CN114752067A - 一种利于细胞培养的改性细菌纤维素及其应用 - Google Patents

一种利于细胞培养的改性细菌纤维素及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物领域，公开了一种利于细胞培养的改性细菌纤维素及其应用。改性细菌纤维素通过将纯化的细菌纤维素、改性剂分散在溶剂中，充分反应得到改性细菌纤维素。使用该改性细菌纤维素可以制备得到利于细胞培养的支架。本发明一些实例的改性细菌纤维素，用于细胞培养肉时，可以很好地促进细胞粘附生长，同时生产得到的细胞培养肉具有良好的口感；制备方法简单、高效、复现性强、成本低廉。本发明一些实例的支架，不含动物成分、无需添加ECM蛋白，同时表现出良好的细胞黏附与增殖。本支架可食用，不添加化学交联剂、有毒有害溶剂。支架无需分离或降解，可直接作为细胞培养肉终产品的组分，有助于培养肉生产的工艺简化和造价降低。

Description

一种利于细胞培养的改性细菌纤维素及其应用
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种利于细胞培养的改性细菌纤维素及其应用。
背景技术
细胞培养肉是一种利用少量动物细胞进行培养，通过细胞生长、增殖、分化获得肌肉、脂肪等组织的肉类生产方式。相比于传统肉类生产方式，它的能量转化率更高、对环境的依赖和破坏更小、生产过程洁净卫生、不添加激素和抗生素、对动物伤害更小，未来有望以更高产、优质、绿色可持续的肉品应对供给压力，填补需求缺口。
细胞培养肉领域的四大关键技术在于：（1）肌肉、脂肪细胞分离与培养；（2）无异种培养基调配；（3）生物反应器设计；（4）支架开发。支架具有丰富的孔隙结构，可提供三维的细胞生长空间，相比于二维培养更接近细胞在体内的真实环境，并且效率更高。同时，支架的三维构造有助于形成具有一定结构的整块细胞培养肉产品。与组织工程等领域中的支架不同，细胞培养肉支架需要确保可食用。
已有细胞培养肉生物支架的主要问题在于原料难以摆脱对动物的依赖，这将违背细胞培养肉倡导动物福利的初衷。已有细胞培养肉支架的主要原料中，明胶、丝素蛋白等虽然对细胞有优良的亲和力，但是来源于动物。如果通过重组等手段从非动物源获取，其造价将非常高昂，不利于推动细胞培养肉市场化。植物蛋白、天然多糖等虽然不来自动物，但是通常需要添加细胞外基质（ECM）蛋白以提升支架生物相容性，ECM蛋白需要由动物中提取。
细菌纤维素是一种非动物源材料，它由木醋杆菌等微生物分泌而成，是由葡萄糖单元通过β-1,4-糖苷键连接形成的直链大分子多糖，因为在组织工程、再生医学支架中表现出良好的生物相容性而备受关注。食品领域中，细菌纤维素可直接加工为食品，其中最具代表性的椰果具有良好的味道和口感，被多国消费者广泛认可与喜爱，出现在众多甜点、饮料中，价格低廉可接受。
微生物培养直接获得的细菌纤维素呈现纳米级网络结构，这一网络间隙无法容纳动物细胞迁移与生长，因此需要加工。已有的细菌纤维素生物支架多采用喷雾、纺丝等需要将纤维素溶解的方式制备，需依赖NMMO、DMSO、离子液体、NaOH/尿素等不可食用溶剂。此外，已有细菌纤维素支架制备时往往添加乙二醛、戊二醛、EDC/NHS等食入后对人体有毒有害的交联剂。因此，这些细菌纤维素支架无法直接应用于细胞培养肉中。
如何对细胞纤维素进行改性，使得其可以更好地应用于细胞培养肉中，依然是一项具有挑战性的工作。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种利于细胞培养的改性细菌纤维素及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种改性细菌纤维素，其制备方法包括如下步骤：
S1) 将纯化的细菌纤维素、改性剂分散在溶剂中，所述改性剂选自可食用的非动物源阳离子多糖、非动物源阳离子蛋白、天然氨基酸中的至少一种；
S2) 充分反应得到改性细菌纤维素。
所述纯化为去除细菌纤维素中的培养基、微生物（含热原）。所述纯化方法包括洗涤、浸泡。所述纯化试剂包括水、氢氧化钠溶液中的一种或多种，每种可使用一次或多次。所述纯化方法的使用顺序不限。所述氢氧化钠溶液的浓度为0.01～4 M，优选为0.1～1 M。所述氢氧化钠溶液纯化的温度为室温至沸点。所述氢氧化钠溶液纯化的时间为20 min～48h。
细菌纤维素可进一步物理细化，以满足不同产品的需要。所述物理细化方法为通过压力、剪切力细化，包括但不限于破碎、粉碎、高速剪切、高压均质、超声、蒸汽爆破中的一种或多种。
在一些改性细菌纤维素的实例中，所述细菌纤维素和所述改性剂的质量比为1：(0.01～1)。
在一些改性细菌纤维素的实例中，所述非动物源阳离子多糖选自壳聚糖、阳离子淀粉、阳离子瓜尔胶、阳离子葡聚糖、阳离子羧甲基纤维素、阳离子羟丙基甲基纤维素或上述物质衍生物中的至少一种；和/或
所述非动物源阳离子蛋白选自非动物源酪蛋白、麦蛋白、谷类蛋白、聚赖氨酸、聚赖氨酸盐酸盐；和/或
所述天然氨基酸选自甘氨酸、半胱氨酸盐酸盐、丙氨酸、谷氨酸钠、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、缬氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、胱氨酸、组氨酸或上述物质衍生物中的至少一种；和/或
所述细菌纤维素选自醋酸杆菌属（Acetobacter）、葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）、葡糖杆菌属（Gluconobacter）、朝井杆菌属（Asaia）、驹形杆菌属（Komagataeibacter）、产碱菌属（Alcaligenes）、八叠球菌属（Sarcina）、根瘤菌属（Rhizobium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、固氮菌属（Azotobacter）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、无色杆菌属（Achromobacter）、气杆菌属（Aerobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、利夫森氏菌属（Leifsonia）、沙门氏菌属（Salmonella）、欧文氏菌属（Erwinia）、肠杆菌属（Enterobacter）、希瓦氏菌属（Shewanella）、动胶菌属（Zoogloea）、红杆菌属（Rhodobacter）细菌所生成的细菌纤维素中的至少一种；和/或
所述溶剂选自水、氯化钠溶液中的一种。
本发明的第二个方面，提供：
一种细胞培养肉用生物支架，其制备方法包括如下步骤：
S1) 将本发明第一个方面所述的改性细菌纤维素分散于溶剂中，添加或不添加可食用的凝固点调节剂及适量可食用的增溶剂，得到支架分散液；
S2) 将所述支架分散液转移至定向或非定向冷却装置中，冷冻干燥去除溶剂，去除、不去除或部分去除凝固点调节剂，得到细胞培养肉用生物支架。
凝固点调节剂可以根据需要进行添加，以对分散液的凝固点进行调节。凝固点调节剂可以根据需要全部去除、部分去除或不去除。根据使用的凝固点调节剂的具体种类，可以选择相应的去除方式，包括但不限于水洗、加热。
在冷冻干燥的过程中，分散液中分散剂(溶剂)形成结晶排斥分散质，随后去除分散剂从而在支架中留下孔隙形成多孔结构。在部分实施方式中，例如当分散剂为水时，所述去除分散剂方法为干燥。在其他实施方式中，例如当分散剂为氯化钠溶液时，所述去除分散剂方法为干燥与水洗结合，如真空冷冻干燥-水洗-常温自然干燥。
在一些细胞培养肉用生物支架的实例中，所述支架分散液中，改性细菌纤维素的含量为0.05～2 wt%。
在一些细胞培养肉用生物支架的实例中，所述凝固点调节剂选自食盐、碳酸钾、碳酸钠、碳酸钙、碳酸镁、碳酸氢钾、碳酸氢钠、碳酸氢钙、碳酸氢铵；和/或所述增溶剂为酸或碱。
在一些细胞培养肉用生物支架的实例中，所述酸选自盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸中的至少一种；和/或所述碱选自氢氧化钠、碳酸钠/钾、柠檬酸钠/钾中的至少一种。
在一些细胞培养肉用生物支架的实例中，所述冷冻的温度为-200℃～-10℃。冷冻的温度为任意可将分散液完全冻结的温度，例如为-10 ℃～-200 ℃。所述温度选自以下中的任一范围：-10 ℃～-40 ℃、-40 ℃～-70 ℃、-70 ℃～-80 ℃、-80 ℃～-85 ℃、-85 ℃～-90 ℃、-90 ℃～-100 ℃、-100 ℃～-150 ℃、-150 ℃～-180 ℃、-180 ℃～-190 ℃或-190 ℃～-200 ℃。
在一些细胞培养肉用生物支架的实例中，所述支架的平均孔径为10～1000 μm。孔径的大小可以根据需要进行相应的调整，以满足不同应用的要求。
本发明的第三个方面，提供：
一种细胞培养肉，其支架为本发明第二个方面所述的支架。
所述细胞为动物细胞。在一种实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞。
所述细胞选自成肌细胞、肌肉卫星细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、脂肪前体细胞、成体干细胞和多能干细胞。
所述细胞包括但不限于肌细胞、肝细胞、成骨细胞、成纤维细胞、成脂细胞、造牙本质细胞、成体神经元祖细胞、神经干细胞、来自脑室下前脑区的多个多潜能干细胞、室管膜神经干细胞、造血干细胞、肝造血干细胞、骨髓干细胞、 脂肪的成纤维细胞、脂肪干细胞、产生多个胰岛细胞的干细胞、胰源性多能产生胰岛干细胞、间质干细胞、胎盘细胞、骨髓基质细胞、肌肉侧群细胞、骨髓来源的回收细胞、血液来源的间质前体细胞、骨髓来源的侧群细胞、 肌肉前体细胞、循环的骨骼干细胞、神经祖细胞、多潜能成体祖细胞、中胚层祖细胞、脊髓祖细胞及孢子样细胞及任何组合所组成的群组。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的改性细菌纤维素，利于细胞培养。用于细胞培养肉时，可以很好地促进细胞粘附生长，同时生产得到的细胞培养肉具有良好的口感。
本发明一些实例的改性细菌纤维素，制备方法简单、高效、复现性强、成本低廉。
本发明一些实例的支架，不含动物成分、无需添加ECM蛋白，同时表现出良好的细胞黏附与增殖。本支架可食用，不添加化学交联剂、有毒有害溶剂。支架无需分离或降解，可直接作为细胞培养肉终产品的组分，有助于培养肉生产的工艺简化和造价降低。
附图说明
图1是本发明一些实例的细菌纤维素生物支架制备流程图。
图2是实施例1细菌纤维素/壳聚糖复合多孔支架的宏观（A）、微观形貌（B）及细胞生长情况（C为活死染，D为CCK-8增殖测试）。
图3是实施例2 细菌纤维素/聚赖氨酸复合多孔支架的宏观（A）、微观形貌（B）及细胞生长情况（C为活死染，D为CCK-8增殖测试）。
图4是实施例3 细菌纤维素定向支架的宏观（A）、微观形貌（B为横截面，C为纵截面）。
具体实施方式
下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。
细菌纤维素生物支架制备流程如图1所示。
实施例1 细菌纤维素/壳聚糖复合多孔支架
（1）培养微生物生成细菌纤维素并纯化。将木醋杆菌Komagataeibacter xylinus在30 ℃下浅层静置培养14天，获得细菌纤维素。将其取出，先用去离子水洗涤以去除多数残液，随后置于0.1 M NaOH溶液中煮沸30 min以去除细胞与热原，再用去离子水反复浸泡洗涤至pH呈中性。
（2）物理方法分散细菌纤维素。先用旋转刀片使细菌纤维素初步破碎3 min，再在15000 rpm转速下高速剪切5 min，然后在720 W超声强度下破碎处理5 min，获得细菌纤维素分散液。
（3）制备支架分散液。首先配制2 wt%壳聚糖的1 wt%乙酸水溶液。然后按1:0.5的细菌纤维素:壳聚糖干重比，将细菌纤维素分散液与壳聚糖溶液混合，充分振荡混匀，倒入48孔板中。
（4）制备海绵多孔支架。将支架分散液在-50 ℃下预冻30 min，随后在-50 ℃冷阱温度下真空冷冻干燥直至干燥完全。121 ℃下高压蒸汽灭菌15min，获得细菌纤维素/壳聚糖复合海绵多孔支架。
（5）测试支架。支架的宏观、微观形貌分别如图2A、图2B所示，支架内部具有众多孔洞，孔径为50～350 μm。
将C2C12细胞接种在所获得支架上，培养14天。死活染结果如图2C所示，接种密度为十万细胞每毫升。细胞增殖测试结果如图2D所示，接种密度为五十万细胞每毫升。由图2可见，细胞在支架上贴附、增殖良好。
实施例2 细菌纤维素/聚赖氨酸复合多孔支架
（1）培养微生物生成细菌纤维素并纯化。将木醋杆菌Komagataeibacter xylinus在28 ℃下以100 rpm转速振荡培养7天，获得细菌纤维素。将其取出，先用去离子水洗涤以去除多数残液，随后置于0.1 M NaOH溶液中煮沸30 min以去除细胞与热原，再用去离子水反复浸泡洗涤至pH呈中性。
（2）物理方法分散细菌纤维素。先用旋转刀片使细菌纤维素初步破碎3 min，再在720 W超声强度下破碎处理5 min，然后在15000 rpm转速下高速剪切5 min，获得细菌纤维素分散液。
（3）制备支架分散液。首先配制2 wt%聚赖氨酸水溶液。然后按1:1的细菌纤维素:聚赖氨酸干重比，将细菌纤维素分散液与聚赖氨酸溶液混合，充分振荡混匀，倒入直径1 cm的圆底敞口模具中。
（4）制备海绵多孔支架。将支架分散液在-20 ℃下预冻2 h，随后在-50 ℃冷阱温度下真空冷冻干燥直至干燥完全。121 ℃下高压蒸汽灭菌15min，获得细菌纤维素/聚赖氨酸复合海绵多孔支架。
支架的宏观、微观形貌分别如图3A、图3B所示，支架内部具有众多孔洞，孔径为50～350 μm。
将C2C12细胞接种在所获得支架上，培养14天。死活染结果如图3C所示，接种密度为十万细胞每毫升。细胞增殖测试结果如图3D所示，接种密度为五十万细胞每毫升。由图3可见，细胞在支架上贴附、增殖良好。
实施例3 细菌纤维素定向支架
（1）培养微生物生成细菌纤维素并纯化。将木醋杆菌Komagataeibacter xylinus在26 ℃下以150 rpm转速振荡培养10天，获得细菌纤维素。将其取出，先用去离子水洗涤以去除多数残液，随后置于0.1 M NaOH溶液中煮沸30 min以去除细胞与热原，再用去离子水反复浸泡洗涤至pH呈中性。
（2）物理方法分散细菌纤维素。先用旋转刀片使细菌纤维素初步破碎3 min，再在18000 rpm转速下高速剪切5 min，然后在600 W超声强度下破碎处理5 min，获得细菌纤维素分散液。
（3）制备定向多孔支架。将细菌纤维素分散液倒入定向冷冻装置的两个中空区域之一，并用保温材料覆盖使该区域密闭。再将液氮倒入另一中空区域，进行定向冷冻直至细菌纤维素完全冻结。然后含细菌纤维素的装置转移至冷冻干燥机中，抽真空开始冻干，直至干燥完全。121 ℃下高压蒸汽灭菌15min，获得细菌纤维素定向多孔支架。
支架的宏观形貌如图4A所示，横截面、纵截面微观形貌分别如图4B、图4C所示，支架内部具有众多定向通道，通道的孔径为20～200 μm。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种改性细菌纤维素，其制备方法包括如下步骤：
S1)将纯化的细菌纤维素、改性剂分散在溶剂中，所述改性剂选自可食用的非动物源阳离子多糖、非动物源阳离子蛋白、天然氨基酸中的至少一种；
S2)充分反应得到改性细菌纤维素。
2.根据权利要求1所述的改性细菌纤维素，其特征在于：所述细菌纤维素和所述改性剂的质量比为1：(0.01～1)。
3.根据权利要求1或2所述的改性细菌纤维素，其特征在于：所述非动物源阳离子多糖选自壳聚糖、阳离子淀粉、阳离子瓜尔胶、阳离子葡聚糖、阳离子羧甲基纤维素、阳离子羟丙基甲基纤维素或上述物质衍生物中的至少一种；和/或
所述非动物源阳离子蛋白选自非动物源酪蛋白、麦蛋白、谷类蛋白、聚赖氨酸、聚赖氨酸盐酸盐；和/或
所述天然氨基酸选自甘氨酸、半胱氨酸盐酸盐、丙氨酸、谷氨酸钠、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、缬氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、胱氨酸、组氨酸或上述物质衍生物中的至少一种；和/或
所述细菌纤维素选自醋酸杆菌属（Acetobacter）、葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）、葡糖杆菌属（Gluconobacter）、朝井杆菌属（Asaia）、驹形杆菌属（Komagataeibacter）、产碱菌属（Alcaligenes）、八叠球菌属（Sarcina）、根瘤菌属（Rhizobium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、固氮菌属（Azotobacter）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、无色杆菌属（Achromobacter）、气杆菌属（Aerobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、利夫森氏菌属（Leifsonia）、沙门氏菌属（Salmonella）、欧文氏菌属（Erwinia）、肠杆菌属（Enterobacter）、希瓦氏菌属（Shewanella）、动胶菌属（Zoogloea）、红杆菌属（Rhodobacter）细菌所生成的细菌纤维素中的至少一种；和/或
所述溶剂选自水、氯化钠溶液中的一种。
4.一种细胞培养肉用生物支架，其制备方法包括如下步骤：
将权利要求1～3任一项所述的改性细菌纤维素分散于溶剂中，添加或不添加添加可食用的凝固点调节剂及适量可食用的增溶剂，得到支架分散液；
将所述支架分散液转移至定向或非定向冷却装置中，冷冻干燥去除溶剂，去除、不去除或部分去除凝固点调节剂，得到细胞培养肉用生物支架。
5.根据权利要求4所述的细胞培养肉用生物支架，其特征在于：所述支架分散液中，改性细菌纤维素的含量为0.05～2 wt%。
6.根据权利要求4或5所述的细胞培养肉用生物支架，其特征在于：所述凝固点调节剂选自食盐、碳酸钾、碳酸钠、碳酸钙、碳酸镁、碳酸氢钾、碳酸氢钠、碳酸氢钙、碳酸氢铵；和/或
所述增溶剂为酸或碱。
7.根据权利要求6所述的细胞培养肉用生物支架，其特征在于：所述酸选自盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸中的至少一种；和/或所述碱选自氢氧化钠、碳酸钠/钾、柠檬酸钠/钾中的至少一种。
8.根据权利要求4或5所述的细胞培养肉用生物支架，其特征在于：所述冷冻的温度为-200℃～-10℃。
9.根据权利要求4或5所述的细胞培养肉用生物支架，其特征在于：所述支架的平均孔径为10～1000 μm。
10.一种细胞培养肉，其特征在于：其支架为权利要求4～9任一项所述的支架。
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