CN102977392A - 去除内毒素的细菌纤维素的制备方法 - Google Patents

去除内毒素的细菌纤维素的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种去除内毒素的细菌纤维素的制备方法，包括细菌纤维素膜预处理、配制PEG水溶液或壳聚糖溶液；将细菌纤维素置于PEG水溶液或壳聚糖溶液中，加热至80℃以上，水浴温度保持80-100℃，保持时间0.5-1.5h；将蒸煮过的细菌纤维素膜用纯化水清洗，得产品。本发明去除内毒素的方法简单，免除了在细菌纤维素培养过程考虑内毒素的去除；本发明的制备过程简单，适合于复合细菌纤维素敷料的工业生产。

Description

去除内毒素的细菌纤维素的制备方法
技术领域
本发明涉及一种细菌纤维素的制备方法。
背景技术
医院临床在使用药品注射剂或医疗器械时，常有发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、休克、严重时导致死亡，这种症状称为热原反应，因微生物污染造成的热原反应称为内毒素热原。细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，其化学成分主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成，脂质A是内毒素的主要毒性成分。
内毒素广泛分布于革兰氏阴性菌及其它微生物的细胞壁层的脂多糖。革兰氏阴性细菌产生的内毒素不容易在多糖纯化过程中去除。世界卫生组织（WHO）推荐的在革兰氏阴性类细菌多糖产品中内毒素的去除工艺为采用在100000g的离心力条件下超速离心4-6h，但该工艺不仅需要价格非常昂贵的超速冷冻离心机，且一次处理的样品量受到限制。文献报道的内毒素去除方法也有很多，根据作用方式的不同，可分为以下三类，①非选择性方法，主要有超滤法、活性炭吸附法、相分离法；②层析法，主要包括离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析；③选择性方法，主要指亲和吸附法，此外还包括金属螯合物吸附法和氢氧化铝吸附法，但这些方法对于用于医疗器械的生物材料都不是很好的方法。
细菌纤维素是指微生物来源的纤维素，又称生物纤维素、纳米纤维素，是一种天然的生物高聚物，由β-D-葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的一种无分支的大分子直链聚合物，具有高结晶度、高纯度、高持水性、独特的三维网状结构、高抗张强度和弹性模量等许多独特的物理、化学和机械性能。此外细菌纤维素持水性高，其内部有很多“孔道”，有良好的透气、透水性能，能吸收60-700倍于其干重的水分，并具有高湿强度，极好的形状维持性能和形状可调控性，可以任意裁剪，与皮肤有极好的贴附性。大量研究表明细菌纤维素具有良好的体内、体外生物相容性和良好的生物可降解性，但细菌纤维素中含有的内毒素具有先天性，因此，去除细菌纤维素中内毒素，使内毒素的限值在一定范围之内，这对其在生物医用材料领域的应用至关重要。
而一些天然或合成高分子具有抑菌作用，通过与细菌纤维素的混合可将其内毒素去除。如壳聚糖、聚乙二醇等来源广泛，且有优异的抑菌、杀菌性能。
壳聚糖天然高分子（CS）具有优良的生物相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等，在生物医学方面，壳聚糖具有促进血液凝固的作用，可用作止血剂，它还可用于伤口填料物质，具有灭菌、促进伤口愈合、吸收伤口渗出物、不易脱水收缩等作用。壳聚糖的抑菌作用可能有两种机理，一种是壳聚糖通过正电荷的-NH3吸附带负电荷的细胞壁，使壳聚糖吸附在细胞膜表面形成一层高分子膜，改变了细胞膜的选择透过性，阻止营养物质向细胞内的运输，致使细胞质流失、细胞质壁分离，从而起到抑菌杀菌作用；另外一种机理是壳聚糖通过渗入进细胞体内，吸附细胞体内带有阴离子的细胞质，并发生絮凝作用扰乱细胞正常的生理活动，从而杀灭细菌。
聚乙二醇（PEG），平均分子量在约200至6000的高聚物。通常是无色、无味的粘稠液体或固体，能够溶于水、乙醇和许多其他的有机溶剂。其对热很稳定，与其他化学品也不容易起反应，不宜水解、变质，无毒，对人体的眼睛、皮肤等也均没有明显刺激。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效去除细菌纤维素内毒素的去除内毒素的细菌纤维素的制备方法。
本发明的技术解决方案是：
一种去除内毒素的细菌纤维素的制备方法，其特征是：包括下列步骤：
（1）细菌纤维素膜预处理：将细菌纤维素用纯化水清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用；
（2）配制PEG水溶液：溶液浓度为质量百分比浓度40%-75%；
（3）壳聚糖的溶解：准确称取壳聚糖，加入稀醋酸溶液并配合磁力搅拌器搅拌，使溶质充分溶解，制得浓度为0.1%-5%的壳聚糖溶液；
（4）将细菌纤维素置于PEG水溶液或壳聚糖溶液中，加热至80℃以上，水浴温度保持80-100℃，保持时间0.5-1.5h；
（5）将蒸煮过的细菌纤维素膜用纯化水清洗，得产品。
将步骤（5）得到的细菌纤维素膜产品进行灭菌处理。
所述PEG为PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、PEG-1000、PEG-1500的一种或几种。
所述稀醋酸溶液的浓度为0.5%~5%。
本发明中，内毒素限量按照GBT 14233.2-2005中推荐输液、输血、注射器具细菌内毒素限量每件不超过20EU，与脑脊液接触和胸内应用器械每件不超过2.15EU。鲎试剂灵敏度为1EU/ml、0.25EU/ml。
本发明中灭菌方式为高温湿热灭菌和辐照灭菌。高温湿热灭菌103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸汽压下，温度达到121.3℃，维持20分钟；辐照灭菌剂量为5-15KGy。
本发明中所述细菌纤维素膜是由醋杆菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属、土壤杆菌属等九属细菌中的某种菌属经发酵产生，所产的细菌纤维素具有三维多孔网络结构。
细菌纤维素具有独特的三维多孔网状结构以及较大的比表面积，为PEG和壳聚糖在网络中的吸附提供了便利条件。本发明所制备的PEG溶液和壳聚糖溶液与纳米细菌纤维素网络结构有着较好的匹配关系，通过溶液吸附和渗透的方法PEG和壳聚糖可以顺利渗透到细菌纤维素表面以及发达的网络结构中。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
1、去除内毒素的方法简单，免除了在细菌纤维素培养过程考虑内毒素的去除；
2、本发明的制备过程简单，适合于复合细菌纤维素敷料的工业生产。
实施例1：
将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜用纯化水多次清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用。
用纯化水配置40%wt的PEG200水溶液。
将细菌纤维素膜浸泡置于PEG水溶液中，水浴加热至80℃，保温0.5h。
冷却后取出PEG/细菌纤维素复合膜，用纯化水洗涤3遍。
进行内毒素检测，细菌内毒素限量每件不超过20EU，鲎试剂灵敏度为1EU/ml。
实施例2：
将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜用纯化水多次清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用。
用纯化水配置50%wt的PEG400水溶液。
将细菌纤维素膜浸泡置于PEG水溶液中，水浴加热至90℃，保温1h。
冷却后取出PEG/细菌纤维素复合膜，用纯化水洗涤3遍。
将获得的PEG/细菌纤维素复合膜经过高温湿热灭菌。
进行内毒素检测，细菌内毒素限量每件不超过20EU，鲎试剂灵敏度为1EU/ml。
实施例3：
将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜用纯化水多次清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用。
用纯化水配置75%wt的PEG800水溶液。
将细菌纤维素膜浸泡置于PEG水溶液中，水浴加热至100℃，保温1.5h。
冷却后取出PEG/细菌纤维素复合膜，用纯化水洗涤3遍。
将获得的PEG/细菌纤维素复合膜经过辐照灭菌，辐照灭菌剂量为5KGy。
进行内毒素检测，细菌内毒素限量每件不超过2.15EU，鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml。
实施例4：
将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜用纯化水多次清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用。
用纯化水配置45%wt的PEG1500水溶液。
将细菌纤维素膜浸泡置于PEG水溶液中，水浴加热至80℃，保温1.5h。
冷却后取出PEG/细菌纤维素复合膜，用纯化水洗涤3遍。
将获得的PEG/细菌纤维素复合膜经过辐照灭菌，辐照灭菌剂量为15KGy。
进行内毒素检测，细菌内毒素限量每件不超过2.15EU，鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml。
实施例5：
将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜用纯化水多次清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用。
用纯化水配置60%wt的PEG1000水溶液。
将细菌纤维素膜浸泡置于PEG水溶液中，水浴加热至90℃，保温1h。
冷却后取出PEG/细菌纤维素复合膜，用纯化水洗涤3遍。
将获得的PEG/细菌纤维素复合膜经过高温湿热灭菌。
进行内毒素检测，细菌内毒素限量每件不超过20EU，鲎试剂灵敏度为1EU/ml。
实施例6：
将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜用纯化水多次清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用。
用0.5%醋酸稀溶液配置0.5%wt的壳聚糖醋酸溶液。
将细菌纤维素膜浸泡置于壳聚糖醋酸溶液中，水浴加热至85℃，保温0.5h。
冷却后取出CS/细菌纤维素复合膜，用纯化水洗涤3遍。
进行内毒素检测，细菌内毒素限量每件不超过20EU，鲎试剂灵敏度为1EU/ml。
实施例7：
将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜用纯化水多次清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用。
用1%醋酸稀溶液配置0.1%wt的壳聚糖醋酸溶液。
将细菌纤维素膜浸泡置于壳聚糖醋酸溶液中，水浴加热至100℃，保温1.5h。
冷却后取出CS/细菌纤维素复合膜，用纯化水洗涤3遍。
将获得的CS/细菌纤维素复合膜经过高温湿热灭菌。
进行内毒素检测，细菌内毒素限量每件不超过20EU，鲎试剂灵敏度为1EU/ml。
实施例8：
将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜用纯化水多次清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用。
用2%醋酸稀溶液配置2%wt的壳聚糖醋酸溶液。
将细菌纤维素膜浸泡置于壳聚糖醋酸溶液中，水浴加热至95℃，保温1h。
冷却后取出CS/细菌纤维素复合膜，用纯化水洗涤3遍。
将获得的CS/细菌纤维素复合膜经过辐照灭菌，辐照灭菌剂量为5KGy。
进行内毒素检测，细菌内毒素限量每件不超过2.15EU，鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml。
实施例9：
将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜用纯化水多次清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用。
用3%醋酸稀溶液配置4%wt的壳聚糖醋酸溶液。
将细菌纤维素膜浸泡置于壳聚糖醋酸溶液中，水浴加热至100℃，保温1.5h。
冷却后取出CS/细菌纤维素复合膜，用纯化水洗涤3遍。
将获得的CS/细菌纤维素复合膜经过辐照灭菌，辐照灭菌剂量为10KGy。
进行内毒素检测，细菌内毒素限量每件不超过2.15EU，鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml。
实施例10：
将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜用纯化水多次清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用。
用4%醋酸稀溶液配置5%wt的壳聚糖醋酸溶液。
将细菌纤维素膜浸泡置于壳聚糖醋酸溶液中，水浴加热至95℃，保温0.5h。
冷却后取出CS/细菌纤维素复合膜，用纯化水洗涤3遍。
将获得的CS/细菌纤维素复合膜经过辐照灭菌，辐照灭菌剂量为15KGy。
进行内毒素检测，细菌内毒素限量每件不超过2.15EU，鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml。
实施例11：
将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜用纯化水多次清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用。
用纯化水配置70%wt的PEG600水溶液。
将细菌纤维素膜浸泡置于PEG水溶液中，水浴加热至85℃，保温1.5h。
冷却后取出PEG/细菌纤维素复合膜，用纯化水洗涤3遍。
进行内毒素检测，细菌内毒素限量每件不超过20EU，鲎试剂灵敏度为1EU/ml。
实施例12：
将市售由木醋杆菌制得的细菌纤维素膜用纯化水多次清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用。
用5%醋酸稀溶液配置3%wt的壳聚糖醋酸溶液。
将细菌纤维素膜浸泡置于壳聚糖醋酸溶液中，水浴加热至95℃，保温1h。
冷却后取出CS/细菌纤维素复合膜，用纯化水洗涤3遍。
进行内毒素检测，细菌内毒素限量每件不超过2.15EU，鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml。
通过实验对实施例1-12进行内毒素去除，对处理过的细菌纤维素膜进行外观比对，其中对照1为步骤（1）预处理过的细菌纤维素，对照（2）为用纯化水90℃水浴蒸煮并保温1h获得的细菌纤维素膜，结果如表1所示：
表1：处理后的细菌纤维素膜的透明度
Figure BDA00002598507800101
可见，对细菌纤维素进行内毒素去除处理过程对细菌纤维素膜外观没有明显的影响，但用浓度高的溶液处理后其细菌纤维素膜的透明度略显更高些。
通过实验对实施例1-12进行内毒素去除，对处理过的细菌纤维素膜在灭菌前进行内毒素检测，其中对照1为步骤（1）预处理过的细菌纤维素，对照（2）为用纯化水90℃水浴蒸煮并保温1h获得的细菌纤维素膜，结果如表2所示：
表2：未灭菌状态的内毒素检测结果
对照1 对照2 实施例1 实施例6 实施例11 实施例12
内毒素 + + - - - -
注：“+”为阳性，“-”为阴性。
通过实验对实施例1-12进行内毒素去除，对处理过的细菌纤维素膜灭菌后进行内毒素检测，其中对照1为步骤（1）预处理过的细菌纤维素经辐照灭菌，辐照剂量为5KGy；对照（2）为用纯化水90℃水浴蒸煮并保温1h获得的细菌纤维素膜经辐照灭菌，辐照剂量为5KGy。结果如表3所示：
表3：灭菌后的内毒素检测结果
对照1 对照2 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
内毒素 + + - - - -
实施例7 实施例8 实施例9 实施例10
内毒素 - - - - - -
注：“+”为阳性，“-”为阴性。
从表2、3可看到，通过对细菌纤维素内毒素的去除，对于是否灭菌，对内毒素的检测无明显影响。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (4)

1.一种去除内毒素的细菌纤维素的制备方法，其特征是：包括下列步骤：
（1）细菌纤维素膜预处理：将细菌纤维素用纯化水清洗，控制细菌纤维素的pH值为7-7.2，得到预处理的细菌纤维素膜，冷藏备用；
（2）配制PEG水溶液：溶液浓度为质量百分比浓度40%-75%；
（3）壳聚糖的溶解：准确称取壳聚糖，加入稀醋酸溶液并配合磁力搅拌器搅拌，使溶质充分溶解，制得浓度为0.1%-5%的壳聚糖溶液；
（4）将细菌纤维素置于PEG水溶液或壳聚糖溶液中，加热至80℃以上，水浴温度保持80-100℃，保持时间0.5-1.5h；
（5）将蒸煮过的细菌纤维素膜用纯化水清洗，得产品。
2.根据权利要求1所述的无内毒素的细菌纤维素的制备方法，其特征是：将步骤（5）得到的细菌纤维素膜产品进行灭菌处理。
3. 根据权利要求1或2所述的去除内毒素的细菌纤维素的制备方法，其特征是：所述PEG为PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、PEG-1000、PEG-1500的一种或几种。
4. 根据权利要求1或2所述的去除内毒素的细菌纤维素的制备方法，其特征是：所述稀醋酸溶液的浓度为0.5%~5%。
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