和盐析结合提纯噬菌体的方法相比，无需使用PEG和NaCl等药剂，提纯时间有原来24h缩短至6h左右，且所得样品盐浓度低，无需进一步透析除盐，所得的浓缩液可直接用于透射电镜，DNA提取，CsCl₂梯度离心等相关操作。

Description

一种从活性污泥中提取富集噬菌体的方法

技术领域

本发明涉及一种从活性污泥中提取噬菌体的方法，属于废水生物处理领域。

背景技术

噬菌体是细菌病毒的一种，是目前已知自然环境中丰度最大的生物体。烈性噬菌体通过吸附，注入，整合，装配，裂解五个步骤对宿主细菌完成捕食。近年来噬菌体逐渐应用于病原菌检测，细菌疾病控制，管道生物膜抑制方面，显示出巨大的潜力。活性污泥中噬菌体丰度可达自然水体噬菌体丰度的100-1000倍，具有巨大的资源潜力。然而，活性污泥是由复杂菌群以及胞外分泌物组成生物聚集体，其在污泥体系中的存在形式多样，与宿主菌的作用机制极为复杂，目前，未有可靠的方法能够高效地提取并富集污泥中的噬菌体。因此，研究高效稳定的噬菌体提取方法并建立评价体系是进一步发掘活性污泥生物资源，促进噬菌体研究与应用的重要保证。

发明内容

本发明的目的是提供一种从活性污泥中高效提取富集噬菌体的方法，通过酶解-超声-超滤等一系列操作，保证污泥提取效率的同时有效降低宿主DNA的污染,并设计不同的保存手段，以满足后续实验的多样要求。

本发明具体采用的技术方案如下：

一种从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，它包括以下步骤：

步骤1：使用细胞研磨器研磨污泥样品，使污泥样品分散；

步骤2：对步骤1处理后的样品利用糖化水解酶进一步水解，去除污泥样品中的EPS，降低EPS对噬菌体释放的影响；

步骤3：对步骤2处理后的样品采用超声和涡旋震荡交替进行的方式，将附着在污泥细菌表面的噬菌体分散到液相中；

步骤4：对步骤3处理后的样品进行离心分离，取离心后的上清液过0.22μm无菌滤膜，去除游离细菌；

步骤5：对步骤4得到的滤液利用DNA降解酶Dnase I去除宿主菌污染；步骤6：对步骤5处理后的滤液，利用50kDa的超滤离心管进行一级超滤浓缩；然后采用30kDa超滤管对一级超滤浓缩液进行二级超滤浓缩，得到噬菌体富集液；

步骤7：对最终富集液根据后续用途进行保存固定。

基于上述方案，各步骤中的参数以及材料可以采用如下优选方案：

优选的，步骤1中，污泥样品在研磨前，需取污泥样品测定其MLVSS，作为生物量的基本指标。

优选的，步骤3中，超声和涡旋震荡交替重复十轮，每轮超声时间为2min，旋涡震荡时间为10s，超声和旋涡震荡时间间隔为2s，超声功率为25W。

优选的，步骤4中，离心分离时离心机转速为3000rpm，离心时间为30分钟。

优选的，步骤5中，滤液中添加的Dnase I浓度为2000U/L，酶解反应时间为3h。

优选的，步骤6中，进行一级超滤浓缩时，先将步骤5处理后的滤液定量转移至50kDa的超滤离心管中，离心后弃去下管中的上清液，然后再重新转入等量的滤液继续离心，直至滤液全部超滤离心完毕。

优选的，步骤6中，一级超滤浓缩过程中，采用逐级提速的方法保证过滤压差，转速从3000rpm逐渐提升至3500rpm；二次超滤浓缩的转速为10000rpm。

优选的，步骤6中，滤液在一级超滤浓缩后，浓缩比不超过50：1。

优选的，步骤6中，当原始样本中组分较为复杂时，一级超滤浓缩后的浓缩液可在超滤管中重新稀释，震荡混匀后重复进行若干次一级超滤浓缩，然后再进行二级超滤浓缩。进一步优选为，将所得浓缩液用PBS超纯水稀释至10-15ml,重复进行进行一级超滤过程。

优选的，步骤7中，所述噬菌体富集液用于细胞实验，其保存固定方法为：向噬菌体富集液中添加甘油，至甘油含量为20wt.％，于4℃下保持活性。

优选的，步骤7中，所述噬菌体富集液用于分子测序，其保存固定方法为：向噬菌体富集液中添加戊二醛，至戊二醛含量为0.5wt.％，于液氮中急冻，可保存一年以上。

本发明的有益效果：

由于本发明采用了多种高效酶和膜材料过滤方法，使得化学试剂用量大大减少，操作时间短，反应条件温和，无有毒试剂使用，可有效解决颗粒污泥体系由于EPS包裹产生的提取效率低下，细菌胞溶导致的宿主DNA污染等问题，是一种高效可行的噬菌体提取方法。

附图说明

图1为从活性污泥中提取富集噬菌体的流程图。

图2为优化条件后对宿主菌污染的PCR检验。

图3本发明方法缩液和传统方法浓缩电镜对比图，其中a)为本发明的方法，b)为传统的PEG-NaCl盐析法。

具体实施方式

以下通过附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。

如图1所示，从活性污泥中提取噬菌体的方法包括以下步骤，(1)污泥研磨；(2)胞外多聚物水解；(3)超声/涡旋震荡(4)上清液提取；(5)二级超滤浓缩；(6)样品保存固定。

下面基于实施例进一步详细描述各步骤的实现方式，并展现本发明方法的技术效果。

步骤1：使用细胞研磨器研磨污泥样品，使污泥样品分散；

步骤5：对步骤4得到的滤液利用DNA降解酶Dnase I去除宿主菌污染；

步骤6：对步骤5处理后的滤液，利用50kDa的超滤离心管进行一级超滤浓缩，然后将超滤后的浓缩液在超滤管中重新稀释，震荡混匀；然后采用30kDa超滤管对一级超滤浓缩液的稀释液进行二次超滤浓缩，得到噬菌体富集液。

步骤7：对最终富集液根据后续用途进行保存固定。

实施例

本实施例的目的是从好氧颗粒污泥中高效提取噬菌体颗粒，具体按照以下步骤进行：

步骤1：活性污泥研磨

取活性污泥40ml，于15ml细胞研磨器中研磨，使污泥样品分散。每次研磨10ml，共计四次。最后用5ml PBS缓冲液清洗，将所有污泥研磨液以及缓冲液收集于45毫升离心管中，用于下一步酶解。

污泥样品在研磨前，可取污泥样品测定其MLVSS，作为生物量的基本指标。

步骤2：污泥EPS水解

利用淀粉酶水解上述污泥样品，去除污泥样品中的EPS，降低EPS对噬菌体释放的影响。污泥样品中的酶添加用量为试剂盒推荐用量的两倍。本实验中采用了生工生物工程(上海)股份有限公司制造的淀粉糖化酶(A618003)在本实施例中酶的用量为3000U/L。本步骤中，可以利用流式细胞仪测定最佳的提取效率。

步骤3：超声震荡

本步骤中的目的是将附着在污泥细菌表面的噬菌体分散到液相中，具体做法为：将上述酶解后的产物置于涡旋震荡仪，涡旋震荡10秒，使污泥重悬浮；然后置于冰水浴，并于超声破碎仪中超声震荡，参数设置为功率25W，超声2min。超声和涡旋震荡交替重复共十轮，每轮超声时间均为2min，旋涡震荡时间均为10s，超声和旋涡震荡时间间隔均为2s，共计超声震荡20min。

步骤4：收集提取液

将超声震荡后的污泥样品放置于离心机3000rpm离心30分钟，用移液枪移取上清液并用0.22微米无菌滤膜过滤，去除游离细菌，得到含噬菌体的滤液。

步骤5：Dnase I处理

利用Dnase I对上述滤液中宿主菌体基因组DNA进行去除，本实验采用的ThermoDNase I酶，酶所用浓度为2000U/L，酶解时间为3h。

步骤6：噬菌体浓缩

利用15ml超滤离心管(50kDa)对Dnase I处理处理后的滤液进行第一级超滤浓缩。第一级超滤浓缩做法为：将滤液用移液枪移取15ml置于上管中，于3000rpm转速在4℃离心10min，弃去下管中的上清液，用胶头滴管重新补充至上管中的溶液约至15ml,离心10min，直至全部滤液均浓缩完毕。过滤过程中，当过滤压差不足以完成过滤时，采用逐级提速的方法调整超滤离心管转速，即3000rpm转速不足时，逐渐调整成3200，3400，3450，3500rpm。最后，得到的超滤浓缩液约1mL。

然后将超滤后的浓缩液在超滤管中重新稀释，震荡混匀；然后对第一级超滤浓缩液的稀释液进行第二级超滤浓缩。第二级超滤浓缩采用0.5ml超滤管(30kDa)，做法为：将滤液0.4ml加入至超滤离心管中，于10000rpm转速下离心10min，再次移入0.4ml滤液，重复三次，至初滤液用尽，得到噬菌体富集液。将所得二次浓缩的富集液用20μl移液枪吸出，存至PCR管中。

本实施例获得的样品采用DNA提取试剂盒提取，最终所得DNA总量约为1.35μg。

利用PCR扩增方法，对本发明方法的提纯效果进行了检验。结果显示，本发明经过PCR富集，Dnase I酶降解10，30min后(2，3列)，PCR均无检测出宿主菌DNA(亮条带为宿主菌污染，2，3列为实验样本，左侧为不经Dnase I处理,右侧为不同宿主菌DNA)，表明本发明方法在有效富集噬菌体的同时可以避免宿主菌污染。

再将将本发明方法与传统方法(PEG-NaCl盐析法)的提取效果进行了比较，利用透射电镜进行观察，结果发现本发明方法在富集效率、提取纯度方面均远高于传统方法。如图3所示，在相同大小视野内，本发明方法噬菌体(白色点状)数量明显高于传统方法，且传统方法由于高浓度的化学试剂使用，导致样本内有大量晶体析出，影响噬菌体观察，可见本发明方法在提取效率，提取纯度上均具有优势。

步骤6：浓缩液的保存和对应用途

对最终富集液根据后续用途进行保存固定：

若富集液用于细胞实验，则对富集液添加甘油(甘油含量为20vt.％)后于4℃保存，以保持活性。

若富集液用于分子测序，则对富集液添加戊二醛(戊二醛含量为0.5vt.％)，于液氮急冻，可保存一年以上。

另外，样品也可以根据需要直接制成冻干粉。

由此可见，该方法操作简便，反应条件温和，无有毒试剂使用，可有效解决颗粒污泥体系由于EPS包裹产生的提取效率低下，细菌胞溶导致的宿主DNA污染等问题，是一种高效可行的噬菌体提取方法。相比于传统使用PEG和盐析结合提纯噬菌体的方法相比，无需使用PEG和NaCl等药剂，提纯时间有原来24h缩短至6h左右，且所得样品盐浓度低，无需进一步透析除盐，所得的浓缩液可直接用于透射电镜，DNA提取，CsCl₂梯度离心等相关操作。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：使用细胞研磨器研磨污泥样品，使污泥样品分散；

步骤5：对步骤4得到的滤液利用DNA降解酶Dnase I 去除宿主菌污染；滤液中添加的Dnase I浓度为2000U/L，酶解反应时间为3h；

步骤6：对步骤5处理后的滤液，利用50kDa的超滤离心管进行一级超滤浓缩；然后采用30kDa超滤管对一级超滤浓缩液进行二级超滤浓缩，得到噬菌体富集液；

步骤7：对最终富集液根据后续用途进行保存固定。

2.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤1中，污泥样品在研磨前，需取污泥样品测定其MLVSS，作为生物量的基本指标。

3.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤3中，超声和涡旋震荡交替重复十轮；每轮超声时间为2min，旋涡震荡时间为10s，超声和旋涡震荡时间间隔为2s，超声功率为25W。

4.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤4中，离心分离时离心机转速为3000rpm，离心时间为30分钟。

5.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤6中，进行一级超滤浓缩时，先将步骤5处理后的滤液定量转移至50kDa的超滤离心管中，离心后弃去下管中的上清液，然后再重新转入等量的滤液继续离心，直至滤液全部超滤离心完毕；滤液在一级超滤浓缩后，浓缩比不超过50：1。

6. 如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤6中，一级超滤浓缩过程中，采用逐级提速的方法保证过滤压差，转速从3000rpm逐渐提升至3500rpm；二级超滤浓缩的转速为10000rpm。

7.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤6中，一级超滤浓缩后的浓缩液可在超滤管中重新稀释，震荡混匀后重复进行若干次一级超滤浓缩，然后再进行二级超滤浓缩。

8. 如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤7中，所述噬菌体富集液用于细胞实验，其保存固定方法为：向噬菌体富集液中添加甘油，至甘油含量为20 vt.%，于4℃下保持活性。

9. 如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤7中，所述噬菌体富集液用于分子测序，其保存固定方法为：向噬菌体富集液中添加戊二醛，至戊二醛含量为0.5 vt.%，于液氮中急冻，可保存一年以上。