CN105274033A - 一种高效去除大型海藻表面附生微生物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于海藻生物技术领域，涉及一种高效去除大型海藻表面附生微生物的方法。具体通过石英砂与待处理大型海藻共震，去除待处理大型海藻表面附生微生物。采用本发明能高效、彻底清除大型海藻表面附生微生物，同时对内生微生物不具干扰。可用于海藻内共生微生物的分离纯化及其活性天然产物研究。

Description

一种高效去除大型海藻表面附生微生物的方法

技术领域

本发明属于海藻生物技术领域，涉及一种高效去除大型海藻表面附生微生物的方法。

背景技术

大型海藻属于低等植物，主要包括褐藻、红藻和绿藻。其中许多经济种类是人工栽培的对象，例如褐藻类的海带(Saccharinaspp.)、裙带菜(Undariapinnatifida)、羊栖菜(Sargassumfusiforme)，红藻类的紫菜(Pyropiaspp.)、红毛菜(Bangiaspp.)、江蓠(Gracilariaspp.)、石花菜(Gelidiumspp.)、麒麟菜(Eucheumaspp.)，以及绿藻类的浒苔与石莼(Ulvaspp.)。

大型海藻不仅可做为健康食品(如紫菜、红毛菜、海带、裙带菜、浒苔)，还可用于提取制备碘、甘露醇、藻胶等重要化工原料。另外，近年研究发现，大型海藻还是细菌、放线菌、真菌等海洋微生物的重要宿主，其共附生微生物可以产生丰富的结构新颖、活性独特的次级代谢产物，是药物先导化合物的重要资源宝库。近年来，从藻栖真菌中得到的化合物和新颖化合物分别占到海洋真菌全部化合物及新颖化合物总数的24％-27％,从藻栖细菌中也得到了如细菌素、生物酶、大环内酯等具有特殊活性的次级代谢产物。利用分离纯化的海藻共附生微生物进行规模发酵与提取纯化，已经成为获得新化合物的重要手段。

海藻共附生微生物既包括存在于藻细胞表面的附生微生物，也包括存在于藻细胞内部的内共生微生物。高等植物共附生微生物及其次生代谢产物的研究发现，与附生微生物相比，内共生微生物与宿主之间存在着更加高度依赖的互利关系。宿主给内共生微生物提供营养，内共生微生物则分泌植物激素刺激宿主生长，还可产生一些抗生性的次生代谢产物帮助宿主抵抗外界病菌及虫害，其中，部分次级代谢产物已证实具有突出的药用价值，例如，原产于红豆杉等少数珍稀植物的高效抗肿瘤药物紫杉醇，现已证实来自红豆杉的内生真菌。同样，藻类相关研究中也发现，与藻体体表的附生微生物相比，内共生微生物不易受到外界环境干扰，与藻类宿主的特异性更加明显，相互作用更加密切，从中获得独特和新颖化合物的潜力也具显著优势，因此，海藻内共生微生物的分离纯化得到了普遍关注。

为了获得大型海藻内共生微生物的纯培养，必须建立一种高效清除体表附生微生物的方法。现有的方法主要包括酶法、化学法和物理法等几种解决方法。由于海藻附生微生物并非仅仅简单地附着于细胞表面，而是通过多糖、蛋白、核酸等大分子网状结构与宿主细胞建立相对紧密的联系，因此，常规的温和方法难以做到有效清除，会残留大量的附生微生物。例如，玻璃珠与藻类共震荡、超声波处理等物理方法对内生微生物影响较小，但是已经有研究表明无法将附生微生物去除干净。相反，由于海藻藻体往往比较脆弱，使用剧烈的方法又会导致细胞的破裂、或者内生微生物的杀伤。例如，化学方法中的漂白粉处理能够将附生微生物去除干净，但是会对内共生微生物产生严重影响，甚至完全杀灭。而酶法普遍需要经过高温的酶促处理，同样会对内共生微生物的多样性组成产生显著影响。

因此，为了满足大型海藻内共生微生物次级代谢产物研究与制备的要求，必须要开发一种既能将附生微生物高效彻底清除，同时对内生微生物不具干扰的新方法，兼顾两方面的平衡。

发明内容

针对上述突出问题，本发明的目的是提供一种高效、彻底去除大型海藻表面附生微生物的方法。

为实现上述目的，本发明技术方案如下：

一种高效去除大型海藻表面附生微生物的方法，通过石英砂与待处理大型海藻共震，去除待处理大型海藻表面附生微生物。

进一步的说，研磨筛选125-250μm粒径的石英砂,而后将过量的石英砂与海藻藻体混合(石英砂与海藻藻体按照质量比为10:1—20:1)，混合后在3200rpm条件下震荡2×15min，利用震荡彻底清除海藻表面附生微生物，并保存完好的细胞。

上述震荡结束后，将藻体与石英砂分离，无菌海水冲洗后研磨藻体并用适合培养基培养，即可获得藻类内共生微生物纯培养。

进一步的是，清除附生微生物后的海藻材料用于内共生微生物的分离；或用于无附生微生物海藻材料的获得与培养；震荡后的清洗液经收集过滤用于附生微生物的组成分析或分离纯化。

所述石英砂为普通商品化石英砂。所述大型海藻为海洋绿藻、红藻或褐藻。所述附生与内共生微生物为细菌、放线菌、真菌。

与现有方法相比，本发明提出了一种新思路，具有如下有益效果：

1.本发明技术不依赖任何商品化的酶制剂或生化试剂。仅以普通石英砂为原料，通过研磨并经筛选获得特定粒径的石英砂，成本低廉，易于大批量制备。

2.本发明对海藻表面附生微生物的清除非常高效，一般只需通过藻体与石英砂共震荡处理30分钟就可以彻底清除藻类附生微生物，既要将外生菌彻底去除，又要保持细胞完好，同时，对藻类内共生微生物几无影响，兼顾了两方面的要求。而现有方法不仅高度依赖商品化的酶和化学试剂，而且效果不理想，温和方法不能完全清除附生微生物，而剧烈方法又对内生微生物造成了严重杀伤，不能满足要求。

3.本发明适用的海藻材料非常广泛，不仅适用于新鲜的海藻材料(图1，o4)，也适用于冻存海藻材料(图2，o5)。

4.本发明可满足多种研究需求，清除附生微生物后的海藻材料不仅可用于内共生微生物的分离，也可用于无附生微生物海藻材料的获得与培养，另外，震荡后的清洗液还可经收集过滤用于附生微生物的组成分析或分离纯化。

附图说明

图1为扫描电镜表征各种处理方法对海藻附生微生物的去除效果(a：鲜浒苔，未处理；b：冷冻浒苔，未处理；c：溶菌酶处理组；d：木瓜蛋白酶处理组；e：蜗牛酶处理组；f：纤维素酶处理组；g：溶菌酶+木瓜蛋白酶+蜗牛酶处理组；h：多酶清洗剂处理组；i：蛋白酶K处理组；j：酒精处理组；k：漂白粉处理组；l：UNSETbuffer处理组；m：超声波处理组；n：玻璃珠涡旋振荡处理组；o1：60-120μm石英砂震荡2×1h；o2：125-250μm石英砂振荡2×1h；o3：125-250μm石英砂振荡2×30min；o4：125-250μm石英砂振荡2×15min；o5：o4条件应用于冻存浒苔；p：o4条件应用于冻存浒苔其它株系；q：o4条件应用于鲜浒苔其它株系；r：o4条件应用于扁浒苔；s：o4条件应用于缘管浒苔；t：玻璃珠与125-250μm石英砂。自a至s，标尺为10μm；t中标尺为1mm)。

图2为DGGE方法分析各处理组细菌群落结构(m、a、k、i、l、o4：同图1；u：o4组震荡后的清洗液经滤膜过滤后提取DNA，代表附生菌。黑色箭头示内共生与附生菌存在差异的条带)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法及该方法所达到的效果作进一步详细说明。

本发明利用研磨和筛选得到特定粒径范围的石英砂，通过石英砂与海藻共震荡来彻底去除海藻表面附生微生物。采用本发明能高效、彻底清除大型海藻表面附生微生物，同时对内生微生物不具干扰。可用于海藻内共生微生物的分离纯化及其活性天然产物研究。

实施例1：石英砂法彻底清除大型绿藻浒苔(U.prolifera)的附生微生物

浒苔是一种单层细胞管状藻体，藻体较脆弱。除了本发明石英砂法，共对照比较酶法、化学法和物理法三类共12种方法对新鲜浒苔附生微生物的去除效果。通过扫描电镜观察确定浒苔附生微生物是否去除干净，应用变形梯度凝胶电泳(DGGE)检测各种方法对浒苔内生微生物的影响。

共试验7种酶法，首先配制2mg/ml的溶菌酶、木瓜蛋白酶、蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶+木瓜蛋白酶+蜗牛酶(每种酶浓度均为2mg/ml)以及蛋白酶K，多酶清洗剂系购买成品(3M，Australia)。各种酶的处理条件分别为：溶菌酶，37℃×1h；木瓜蛋白酶，55℃×30min；蜗牛酶，37℃×1h；纤维素酶，25℃×2h；溶菌酶+木瓜蛋白酶+蜗牛酶，37℃×1h；多酶清洗剂，20℃×2h；蛋白酶K，60℃×30min。

共试验3种化学方法，配制75％的酒精，处理条件为：20℃×5min；配制3％的次氯酸钠溶液，处理条件为：20℃×30s；配制UNESTbuffer溶液，成分为8M的尿素和2％的SDS，处理条件为：55℃×15min。

共试验2种物理方法，超声波清洗仪处理条件为40kHz×15min；购买120-250μm规格的玻璃珠(Bio-Rad，美国)，取浒苔约0.03g藻体与0.3g玻璃珠于1.5mlEppendorf离心管中混合，加入1ml灭菌海水，在3200rpm条件下震荡2×20min。

针对本发明——石英砂法，通过研磨商品化石英砂并经过系列孔径规格的标准检验筛进行筛选，分别获得60-125μm与125-250μm共两种粒径范围的石英砂，取浒苔约0.03g藻体与0.3g上述特定粒径的石英砂于1.5mlEppendorf离心管中混合，加入1ml灭菌海水，3200rpm条件下震荡2×1h。

扫描电镜观察结果表明，酶法中，溶菌酶、木瓜蛋白酶、蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶+木瓜蛋白酶+蜗牛酶、多酶清洗剂均难以将浒苔附生微生物清除干净(图1，c,d,e,f,g，h)；只有蛋白酶K能够达到理想效果(图1，i)，但该方法需要经过高温处理，DGGE检测发现，这会严重影响浒苔内共生微生物的组成(图2，i)。化学方法中，酒精不能完全去除附生微生物(图1，j)；漂白粉的去除效果则非常理想(图1，k)，但是，其强氧化性对内共生微生物几乎造成全部杀伤(图2，k)；UNSETbuffer的效果与酶法中的蛋白酶K类似，虽然可以将附生微生物去除干净(图1，l)，但高温处理也严重影响到了浒苔的内共生微生物(图2，l)。物理方法中，玻璃珠与超声波法处理过后，海藻表面仍有大量附生微生物的存在(图1，m，n)。

针对本发明——石英砂法，电镜观察发现，60-125μm与125-250μm两种粒径范围的石英砂与浒苔在3200rpm条件下共震荡2×1h均可以完全清除浒苔附生微生物，但藻细胞有一定程度破损(图1，o1，o2)，且60-125μm规格组细胞破损更加严重。因此，选择125-250μm粒径范围的石英砂，进一步优化发现，缩短作用时间至2×15min即可以完全清除浒苔附生微生物，且对藻细胞几无损害。该条件同样适用于冻存的海藻材料(图1，o5)，以及不同时间地点采集的其它同种海藻材料(图1，p，q)。

实施例2：石英砂法彻底清除大型绿藻扁浒苔(U.compressa)的附生微生物

取扁浒苔约0.03g藻体与0.3g上述获得125-250μm粒径范围的石英砂于1.5mlEppendorf离心管中混合，加入1ml灭菌海水，在3200rpm条件下震荡2×15min，得到了附生微生物已完全清除、同时对藻细胞无影响的理想结果(图1，r)。

实施例3：石英砂法彻底清除大型绿藻缘管浒苔(U.linza)的附生微生物

取缘管浒苔约0.03g藻体与0.3g上述获得125-250μm粒径范围的石英砂于1.5mlEppendorf离心管中混合，加入1ml灭菌海水，在3200rpm条件下震荡2×15min，得到了附生微生物已完全清除、同时对藻细胞无影响的理想结果(图1，s)。

实施例4：石英砂法彻底清除大型褐藻海带(Saccharinajaponica)的附生微生物

取海带孢子体约0.03g藻体与0.3g上述获得125-250μm粒径范围的石英砂于1.5mlEppendorf离心管中混合，加入1ml灭菌海水，在3200rpm条件下震荡2×15min，得到了附生微生物已完全清除、同时对藻细胞无影响的理想结果，与石莼属绿藻相比，褐藻的叶状体藻体普遍更加厚实坚韧，因此石英砂对细胞的损伤更轻微。

实施例5：石英砂法彻底清除大型红藻江蓠(Gracilariasp.)的附生微生物

取江蓠约0.03g叶状藻体与0.3g上述获得125-250μm粒径范围的石英砂于1.5mlEppendorf离心管中混合，加入1ml灭菌海水，在3200rpm条件下震荡2×15min，得到了附生微生物已完全清除、同时对藻细胞无影响的理想结果，与石莼属绿藻相比，大型红藻的叶状体藻体略为更加坚韧，因此石英砂对细胞的损伤也较轻微。

Claims (5)

1.一种高效去除大型海藻表面附生微生物的方法，其特征在于：通过石英砂与待处理大型海藻共震，去除待处理大型海藻表面附生微生物。

2.按权利要求1所述的高效去除大型海藻表面附生微生物的方法，其特征在于：研磨筛选125-250μm粒径的石英砂,而后将过量的石英砂与海藻藻体混合，混合后在3200rpm条件下震荡2×15min，利用震荡彻底清除海藻表面附生微生物。

3.按权利要求1或2所述的去除大型海藻表面附生微生物的方法，其特征在于：震荡结束后，将藻体与石英砂分离，无菌海水冲洗后研磨藻体并用适合培养基培养，即可获得藻类内共生微生物纯培养。

4.按权利要求1或2所述的去除大型海藻表面附生微生物的方法，其特征在于：所述石英砂为普通商品化石英砂。

5.按权利要求1或2所述的去除大型海藻表面附生微生物的方法，其特征在于：所述大型海藻为海洋绿藻、红藻或褐藻。