CN105495282A - 胶囊化处理罗伦隐球酵母在清除棒曲霉素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了胶囊化处理罗伦隐球酵母在清除棒曲霉素中的应用，本发明提供了用罗伦隐球酵母胶粒清除体系中棒曲霉素的方法，包括如下步骤：1)将罗伦隐球酵母或其悬浮液、褐藻酸钠水溶液和CaCl₂水溶液混合，得到罗伦隐球酵母胶粒；2)将所述罗伦隐球酵母胶粒与含有棒曲霉素的体系混匀，反应，实现清除所述体系中棒曲霉素。本发明证明了胶囊化的罗伦隐球酵母可以用来清除体系中的棒曲霉素，且可以回收胶囊化的罗伦隐球酵母，不会影响体系。

Description

胶囊化处理罗伦隐球酵母在清除棒曲霉素中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及胶囊化处理罗伦隐球酵母在清除棒曲霉素中的应用。

背景技术

棒曲霉素(Patulin)是部分青霉属和曲霉属真菌的次生代谢产物。它对人及动物具有广泛而强烈的毒性作用。急性毒性表现为抽搐、痉挛、皮下组织水肿、肺肠充血、肠炎、无尿直至死亡；慢性毒性可导致胃溃疡，并具有抑制免疫、致畸性以及潜在的致癌性等，还有可能影响男性的生育能力。棒曲霉素能溶于水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和氯仿，微溶于乙醚、苯，不溶于石油醚，在酸性条件下化学性质稳定。

在具有棒曲霉素产生能力的真菌中，部分真菌是植物致病菌，其中最主要的一种是扩展青霉病菌(Penicilliumexpansum)。这种病原菌是世界范围内引起果实采后腐烂的最重要的病原菌之一，常见的寄主包括苹果、梨、葡萄、樱桃、桃、草莓等等。它在引起果实腐烂的同时，会向果实组织中分泌大量的棒曲霉素。在果汁加工产业中，如果腐烂的果实混入原材料中，那么生产出的果汁就会有不同程度的棒曲霉素残留，给消费者(特别是儿童)的身体健康带来危害。基于棒曲霉素对人体健康的潜在危害，世界上很多国家都对果汁产品中棒曲霉素的最大限量做了规定，EU、USFDA规定果汁产品中棒曲霉素的最大限量为50μg/kg，WHO建议人每天棒曲霉素的摄入量不超过0.4μg/kg体重。

由于果汁通常为酸性，而棒曲霉素在酸性条件下性质稳定，因此果汁中一旦污染了棒曲霉素后很难自然分解。目前，主要通过吸附、微波处理等物理手段进行去除，但效果不是十分理想，亟需研发新型的棒曲霉素脱除手段。

酵母罗伦隐球酵母广泛分布于植物(例如果实)表面，它作为生防菌对多种果实采后病害表现出较好的防治效果。近年来，人们发现罗伦隐球酵母还具有降解棒曲霉素的能力，然而如何应用它的这种能力是生产上的一个难题。如果直接将酵母加入果汁中，虽然能降解果汁中的毒素，但是混入果汁内的酵母菌不易去除。因此，需要寻找其他的方法来利用罗伦隐球酵母的这种能力。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用罗伦隐球酵母胶粒清除体系中棒曲霉素的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将罗伦隐球酵母或其悬浮液、褐藻酸钠水溶液和CaCl₂水溶液混合，得到罗伦隐球酵母胶粒；

2)将所述罗伦隐球酵母胶粒与含有棒曲霉素的体系混匀，反应，实现清除所述体系中棒曲霉素。

上述方法中，所述将罗伦隐球酵母悬浮液、褐藻酸钠水溶液和CaCl₂水溶液混合包括如下步骤：将所述罗伦隐球酵母悬浮液与所述褐藻酸钠水溶液混匀，得到混合液；再将所述混合液逐滴加入所述CaCl₂水溶液中混匀，静置，得到罗伦隐球酵母胶粒；

所述混合液中所述罗伦隐球酵母和所述褐藻酸钠的配比为2.5×10⁸个：1g；

所述CaCl₂水溶液的质量体积百分比为2％。

上述方法中，所述混合液中罗伦隐球酵母的含量为2.5×10⁸个/ml；

所述混合液中褐藻酸钠的质量体积百分比为1％。

上述方法中，所述褐藻酸钠的粘度为3500cp。

上述方法中，所述罗伦隐球酵母悬浮液的悬浮缓冲液为水。

上述方法中，所述静置的时间为10min；

所述反应的时间为24-72小时。

上述方法中，在步骤2)的反应后，还包括如下步骤：回收反应体系中的所述罗伦隐球酵母胶粒。

上述方法中，所述含有棒曲霉素的体系为污染棒曲霉素的果汁或含有棒曲霉素的水溶液。

本发明另一个目的是提供一种制备罗伦隐球酵母胶粒的方法。

本发明提供的方法，包括上述的方法中的步骤1)。

上述的方法制备的罗伦隐球酵母胶粒也是本发明保护的范围。

上述的方法或上述的罗伦隐球酵母胶粒在清除污染棒曲霉素的果汁中棒曲霉素中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明提供了一种用罗伦隐球酵母胶粒清除体系中棒曲霉素的方法，其清除效果显著高于单独的胶粒和单独的罗伦隐球酵母，且清除后容易回收胶囊化的罗伦隐球酵母，不会影响体系；证明了胶囊化的罗伦隐球酵母可以用来清除体系中的棒曲霉素。这种方法可以用来清除污染棒曲霉素的果汁，且不影响果汁本身的组分。

附图说明

图1为罗伦隐球酵母清除棒曲霉素的结果图。

图2为棒曲霉素含量标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的酵母菌株：罗伦隐球酵母Cryptococcuslaurentii(Kuffer.)Skinner。

下述实施例中培养基如下：

NYDA固体培养基(g/L):牛肉浸膏(BeefExtract)1,葡糖糖(Glucose)10，蛋白胨(Peptone)5，酵母提取物(Yeastextract)7,氯化钠(NaCl)5,琼脂粉(Agar)15。

NYDB液体培养基(g/L):牛肉浸膏(BeefExtract)1,葡糖糖(Glucose)10，蛋白胨(Peptone)5，酵母提取物(Yeastextract)7,氯化钠(NaCl)5。蒸馏水定容到1L后，121℃灭菌20min。

pH＝4双蒸水：取双蒸水用乙酸调至pH＝4后过滤灭菌；

质量体积百分比2％褐藻酸钠水溶液(W/V)：称取2g粘度为3500cp的褐藻酸钠(Sigma公司生产)，加入100ml蒸馏水，121℃灭菌20min；

质量体积百分比2％CaCl₂水溶液(W/V)：称取2gCaCl₂，加入100ml蒸馏水，过滤灭菌；

滤膜：又名神奇滤布(Miracloth)，22-25μm孔径，MerckMillipore公司产品。

棒曲霉素(Patulin,PAT):取2mg棒曲霉素(青岛生工公司)溶于4mlpH＝4的双蒸水中，配成0.5mg/ml的母液，过滤灭菌后使用。

实施例1、胶囊化处理罗伦隐球酵母清除棒曲霉素的方法

一、胶囊化处理罗伦隐球酵母

1、酵母细胞悬液的制备

取-80℃冰箱中冻存的罗伦隐球酵母Cryptococcuslaurentii菌种，在NYDA板上划线，待长出菌落后，挑单菌落到NYDB中，28℃，220rpm/min,培养18h。计数后以细胞终浓度为1×10⁵个/ml转接到40mlNYDB中，28℃，220rpm/min，培养48h，得到酵母细胞悬液；

2、胶囊化处理

取出20ml酵母细胞悬液，115℃，10min高压灭菌，使细胞完全失活为死细胞悬液，另一半即为活细胞悬液，分别收集这两份的酵母细胞，用无菌水清洗2次后，pH＝4双蒸水调整细胞终浓度为5×10⁸个/ml，得到酵母活细胞悬液和酵母细胞死细胞悬液；按如下处理，一一加入对应试剂，实现胶囊化处理罗伦隐球酵母：

实验组：将上述6ml酵母活细胞悬液中加入6ml2％褐藻酸钠水溶液，振荡混匀，得到混合液，混合液中褐藻酸钠的质量体积含量为1％，酵母活细胞的含量为2.5×10⁸个/ml(混合液中酵母活细胞和褐藻酸钠配比为2.5×10⁸个：1g)；再每次吸800ul混合液，以5ml/min速度缓慢逐滴加入至装在10ml的小烧杯中的4ml2％CaCl₂水溶液中，静置10min后，神奇滤布过滤后备用，得到罗伦隐球酵母活细胞胶粒；

对照组1：将上述6ml酵母死细胞悬液中加入6ml2％褐藻酸钠水溶液，振荡混匀，得到混合液，混合液中褐藻酸钠的质量体积含量为1％，酵母活细胞的含量为2.5×10⁸个/ml(混合液中酵母活细胞和褐藻酸钠配比为2.5×10⁸个：1g)；再每次吸800ul混合液，缓慢逐滴加入至2％CaCl₂水溶液中，CaCl₂溶液共4ml，装在10ml的小烧杯里，静置10min后，神奇滤布过滤后得到罗伦隐球酵母死细胞胶粒备用；

对照组2：将上述6mlpH＝4双蒸水中加入6ml2％褐藻酸钠水溶液，振荡混匀，得到混合液，混合液中褐藻酸钠的质量体积含量为1％；再每次吸800ul混合液，缓慢逐滴加入至2％CaCl₂水溶液中，CaCl₂溶液共4ml，装在10ml的小烧杯里，静置10min后，神奇滤布过滤后得到无酵母细胞胶粒备用。

上述各种胶粒形状规整，有一定的弹性，胶粒直径均为2mm。

二、胶囊化处理罗伦隐球酵母清除棒曲霉素

实验组：将上述一制备的罗伦隐球酵母活细胞胶粒用pH＝4双蒸水清洗2次后，装入2ml离心管中，总体积为500μl左右(胶粒直径为2mm，约40个胶粒)，向管内加入500μl(含有20μgPAT)的pH＝4双蒸水。

以上述一制备的罗伦隐球酵母死细胞胶粒和上述一制备的无酵母细胞胶粒均按相同的方法处理作为对照组1和对照组2。

对照组3：向2ml离心管中加入500μlpH＝4双蒸水悬浮的浓度为2.5×10⁸个/ml罗伦隐球酵母活细胞悬液，然后再向管内加入500μl(含有20μgPAT)的pH＝4双蒸水。

上述四组处理分别在0、24、48、72h取样，每次每个处理取出3个重复，取样后，先用神奇滤布过滤回收胶囊化的罗伦隐球酵母(对照组3不含胶粒，不用过滤)，然后6000g离心30s，上清液0.22μm滤膜过滤后，-20℃保存用于测定PAT残余量。

HPLC检测PAT残余量：

(1)色谱条件

色谱仪：美国Waters公司高效液相色谱仪，配备有自动进样器(Waters2707)，双向HPLC泵(Waters1525)，紫外检测器(Waters2487)；

色谱柱：ODS反相柱(C18柱，5μm，250×4.6mm，GLSciences，Japan)；

流动相：乙腈∶水＝10∶90(v/v)，流速1.0ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：276nm；

进样量：10μl。

(2)色谱分析

配置浓度分别为1,5,10,50,100μg/ml的棒曲霉素标准品溶液，吸取10μl注入HPLC，记录色谱峰保留时间和峰面积，用峰面积和浓度制作标准曲线。再吸取10μl待测样品进样，记录保留时间和峰面积，根据组分在色谱上的出峰时间与标准品比较进行定性，用峰面积通过标准曲线(y＝0.000016x-0.150756)计算样品中的棒曲霉素含量。

结果如图1所示，其中PAT与罗伦隐球酵母活细胞胶粒共培养24h时，已降低到4.5μg/ml左右，48h时PAT含量极低，为0.4μg/ml左右，72h已经完全检测不到PAT的存在。与罗伦隐球酵母死细胞胶粒和无酵母细胞的胶粒共培养的PAT，均在24h的时候降低到初始含量的一半左右，并在随后的几天基本保持不变。同时，非胶粒形式的活酵母细胞也可以清除培养体系中的PAT,但其效果不如胶粒形式的酵母。

从上述可以看出，与罗伦隐球酵母死细胞胶粒、无酵母细胞的胶粒以及非胶粒形式的活酵母相比，罗伦隐球酵母活细胞胶粒对体系中PAT的吸附作用最大，能够降低体系中的PAT含量。

Claims (10)

1.一种用罗伦隐球酵母胶粒清除体系中棒曲霉素的方法，包括如下步骤：

1)将罗伦隐球酵母或其悬浮液、褐藻酸钠水溶液和CaCl₂水溶液混合，得到罗伦隐球酵母胶粒；

2)将所述罗伦隐球酵母胶粒与含有棒曲霉素的体系混匀，反应，实现清除所述体系中棒曲霉素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述将罗伦隐球酵母悬浮液、褐藻酸钠水溶液和CaCl₂水溶液混合包括如下步骤：将所述罗伦隐球酵母悬浮液与所述褐藻酸钠水溶液混匀，得到混合液；再将所述混合液逐滴加入所述CaCl₂水溶液中混匀，静置，得到罗伦隐球酵母胶粒；

所述混合液中所述罗伦隐球酵母和所述褐藻酸钠的配比为2.5×10⁸个：1g；

所述CaCl₂水溶液的质量体积百分比为2％。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述混合液中罗伦隐球酵母的含量为2.5×10⁸个/ml；

所述混合液中褐藻酸钠的质量体积百分比为1％。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述褐藻酸钠的粘度为3500cp。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述罗伦隐球酵母悬浮液的悬浮缓冲液为水；

所述静置的时间为10min；

所述反应的时间为24-72小时；

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：

在步骤2)的反应后，还包括如下步骤：回收反应体系中的所述罗伦隐球酵母胶粒。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述含有棒曲霉素的体系为污染棒曲霉素的果汁或含有棒曲霉素的水溶液。

8.一种制备罗伦隐球酵母胶粒的方法，为权利要求1-7中任一所述的方法中的步骤1)。

9.权利要求8所述的方法制备的罗伦隐球酵母胶粒。

10.权利要求1-8中任一所述的方法或权利要求9所述的罗伦隐球酵母胶粒在清除污染棒曲霉素果汁中的棒曲霉素中的应用。