CN106754399B - 暗色环纹炭团菌的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种暗色环纹炭团菌的分离方法，包括以下步骤：步骤一、取三七的茎部，洗净，消毒后去除表皮组织，加入无菌水研磨并稀释得到稀释液；取稀释液于改良的PDA培养基上分离培养得到多个菌落；再将多个菌落在改良的PDA培养基上进行纯化培养得多种菌株，然后移至改良的PDA培养基上增殖培养后，保存；步骤二、将步骤一中保存的多种菌株分别和三七黑斑病病原菌进行对峙培养，其抑制率大于或等于90％的菌株即为暗色环纹炭团菌。本发明具有分离方法简单，易操作，分离得到的暗色环纹炭团菌对三七灰霉病、三七圆斑病、苦玄参褐斑病、艾纳香条斑病、广西莪术叶斑病、草豆蔻叶斑病和罗汉果斑枯病等病原菌菌丝抑制率强的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种暗色环纹炭团菌的分离方法。
背景技术
三七具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效，是一种中国传统名贵药材。近年来，对三七原材料的需求日益增长，但是栽培过程中的真菌病害严重影响了三七生长。三七黑斑病、能侵染三七植株和地下根系，以茎、叶、花轴受害较重，根部感染后呈褐色湿腐状，四季均可发生。三七圆斑病可为害植株各个部位，叶片发病初期叶背面呈现黄色小点，在天气潮湿或连续阴雨天，迅速扩大成透明状圆形，可引起芽腐和茎基腐。三七灰霉病以危害叶为主，多从下部老叶的叶尖或近地部分叶柄发病，灰褐色病斑，腐烂。在广西三七的传统产区，由于低海拔及高温多湿的气象条件，这种病害往往是同时发生的，造成了三七的大量减产甚至绝收，给种植户带来了巨大的经济损失。
目前，在三七种植上，防治真菌病害过度依赖化学农药，大量化学农药的使用不仅影响了三七的品质，也造成了三七药材的大量农药残留。因此，开展生物防治三七真菌病害对三七产业的可持续发展是非常迫切和必要的。为此筛选出能同时拮抗这些病害的拮抗菌具有重大意义。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种暗色环纹炭团菌的分离方法，通过此方法首次在三七中分离得到暗色环纹炭团菌，且分离得到的暗色环纹炭团菌对三七灰霉病、三七圆斑病和三七黑斑病病原菌菌丝具有很强的抑制作用，同时还对苦玄参褐斑病、艾纳香条斑病、广西莪术叶斑病、草豆蔻叶斑病和罗汉果斑枯病病原菌菌丝具有很高的抵制率。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种暗色环纹炭团菌的分离方法，暗色环纹炭团菌是从三七中分离获得。
优选的是，暗色环纹炭团菌是从三七的茎部分离获得。
优选的是，包括以下步骤：
步骤一、取三七的茎部，用流水将其冲洗干净，进行无菌消毒处理，在无菌条件下去除表皮组织，加入无菌水研磨得到研磨液，再用无菌水将研磨液稀释至其体积的100～1000倍，得到稀释液；取稀释液涂布于改良的PDA培养基上，置于25～28℃的培养箱中分离培养42～54h，得到多个菌落；再将多个菌落在改良的PDA培养基上进行纯化培养42～54h，培养温度为25～28℃，得多种菌株，然后将获得的多种菌株转移至改良的PDA培养基上增殖培养42～54h，培养温度为25～28℃，然后置于4℃环境下保存，备用；
其中所述改良的PDA培养基包括PDA、0.04～0.1mg琥珀酸钠和100～150mL的三七茎叶原浆；
步骤二、将步骤一中保存的多种菌株分别和三七黑斑病病原菌进行对峙培养3～5d，对峙培养温度为25～28℃，其抑制率大于或等于90％的菌株即为暗色环纹炭团菌。
优选的是，无菌消毒处理具体为：用质量分数为75％的酒精浸泡2～5min，酒精要盖过三七的茎部，然后将三七的茎部移至质量分数为1％的次氯酸钠溶液中浸泡3～8min，次氯酸钠溶液要盖过三七的茎部，再用无菌水冲洗4～6次。
优选的是，在无菌消毒处理之前还包括对三七的茎部进行预处理：将三七的茎部用质量分数为15％的魔芋粉溶液在30～40℃下浸泡15～20min，魔芋粉溶液要盖过三七的茎部，取出沥干后再在三七的茎部表面涂上植物油。
优选的是，所述植物油为大豆油或者玉米油或者椰子油。
优选的是，步骤一中三七茎叶原浆的制备方法：将三七的茎和叶放入研钵中，加入冰水研磨30min，然后加入浓度均为10μmol/L的胱氨酸溶液、苏氨酸溶液、白氨酸溶液和赖氨酸溶液，置于超声波中以60kHz超声频率处理40min，再用研钵研磨10min，置于超声波中以60kHz超声频率处理20min，过滤即得，保存在4℃环境中，备用；
其中三七的茎、叶、冰水、胱氨酸溶液、苏氨酸溶液、白氨酸溶液和赖氨酸溶液的质量体积比例为1g:1g:10mL:1mL:1mL:1mL:1mL。
本发明还提供了一种采用上述分离方法获得的暗色环纹炭团菌的应用，在防治三七灰霉病、三七圆斑病、苦玄参褐斑病、艾纳香条斑病、广西莪术叶斑病、草豆蔻叶斑病和罗汉果斑枯病中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、首次从三七中分离得暗色环纹炭团菌；
第二、在PDA培养基中加入琥珀酸钠和三七茎叶原浆，琥珀酸钠可以促进暗色环纹炭团菌吸收营养物质，三七茎叶原浆可以提供暗色环纹炭团菌繁殖所需要的活性物质，两者结合可以加快暗色环纹炭团菌繁殖的速度，在相同培养时间内得到更多其菌体；
第三、对三七的茎部消毒处理前，采用魔芋粉溶液浸泡和涂抹植物油的方法，可以在三七的茎表面形成一层保护膜，使其在消毒处理过程中，防止其它化学物质进入三七的茎内部，保护其内部菌的活性，有利于暗色环纹炭团菌的分离；
第四、制备三七茎叶原浆时，加入胱氨酸溶液、苏氨酸溶液、白氨酸溶液和赖氨酸溶液并进行超声处理，可以促使三七茎叶原浆中活性物质的流出，并在低温环境中和氨基酸作用下保持其活性，降低活性的损失；
第五、通过本发明方法分离获得的暗色环纹炭团菌对三七灰霉病病原菌、三七圆斑病病原菌、苦玄参褐斑病病原菌、艾纳香条斑病病原菌、广西莪术叶斑病病原菌、草豆蔻叶斑病病原菌和罗汉果斑枯病病原菌菌丝具有极强的抑制作用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例1>
一、暗色环纹炭团菌的分离方法，包括以下步骤：
步骤一、取三七的茎部，用流水将其冲洗干净，进行无菌消毒处理，在无菌条件下去除表皮组织，加入无菌水研磨得到研磨液，再用无菌水将研磨液稀释至其体积的1000倍，得到稀释液；取稀释液涂布于改良的PDA培养基上，置于28℃的培养箱中分离培养48h，得到多个菌落；再将多个菌落在改良的PDA培养基上进行纯化培养48h，培养温度为28℃，得多种菌株，然后将获得的多种菌株转移至改良的PDA培养基上增殖培养48h，培养温度为28℃，然后置于4℃环境下保存，备用；其中所述改良的PDA培养基包括PDA、0.05mg琥珀酸钠和100mL的三七茎叶原浆；
步骤二、将步骤一中保存的多种菌株分别和三七黑斑病病原菌进行对峙培养5d，对峙培养温度为28℃，筛选出抑制率大于或等于90％的菌株，即为暗色环纹炭团菌；
其中，无菌消毒处理具体为：用质量分数为75％的酒精浸泡2min，酒精要盖过三七的茎部，然后将三七的茎部移至质量分数为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5min，次氯酸钠溶液要盖过三七的茎部，再用无菌水冲洗4次。
<实施例2>
一、暗色环纹炭团菌的分离方法，包括以下步骤：
步骤一、取三七的茎部，用流水将其冲洗干净，进行无菌消毒处理，在无菌条件下去除表皮组织，加入无菌水研磨得到研磨液，再用无菌水将研磨液稀释至其体积的100倍，得到稀释液；取稀释液涂布于改良的PDA培养基上，置于25℃的培养箱中分离培养42h，得到多个菌落；再将多个菌落在改良的PDA培养基上进行纯化培养42h，培养温度为25℃，得多种菌株，然后将获得的多种菌株转移至改良的PDA培养基上增殖培养42h，培养温度为25℃，然后置于4℃环境下保存，备用；
其中所述改良的PDA培养基包括PDA、0.04mg琥珀酸钠和100mL的三七茎叶原浆；
步骤二、将步骤一中保存的多种菌株分别和三七黑斑病病原菌进行对峙培养3d，对峙培养温度为25℃，筛选出抑制率大于或等于90％的菌株，经DNA鉴定后，确定为暗色环纹炭团菌。
其中，无菌消毒处理具体为：用质量分数为75％的酒精浸泡2min，酒精要盖过三七的茎部，然后将三七的茎部移至质量分数为1％的次氯酸钠溶液中浸泡3min，次氯酸钠溶液要盖过三七的茎部，再用无菌水冲洗4次。
<实施例3>
一、暗色环纹炭团菌的分离方法，包括以下步骤：
步骤一、取三七的茎部，用流水将其冲洗干净，进行无菌消毒处理，在无菌条件下去除表皮组织，加入无菌水研磨得到研磨液，再用无菌水将研磨液稀释至其体积的1000倍，得到稀释液；取稀释液涂布于改良的PDA培养基上，置于28℃的培养箱中分离培养54h，得到多个菌落；再将多个菌落在改良的PDA培养基上进行纯化培养54h，培养温度为28℃，得多种菌株，然后将获得的多种菌株转移至改良的PDA培养基上增殖培养54h，培养温度为28℃，然后置于4℃环境下保存，备用；
其中所述改良的PDA培养基包括PDA、0.1mg琥珀酸钠和150mL的三七茎叶原浆；
步骤二、将步骤一中保存的多种菌株分别和三七黑斑病病原菌进行对峙培养5d，对峙培养温度为28℃，筛选出抑制率大于或等于90％的菌株，经DNA鉴定后，确定为暗色环纹炭团菌。
其中，无菌消毒处理具体为：用质量分数为75％的酒精浸泡5min，酒精要盖过三七的茎部，然后将三七的茎部移至质量分数为1％的次氯酸钠溶液中浸泡8min，次氯酸钠溶液要盖过三七的茎部，再用无菌水冲洗6次。
<实施例4>
一、暗色环纹炭团菌的分离方法，包括以下步骤：
步骤一、取三七的茎部，用流水将其冲洗干净，进行无菌消毒处理，在无菌条件下去除表皮组织，加入无菌水研磨得到研磨液，再用无菌水将研磨液稀释至其体积的1000倍，得到稀释液；取稀释液涂布于改良的PDA培养基上，置于28℃的培养箱中分离培养48h，得到多个菌落；再将多个菌落在改良的PDA培养基上进行纯化培养48h，培养温度为28℃，得多种菌株，然后将获得的多种菌株转移至改良的PDA培养基上增殖培养48h，培养温度为28℃，然后置于4℃环境下保存，备用；
其中所述改良的PDA培养基包括PDA、0.05mg琥珀酸钠和100mL的三七茎叶原浆；
步骤二、将步骤一中保存的多种菌株分别和三七黑斑病病原菌进行对峙培养5d，对峙培养温度为28℃，筛选出抑制率大于或等于90％的菌株，经DNA鉴定后，确定为暗色环纹炭团菌。
其中，无菌消毒处理具体为：用质量分数为75％的酒精浸泡2min，酒精要盖过三七的茎部，然后将三七的茎部移至质量分数为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5min，次氯酸钠溶液要盖过三七的茎部，再用无菌水冲洗4次。
其中，在无菌消毒处理之前还包括对三七的茎部进行预处理：将三七的茎部用质量分数为15％的魔芋粉溶液在30℃下浸泡20min，魔芋粉溶液要盖过三七的茎部，取出沥干后再在三七的茎部表面涂上大豆油。
其中，步骤一中三七茎叶原浆的制备方法具体为：将三七的茎和叶放入研钵中，加入冰水研磨30min，然后加入浓度均为10μmol/L的胱氨酸溶液、苏氨酸溶液、白氨酸溶液和赖氨酸溶液，置于超声波中以60kHz超声频率处理40min，再用研钵研磨10min，置于超声波中以60kHz超声频率处理20min，过滤即得，保存在4℃环境中，备用；
其中三七的茎、叶、冰水、胱氨酸溶液、苏氨酸溶液、白氨酸溶液和赖氨酸溶液的质量体积比例为1g:1g:10mL:1mL:1mL:1mL:1mL。
<实施例5>
一、暗色环纹炭团菌的分离方法，包括以下步骤：
步骤一、取三七的茎部，用流水将其冲洗干净，进行无菌消毒处理，在无菌条件下去除表皮组织，加入无菌水研磨得到研磨液，再用无菌水将研磨液稀释至其体积的100倍，得到稀释液；取稀释液涂布于改良的PDA培养基上，置于25℃的培养箱中分离培养42h，得到多个菌落；再将多个菌落在改良的PDA培养基上进行纯化培养42h，培养温度为25℃，得多种菌株，然后将获得的多种菌株转移至改良的PDA培养基上增殖培养42h，培养温度为25℃，然后置于4℃环境下保存，备用；
其中所述改良的PDA培养基包括PDA、0.04mg琥珀酸钠和100mL的三七茎叶原浆；
步骤二、将步骤一中保存的多种菌株分别和三七黑斑病病原菌进行对峙培养3d，对峙培养温度为25℃，筛选出抑制率大于或等于90％的菌株，经DNA鉴定后，确定为暗色环纹炭团菌。
其中，无菌消毒处理具体为：用质量分数为75％的酒精浸泡2min，酒精要盖过三七的茎部，然后将三七的茎部移至质量分数为1％的次氯酸钠溶液中浸泡3min，次氯酸钠溶液要盖过三七的茎部，再用无菌水冲洗4次。
其中，在无菌消毒处理之前还包括对三七的茎部进行预处理：将三七的茎部用质量分数为15％的魔芋粉溶液在30℃下浸泡15min，魔芋粉溶液要盖过三七的茎部，取出沥干后再在三七的茎部表面涂上椰子油。
其中，步骤一中三七茎叶原浆的制备方法具体为：将三七的茎和叶放入研钵中，加入冰水研磨30min，然后加入浓度均为10μmol/L的胱氨酸溶液、苏氨酸溶液、白氨酸溶液和赖氨酸溶液，置于超声波中以60kHz超声频率处理40min，再用研钵研磨10min，置于超声波中以60kHz超声频率处理20min，过滤即得，保存在4℃环境中，备用；
其中三七的茎、叶、冰水、胱氨酸溶液、苏氨酸溶液、白氨酸溶液和赖氨酸溶液的质量体积比例为1g:1g:10mL:1mL:1mL:1mL:1mL。
<实施例6>
一、暗色环纹炭团菌的分离方法，包括以下步骤：
步骤一、取三七的茎部，用流水将其冲洗干净，进行无菌消毒处理，在无菌条件下去除表皮组织，加入无菌水研磨得到研磨液，再用无菌水将研磨液稀释至其体积的1000倍，得到稀释液；取稀释液涂布于改良的PDA培养基上，置于28℃的培养箱中分离培养54h，得到多个菌落；再将多个菌落在改良的PDA培养基上进行纯化培养54h，培养温度为28℃，得多种菌株，然后将获得的多种菌株转移至改良的PDA培养基上增殖培养54h，培养温度为28℃，然后置于4℃环境下保存，备用；
其中所述改良的PDA培养基包括PDA、0.1mg琥珀酸钠和150mL的三七茎叶原浆；
步骤二、将步骤一中保存的多种菌株分别和三七黑斑病病原菌进行对峙培养5d，对峙培养温度为28℃，筛选出抑制率大于或等于90％的菌株，经DNA鉴定后，确定为暗色环纹炭团菌。
其中，无菌消毒处理具体为：用质量分数为75％的酒精浸泡5min，酒精要盖过三七的茎部，然后将三七的茎部移至质量分数为1％的次氯酸钠溶液中浸泡8min，次氯酸钠溶液要盖过三七的茎部，再用无菌水冲洗6次。
其中，在无菌消毒处理之前还包括对三七的茎部进行预处理：将三七的茎部用质量分数为15％的魔芋粉溶液在40℃下浸泡20min，魔芋粉溶液要盖过三七的茎部，取出沥干后再在三七的茎部表面涂上玉米油。
其中，步骤一中三七茎叶原浆的制备方法具体为：将三七的茎和叶放入研钵中，加入冰水研磨30min，然后加入浓度均为10μmol/L的胱氨酸溶液、苏氨酸溶液、白氨酸溶液和赖氨酸溶液，置于超声波中以60kHz超声频率处理40min，再用研钵研磨10min，置于超声波中以60kHz超声频率处理20min，过滤即得，保存在4℃环境中，备用；
其中三七的茎、叶、冰水、胱氨酸溶液、苏氨酸溶液、白氨酸溶液和赖氨酸溶液的质量体积比例为1g:1g:10mL:1mL:1mL:1mL:1mL。
<实施例7>
采用实施例1的方法，将三七的茎部替换成三七的叶，其它操作方法与实施例1一致。
<实施例8>
采用实施例1的方法，将三七的茎部替换成三七的根部，其它操作方法与实施例1一致。
表1分离情况
如表1所示，通过实施例1、实施例7和实施例8的方法可以从三七的茎部、叶和根部分离获得暗色环纹炭团菌，分别获得18株、4株和2株，从分离获得的菌株数据可以说明暗色环纹炭团菌主要可以从三七的茎部获得，从三七的叶和根部分离获得的暗色环纹炭团菌较少。
<病原菌抑制试验>
采用实施例1～3和实施例4～6的方法分离获得的暗色环纹炭团菌进行病原菌菌丝抑制试验：
方法：采用对峙培养法，以PDA为供试培养基，在培养皿上将病原菌分别与各真菌菌株进行对峙培养试验，每处理3个重复，于28℃恒温培养箱中培养，观察各菌株和病原菌的生长情况。以单独培养的病原菌为对照。每天记录病原菌落指向拮抗菌半径及对照病原菌菌落半径，5d后，计算菌株的抑菌率。
抑制率＝(病原菌对照菌落半径-病原菌落指向拮抗菌的半径)/病原菌对照菌落半径×100％
表2暗色环纹炭团菌对病原菌菌丝的抑制效果对比
如表2所示，实施例1和实施例6的方法分离得到的暗色环纹炭团菌，对三七灰霉病病原菌、三七圆斑病病原菌、苦玄参褐斑病病原菌、艾纳香条斑病病原菌、广西莪术叶斑病病原菌、草豆蔻叶斑病病原菌和罗汉果斑枯病病原菌菌丝具有极强的抑制作用。且实施例4～6明显优于实施例1～3，表明实施例4～6中在三七的茎部消毒处理前，采用魔芋粉溶液浸泡和涂抹植物油的方法，有利于暗色环纹炭团菌的分离；制备三七茎叶原浆时，加入胱氨酸溶液、苏氨酸溶液、白氨酸溶液和赖氨酸溶液并进行超声处理，可以促使三七茎叶原浆中活性物质的流出，并在低温环境中和氨基酸作用下保持其活性，降低活性的损失，进而增强分离所得的暗色环纹炭团菌的活性，因此增强其对病原菌菌丝的抑制作用。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (1)
1.暗色环纹炭团菌的应用，其特征在于，在防治三七灰霉病、三七圆斑病、苦玄参褐斑病、艾纳香条斑病、广西莪术叶斑病、草豆蔻叶斑病和罗汉果斑枯病中的应用，其中，该暗色环纹炭团菌从三七的茎部分离得到。
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