KR20110138917A - 초음파 분해를 이용한 생분해성 고분자의 분자량 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초음파 분해를 이용한 생분해성 고분자의 분자량 조절 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 생분해성 고분자를 용매에 녹인 후, 0~48시간 동안 0~10℃에서 저온 보관하는 단계; 및 0~4℃의 온도 하에서 초음파의 인가 전압 세기 및 인가 시간을 조절하여 상기 생분해성 고분자의 분자량을 감소시키는 단계를 포함하는 생분해성 고분자의 분자량을 조절하는 방법 및 상기 방법으로 분자량이 조절된 생분해성 고분자에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 분자량이 조절된 생분해성 고분자는 초음파 분해로 인한 세포 독성 물질이 존재하지 않아 체내에 안정적이고, 큰 분자량으로 인해 활용도에 제약이 있었던 종래 생분해성 고분자에 비해 분자량이 감소되어 있으므로 생체 적합성이 개선되는 효과가 있으며, 그 활용도가 더욱 증가되어 조직재생용 지지체, 약물전달용 고분자, 하이드로겔, 의료기기, 드레싱, 화장품용 고분자, 생체재료, 조직공학 또는 생분해성 의료용 고분자와 같은 각종 소재로 널리 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

초음파 분해를 이용한 생분해성 고분자의 분자량 조절 방법{Method for controlling molecular weight of biodegradable polymer by ultrasonic treatment}

본 발명은 초음파 분해를 이용한 생분해성 고분자의 분자량 조절 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 체내 안정적이고 생체적합성이 우수한 생분해성 고분자의 제조를 위해 초음파 분해를 이용한 생분해성 고분자의 분자량 조절 방법 및 상기 방법에 의해 분자량이 조절된 생분해성 고분자에 관한 것이다.

조직공학(Tissue Engineering)은 생명과학과 공학의 개념이 합쳐져서 탄생한 새로운 첨단 학문 분야로서, 최근 장기가 필요한 환자수의 급증과 이를 대체할 이식재의 결핍으로 인해 특히 주목받고 있는 분야이다. 이러한 조직공학은 조직 및 장기를 체외에서 생산하고 이를 체내에 이식함으로써 인체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 그 목적으로 하고 있으며, 그 원리를 살펴보면, 먼저 환자의 몸에서 필요한 조직을 약간 채취하고 그 조직편으로부터 세포를 분리한 다음 분리된 세포를 배양을 통하여 필요한 양만큼 증식시키고 다공성 생분해성 담체와 함께 일정기간 체외에서 배양한 뒤, 이 세포 구조물을 다시 인체 내에 이식하는 것이다. 이식 후 세포들은 신생 혈관이 형성될 때 까지는 체액의 확산에 의해 산소와 영양분을 공급받다가 인체내에서 혈관이 형성 및 성장하여 혈액의 공급이 이루어지면 세포들이 증식 및 분화하여 새로운 조직 및 장기를 형성하고 고분자 담체는 분해되어 없어지게 된다.

따라서 조직공학의 연구는 우선 조직과 유사한 생분해성 고분자 기질 또는 담체를 인공적으로 제조하는 일에서부터 시작되며, 인체 조직의 재생을 위해 사용되는 기질 또는 담체 재료가 가져야할 조건은 조직세포의 유착과 증식이 잘 되어야 하며 분화된 세포의 기능이 보전되어야 하고, 체내에 이식된 후에도 주위 조직과 융화가 잘 되어야 하며, 주위 세포들에 대해 부작용 또는 독성을 유발시키지 않아야 할 뿐만 아니라 일정 기간이 지난 후 스스로 분해하여 이물질로 남지 않아야 한다.

현재, 조직공학적 인공장기에 사용되고 있는 재료는 그 특성에 따라서 다양하게 분류될 수 있으며 재료 원료의 생성에 따라 천연에서 존재하는 물질인 천연재료와 인간이 합성하여 만든 합성재료들이 사용되고 있다. 또한 체내에서 물이나 효소들에 의한 분해 여부에 따라서 비분해성 재료와 생분해성 재료로 나눌 수 있다. 이러한 재료의 예로서, 합성고분자 재료로는 폴리에스테르 계열의 폴리락트산(poly(lactic acid), PLA), 폴리글리콜산(poly (glycolic acid), PGA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactide-co-glycolide), PLGA), 폴리하이드록시뷰티릭산(poly(hydroxybutyric acid), PHB), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리안하이드라이드(polyanhydride, PA), 폴리시아노아크릴레이트(polycianoacrylate, PCA), 폴리다이옥사논(polydioxanon) 및 폴리포스파젠(polyphosphazen)등이 사용되고 있다. 이러한 합성 고분자는 천연 고분자에 비하여 물성이 우수하고 분해기간의 조절이 가능한 장점을 가지고 있으나 체내에서 면역반응이 야기되고, 소수성의 표면으로 인해 세포의 부착이 어려운 단점이 있다.

또한, 천연 고분자로는 전분(starch), 덱스트린(dextrin), 헤파린(heparin), 피브린(fibrin), 키틴(chitin), 키토산(chitosan), 알긴산(alginic acid), 구연산(citric acid), 콘드로이틴(chondroitin), 케라틴 설페이트(keratin sulfate), 아가로오스(agarose), 젤라틴(gelatin) 및 히알루론산 등의 재료가 사용되고 있다. 이러한 천연 고분자는 천연에서부터 유래되었기 때문에 독성이 적고 세포 부착율이 높은 장점이 있으나 기계적 강도가 약하고 분해속도의 조절이 어려운 단점이 있다.

이러한 천연 고분자들 중에서 특히 히알루론산은 β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 교대로 결합된 직쇄상의 고분자로서 분자량이 50,000~10,000,000Da 또는 그 이상인 다당류이다. 또한, 히알루론산은 생체 결합조직의 기본물질로서 주로 포유동물의 피부, 관절의 활액, 눈의 초자체액, 탯줄, 혈청, 닭 벼슬 등에 분포해 있고, 연쇄구균이나 간균류의 협막 등에도 존재하는 것으로 알려져 있다. 또한, 천연 히알루론산은 종간 특이성을 갖지 않으며 조직이나 장기 특이성을 갖지 않아 그 유래에 관계없이 생체에 이식 또는 주일할 경우 우수한 생체 적합성을 나타내는 것으로 알려져 있다.

따라서 히알루론산을 조직공학에 응용하여 생체 재료로 사용하기 위한 노력들이 시도되고 있는데, 특히 히알루론산은 그자체로 비면역체이며, 점성과 친수성을 가지기 때문에 안과용 눈물이나 관절의 유동체액 또는 안과수술시 보조매체로 사용되어 왔으며, 조직 수복용 재료로써 히알루론산을 가교결합시켜 다공성의 지지체를 제조하여 체외 또는 체내 이식하려는 연구들이 시도되고 있다.

그러나 이러한 노력에도 불구하고 고분자 히알루론산은 그 분자량이 매우 커서 생체 소재료의 응용에 한정적이며, 세포와 특이적으로 결합할 수 있는 기능기가 부족한 문제점이 있으며, 큰 분자량으로 인해 응집을 통한 생체내 지지체의 제조에 너무 많은 시간이 소요되는 문제점이 있다.

따라서 히알루론산을 포함한 분자량이 매우 큰 천연 고분자들의 분자량을 조절하여 보다 응용범위가 넓고 생체 적합성을 높일 수 있는 기술에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있는데, 이와 관련된 기술로서 현재 고분자량의 천연 고분자를 저분자화 시키는 방법으로 특정효소의 처리 또는 천연 고분자의 화학구조를 절단시키는 방법(예컨데, 산처리 또는 염기성용액 처리)이 개발된 바 있다.

특정효소를 처리하는 방법으로는 국내특허 제98-034824호에 키토산을 젖산에 용해한 다음 가수분해 효소를 첨가하여 저분자의 키토산 올리고당을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 국내특허 제2001-0105888호에는 주석산과 키토산 분해효소를 이용하여 고순도의 키토산올리고당을 제조하는 방법이 개시되어 있다.

또한, 고분자량의 천연 고분자를 화학 처리하여 분자량을 조절방법의 경우, 국내특허 제97-015604호에 과산화수소, 초산, 황산을 첨가하여 저분자의 수용성 키토산을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 국내특허 제99-0049775호는 베젠셀레닉에시드 혼합액 및 과산화수소를 첨가하여 저분자의 수용성 키토산을 제조하는 방법이 개시되어 있다.

그러나 이와 같이 산 또는 염기로 분자량을 조절하는 경우에는 산성 용액 또는 염기성 용액의 과다한 발생으로 인해 환경문제가 발생하고, 고분자 분자쇄의 불규칙한 절단 및 반응 후 불순물로 잔존하는 각종 화학물질에 따른 안전성 미확보 등의 문제자 발생하고 있다. 또한, 효소처리에 의한 저분자량화 기술의 경우 효소 자체가 고가의 물질임과 동시에 효소의 기능을 유지하기 위해서는 반응조건을 적절히 유지하여야 하므로 공정의 단가가 높아지는 문제점이 있다.

따라서 이러한 종래 기술의 문제점을 극복할 수 있음과 동시에 체내에 안정적이고 생체적합성을 보다 높일 수 있는 새로운 천연 고분자의 분자량 조절 기술이 요구되고 있다.

따라서 본 발명의 목적은 체내 안정성이 우수하고 생체 적합성이 뛰어난 새로운 천연 고분자를 제공하기 위해 생분해성 고분자를 초음파 분해하여 분자량을 조절할 수 있는 생분해성 고분자의 분자량 조절 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 분자량이 조절된 생분해성 고분자를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 생분해성 고분자를 조직재생용 지지체, 약물전단용 고분자, 하이드로겔, 드레싱용 고분자 및 화장품용 고분자로 이루어진 군 중에서 선택되는 소재로 사용하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은,

생분해성 고분자를 용매에 녹인 후, 0~48시간 동안 0~10℃에서 저온 보관하는 단계; 및

0~4℃의 온도 하에서 초음파의 인가 전압 세기 및 인가 시간을 조절하여 상기 생분해성 고분자의 분자량을 감소시키는 단계를 포함하는, 생분해성 고분자의 분자량을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 히알루론산, 키토산, 키틴, 알긴산, 헤파린, 전분, 잔탄, 플루란 및 폴리 아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 천연 고분자일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 용매는 증류수일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 초음파의 인가 전압 세기는 2 V~1.0 kV일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 초음파의 인가 시간은 1초~1일(24시간)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 다공성 지지체, 필름, 디스크 또는 비드 형태일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의해 분자량이 조절된 생분해성 고분자를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분자량이 조절된 생분해성 고분자는 평균분자량이 1000 Da~15,000,000 Da일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 히알루론산, 키토산, 키틴, 알긴산, 헤파린, 전분, 잔탄, 플루란 및 폴리 아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 천연 고분자일 수 있다.

나아가 본 발명은 본 발명에 따른 생분해성 고분자를 조직재생용 지지체, 약물전단용 고분자, 하이드로겔, 드레싱용 고분자 및 화장품용 고분자로 이루어진 군 중에서 선택되는 소재로 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따라 분자량이 조절된 생분해성 고분자는 초음파 분해로 인한 세포 독성 물질이 존재하지 않아 체내에 안정적이고, 큰 분자량으로 인해 활용도에 제약이 있었던 종래 생분해성 고분자에 비해 분자량이 감소되어 있으므로 생체 적합성이 개선되는 효과가 있으며, 그 활용도가 더욱 증가되어 조직재생용 지지체, 약물전달용 고분자, 하이드로겔, 의료기기, 드레싱, 화장품용 고분자, 생체재료, 조직공학 또는 생분해성 의료용 고분자와 같은 각종 소재로 널리 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서 초음파 처리에 따라 분해된 히알루론산을 NMR(Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)로 분석한 결과를 나타낸 그래프로서, (A)는 초음파 처리 하지 않은 히알루론산, (B)는 초음파 분해기를 10분간 처리한 것, (C)는 초음파 분해기를 30분간 처리 한 것, (D)는 초음파 분해기를 1시간 동안 처리한 것을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 초음파 처리에 따라 분해된 각각의 히알루론산을 전기 영동하여 염색한 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 초음파 처리에 따라 분해된 각각의 히알루론산에 대한 점도 변화를 Rheometer를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 초음파 처리에 따라 분해된 히알루론산을 각 농도별로 hMSC(human Mesenchymal Stem Cell)에 처리한 후, 세포의 독성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 동물실험을 통해 본 발명에 따라 초음파 처리로 분해된 히알루론산을 hMSC와 혼합한 후, 황반변성이 유도된 흰쥐 모델을 대상으로 흰쥐의 망막에 주사한 후의 세포변화를 광학현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것으로서, 1)의 A는 AMD 3주 후 망막을 나타낸 사진으로서 히알루론산 및 hMSC가 주사되지 않은 대조군이며, B는 AMD 유발 1주 후에 subretinal space로 히알루론산-hMSC 주사하고 2주 경과되었을 때의 망막을 나타낸 것이며, 2)의 A는 AMD 3주 후 망막을 나타낸 사진으로서 히알루론산 및 hMSC가 주사되지 않은 대조군이며, B는 AMD 유발 1주 후 망막에 히알루론산-hMSC를 vitreous body 공간으로 주사하고 2주 경과된 후의 망막을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따라 초음파 처리된 히알루론산과 플루로닉 127을 혼합한 후, 겔화되는 온도 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 체내 안정성이 우수하고 생체 적합성이 뛰어나 다양한 생체 또는 의료용 소재로 사용할 수 있는 천연 고분자를 제공하기 위해 생분해성 고분자를 초음파 분해하여 분자량을 조절할 수 있는 생분해성 고분자의 분자량 조절 방법을 제공함에 그 특징이 있다.

일반적으로 상기 생분해성 고분자란 박테리아, 조류, 곰팡이와 같은 자연에 존재하는 미생물 또는 효소 등에 의해 물과 이산화탄소 또는 물과 메탄가스로 완전히 분해되는 고분자 물질을 말하는 것으로서, 이러한 생분해성 고분자 물질은 크게 천연 고분자, 합성 고분자 또는 미생물 생산 고분자로 구분될 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 생분해성 고분자는 상기 기술된 생분해성 고분자를 포함하는 당업계에 공지된 생분해서 고분자라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 천연 고분자를 사용할 수 있다.

상기 천연 고분자의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 히알루론산, 키토산, 키틴, 알긴산, 헤파린, 전분, 잔탄, 플루란 및 폴리 아미노산을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 히알루론산을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 상기 천연 고분자들은 합성 고분자에 비해 천연으로부터 유래되었기 때문에 독성이 적고 생체 친화성이 우수한 장점이 있어 최근들어 합성 고분자에 비해 그 사용률이 증가하고 있는 반면, 기계적 강도가 약하고 분해속도의 조절이 어려운 단점이 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따르면, 생체 적합성이 우수한 생분해성 고분자의 제조를 위해 천연 고분자로서 히알루론산을 사용하였다.

상기 히알루론산은 음이온, 비황산화 뮤코다당체(글리코사미노글리칸)fhtj, 결합, 상피 및 신경 조직에 많이 분포되어 있고, 세포의 증식 및 이동에 매우 큰 영향을 주고 있어 현재 조직 공학 및 약물 전달체에 대한 연구에 각광받고 있는 천연 고분자 화합물로서 그 구조식은 하기에 나타낸 바와 같다.

또한, 히알루론산은 이 외에도 결체조직(connective tissue) 및 눈의 초자체액(vitreous humor), 관절의 윤활액, 피부, 탯줄, 동맥혈관벽 등에서는 기질로 작용하고, 조직 장벽을 이루어 대산물질만 투과시키고 세균과 같은 전염성 물질은 통과를 막는 역할을 수행할 뿐만 아니라 생체 적합성이 우수한 특징이 있다.

그러나 이러한 히알루론산 역시 다른 천연 고분자들과 마찬가지로 분자량이 매우 커서 그 활용도에 한계가 있다는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 히알루론산을 포함하는 생체 친화성이 우수한 천연 고분자의 활용 가치를 더욱 개선하기 위한 목적으로 상기 천연 고분자의 분자량을 초음파 분해를 통해 매우 손쉽고 간단하게 조절하는 방법을 최초로 규명하였다.

따라서 본 발명은 생분해성 고분자를 용매에 녹인 후, 0~48시간 동안 0~10℃에서 저온 보관하는 단계; 및 0~4℃의 온도 하에서 초음파의 인가 전압 세기 및 인가 시간을 조절하여 상기 생분해성 고분자의 분자량을 감소시키는 단계를 포함하는 생분해성 고분자의 분자량을 조절하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 따른 상기 생분해성 고분자의 분자량 조절 방법을 보다 구체적으로 설명한다.

먼저, 생분해성 고분자의 분자량 조절을 위해, 생분해성 고분자를 용매에 녹인 후, 저온 보관할 수 있다.

이때 상기 용매는 생분해성 고분자를 용해시킬 수 있는 용매라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 증류수를 사용할 수 있으며, 상기 생분해성 고분자는 0.1~3%의 농도가 되도록 상기 용매에 용해시킬 수 있다.

또한, 상기 저온 보관은 0~48시간 동안 0~10℃에서 보관할 수 있으며, 바람직하게는 4~6℃의 온도에서 24시간 동안 보관할 수 있다.

이후, 상기 용매에 생분해성 고분자가 모두 용해되면, 생분해성 고분자의 분자량을 감소시키기 위해 초음파를 인가할 수 있다.

상기 초음파 인가는 초음파 인가 전압 세기 및 인가 시간을 조절하여 수행할 수 있으며, 바람직하게 상기 초음파 인가 전압 세기는 2 V~1.0 kV의 세기로 수행할 수 있고, 인가 시간은 1초~24시간 동안 인가할 수 있다.

또한, 상기 초음파 인가 시간 동안에는 상기 생분해성 고분자가 열에 의한 영향을 배제시키기 위해 얼음을 이용하여 온도가 0~4℃가 유지되도록 한다.

이는 생분해성 고분자의 경우 열을 가하게 되면 고분자의 활성 또는 구조가 손쉽게 변화를 일으켜 안정성을 잃으며 그 구조도 변화되기 때문이다. 따라서 초음파 인가 조건은 상기 기술된 조건 하에서 수행하는 것이 바람직하다.

나아가, 초음파 처리에 의해 분자량이 감소된 상기 생분해성 고분자는 상기 고분자로부터의 분해 산물을 제거하기 위해 투석 과정을 추가로 수행할 수 있다.

상기 투석은 당업계에 공지된 투석막을 이용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 투석 막의 분자량 컷오프가 1000~10,000Da인 투석막을 사용하여 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 분자량 컷오프가 5000~10,000Da인 투석막을 사용하여 수행할 수 있다.

상기 투석막의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 셀룰로오즈, 합성 셀룰로오즈 및 완전 합성막이 있으며, 바람직하게는 셀룰로오즈를 사용할 수 있다.

투석 과정이 완료되면 이후, 분해 산물이 제거된 생분해성 고분자를 동결건조기를 이용하여 건조시킬 수 있으며, 이때 동결건조기의 온도는 -90℃이하, 바람직하게는 -90 ~ -150℃의 온도 및, 5 mtorr 이하의 압력, 바람직하게는 0 ~ 5mtorr의 압력에서 1 시간 ~ 3일 동안 동결 건조할 수 있다.

또한, 상기 동결건조로부터 수득한 생분해성 고분자는 이후 진공 건조기를 이용하여 다시 한번 건조하는 과정을 수행할 수 있는데, 이때 진공 건조기의 온도는 상기 동결건조기에 비해 높은 온도인 10~40℃의 온도 및 0mmHg ~ -760mmHg의 압력 하에서 0~48 시간 동안 수행할 수 있다.

이상, 상기 기술된 방법과 같이 분자량이 매우 높은 생분해성 고분자, 바람직하게는 생분해성 천연 고분자는 초음파 분해를 통해 분자량이 조절되어 분자량이 감소된 생분해성 천연 고분자로 제조될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 생분해성 천연 고분자로서 히알루론산을 이용하여 초음파를 각각 시간별(10분, 30분 및 1시간)로 인가한 후, 초음파를 인가하지 않은 히알루론산과의 분자량 변화를 측정하기 위해 전기영동 실험을 수행한 결과, 초음파를 인가하지 않은 경우의 히알루론산은 분자량이 큰 형태로 그대로 유지되어 있는 것으로 나타난 반면, 초음파를 처리한 경우, 처리 시간이 증가할수록 분자량이 큰 히알루론산의 양은 점점 감소하는 것으로 나타났고, 이에 따라 분자량이 감소된 히알루론산의 양은 점점 증가하는 것으로 나타났다(도 2 참조).

따라서 본 발명의 방법에 의해 분자량이 조절된 상기 생분해성 고분자는 평균 분자량이 1000 Da~15,000,000 Da인 생분해성 고분자일 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 분자량이 조절된 상기 생분해성 고분자는 다공성 지지체, 필름, 디스크 또는 비드 형태로 제조하여 사용할 수 있으며, 이러한 형태로 제조하여 사용할 경우 생분해성 고분자의 표면과 내부에 초음파가 균일하게 인가될 수 있다.

한편, 본 발명에 따라 초음파 분해로 인해 분자량이 감소된 생분해성 고분자는 체내에 안정하며, 본 발명에 따른 초음파 분해 방법은 체내에 유독한 물질을 생산하지 않는 특징이 있다.

즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 히알루론산을 이용하여 상기 기술된 방법으로 초음파 분해 과정을 수행한 후 초음파 분해 산물들에 대하여 NMR 및 전기영동 분석 과정을 통해 부가적인 화합물의 생성 여부를 확인한 결과, 두 실험 모두에서 부가적인 화합물은 존재하지 않는 것으로 나타났으며, 특히 세포 독성을 유발시키는 어떠한 화학적 물질도 존재하지 않는다는 것을 알 수 있었다(도 1 및 도 2 참조).

나아가 본 발명자들은 본 발명의 방법에 의해 분자량이 조절된, 즉, 분자량이 감소된 생분해성 고분자가 실제적으로 세포에 대해 안정한지를 조사하기 위해, 본 발명의 일실시예에서, 초음파로 분해된 히알루론산을 각 농도별로 세포에 처리한 후, 배양 시간에 따른 세포의 생존율을 조사하였다.

그 결과, 초음파로 분해된 히알루론산을 0.1%, 0.01% 및 0.001%의 농도로 처리한 군 모두가 세포에 거의 독성이 유발되지 않아 거의 100%의 세포 생존율을 보였다(도 4 참조).

따라서 상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 초음파 분해 방법을 통해 히알루론산을 포함하는 고분자량의 생분해성 천연 고분자 분자량을 감소시킬 경우, 분자량이 감소된 생분해성 천연 고분자가 세포에 매우 안정적이고 독성을 유발시키는 어떠한 부가 산물도 생성하지 않는다는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 분자량이 감소된 생분해성 고분자가 생체 내에서 생체 친화성이 우수한지를 확인하기 위해, 초음파 분해로 분자량이 감소된 히알루론산을 중간엽 줄기세포(rMSC)와 혼합시킨 후, sodium iodate로 복강 주사하여 연령관련 황반변성(AMD)이 유발된 흰주 동물 모델의 안구(망막밑 공간 및 유리체 공간)에 주사한 다음, 망막에서의 세포 회복 정도를 확인하였으며, 대조군으로는 히알루론산과 중간엽 줄기세포의 혼합물을 주사하지 않은 군을 사용하였다.

그 결과, rMSC-히알루론산 복합체를 망막밑 공간으로 주사하지 않은 대조군은 색소상피가 손상 받고 이어서 망막분리가 심하게 일어나 있는 것으로 관찰된 반면 rMSC-히알루론산 복합체를 주사한 경우에는 분리된 망막의 광수용 세포층이 보다 안정적인 배열상을 보이는 것으로 나타났으며, rMSC-히알루론산 복합체를 유리체 공간으로 주사한 경우에는 대조군에 비해 신경세포의 배열이나 세포의 수가 정상적인 모습으로 회복되어 있는 것으로 나타났다(도 5 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명에 따라 초음파로 분자량이 조절된 생분해성 고분자는 세포에 대한 적합성이 우수하며, 특히 조직공학 또는 약물 전달을 위한 소재로 매우 유용하게 활용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 초음파 분해방법에 의해 분자량이 조절된 생분해성 고분자로부터 제조된 물품을 제공할 수 있으며, 이러한 물품의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 조직재생용 지지체, 약물전달용 고분자, 하이드로겔, 드레싱용 고분자 또는 화장품용 고분자일 수 있다.

그러므로 본 발명은 상기 본 발명에 따른 생분해성 고분자를 조직재생용 지지체, 약물전달용 고분자, 하이드로겔, 드레싱제 또는 화장품용 고분자의 소재로 사용하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 본 발명에 따라 초음파로 분해되어 분자량이 감소한 생분해성 고분자가 적용 가능한 상기 조직재생용 지지체의 예로는, 이에 제한되지는 않으나, 폴리락티드 지지체, 폴리글리콜리드 지지체, 폴리글리콜리드-글리콜리드 공중합체 지지체, 키토산 지지체, 히알루론산 지지체, 콜라겐 지지체, 폴리카프롤락톤 지지체, 폴리에틸렌옥사이드 지지체를 포함할 수 있고, 약물전달용 고분자의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 키토산, 히알루론산, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리프로필렌옥사이드-에틸렌옥사이드 공중합체를 포함할 수 있으며, 상기 하이드로겔의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 키토산, 히알루론산, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알콜, 폴리비닐리돈을 포함할 수 있다.

또한, 상기 드레싱제의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 키토산 드레싱제, 알긴산 드레싱제, 히알루론산 드레싱제을 포함할 수 있고, 화장품용 고분자의 예는 콜라겐, 키토산, 엘라스틴, 알긴산, 히알루론산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 생체재료의 예로는 약물과 결합된 키토산, 약물과 결합된 폴리락티드, 약물과 결합된 히알루론산, 하이드로젤의 구성성분으로서의 폴리락티드, 키토산 및 히알루론산, 또는 폴리에틸렌옥사이드을 포함할 수 있고, 조직공학의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 골 재생용 폴리락티드, 피부재생용 키토산, 연골재생용 폴리락티드-글리콜리드 공중합체, 주름개선용 히알루론산, 주름개선용 콜라겐 또는 엘라스틴을 포함할 수 있다.

상기 생분해성 의료용 고분자의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 폴리락티드, 폴리카프롤락톤, 키토산, 히알루론산, 콜라겐, 헤파린 또는 폴리비닐알콜을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 분자량이 조절된 생분해성 물질로부터 형성된 생체재료, 조직공학 또는 생분해성 의료용 고분자 등은 조절된 분자량으로 인해 체내에서의 분해속도가 조절되므로, 지지체에 세포배양을 통하여 인체조직을 재생을 유도할 때 지지체의 분해속도를 가속화함으로써 조직의 재생속도를 빨리 유도할 수 있으며, 체내에 안정적이고 생체 적합성이 우수하므로 종래에 사용되던 생체 소재보다 그 효과가 우수하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

초음파 분해를 이용한 히알루론산 고분자의 제조

본 발명자들은 조직공학 및 각종 생체재료로 사용하기에 많은 장점을 가지는 히알루론산이 분자량이 너무 커서 그 용도가 제한적이라는 문제점을 해결하기 위해 초음파 분해를 이용하여 생체 적합성이 우수한 히알루론산 고분자를 제조하였는데, 이를 위해, 히알루론산(Fluka 53747)을 3차 증류수 100ml에 0.03%, 0.3% 및 3%의 농도가 되도록 각각 첨가한 후, 하루 동안 4℃의 저온 저장실에 보관하여 용해시켰다. 이후 초음파 분해기를 이용하여 각 분자량을 가지는 히알루론산이 되도록 분해시켰는데, 이때 초음파 인가 전압은 90%(0.9kV)로 하였고, 초음파 인가 시간은 10분, 30분 및 1시간으로 하였다. 또한, 초음파를 인가할 때 열이 발생할 수 있으므로 인가하는 동안에는 얼음을 자주 갈아서 열에 의한 다른 작용이 발생하지 않도록 하였다.

이후 상기와 같이 초음파 분해를 통해 얻은 여러 가지 분자량의 히알루론산으로부터 분해 산물을 제거하기 위해 투석을 수행하였다. 즉, 분자량이 7000인 셀룰로오스 막을 이용하여 투석을 수행하였으며, 이후, 상기 투석을 통해 분해 산물이 제거된 히알루론산을 동결건조기를 이용하여 건조시켰으며, 이때 동결건조기의 온도는 -90℃가 되도록 하였고 압력은 5mtorr가 되도록 하였으며, 2틀 동안 건조를 수행하였다. 그런 뒤, 동결건조기를 통해 건조된 히알루론산은 진공 건조기를 사용하여 다시 건조시켰고, 이때 진공 건조기의 온도는 40℃가 되도록 하였고, 압력은 -760mmHg가 되도록 하였으며 하루 동안 건조시킴으로써 초음파 분해된 히알루론산을 수득하였다.

< 실시예 2>

NMR 을 통한 초음파 분해된 히알루론산 고분자의 분석

상기 실시예 1의 방법에 따라 초음파로 분해된 히알루론산을 대상으로 NMR 분석을 통해 추가 부가생성물의 존재 여부 및 분해된 분자량을 조사하였다. 이를 위해 상기 실시예에서 초음파를 10분, 30분 및 1시간 동안 인가하여 수득한 히알루론산을 중수소가 치환된 물에 용해시킨 후, 일르 저온저장고에서 하루 동안 방치시켰다. 이후 상기 용액을 NMR 전용 튜브로 옮기고 400 MHz NMR을 이용하여 ¹H-NMR(Bruker)을 측정하였으며, 결과 그래프를 도 1에 나타내었다. 이때 대조군으로는 초음파를 사용하지 않은 것을 사용하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 초음파 인가 시간을 적용하여 수득한 히알루론산을 NMR을 통해 분석한 결과, 초음파 분해에 의한 부가 생성물은 존재하지 않는 것으로 나타났으며, 따라서 초음파 분해 처리를 통해 히알루론산을 분해하는 본 발명의 방법은 히알루론산의 분자량 조절에만 관여한다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

전기영동을 통한 초음파 분해된 히알루론산 고분자의 분석

나아가 본 발명자들은 상기 NMR 방법 이외에도 전기영동 방법을 통해 초음파로 분해된 히알루론산의 분자량을 분석하였는데, 상기 실시예 1에서 수득한 초음파 분해된 히알루론산(초음파를 10분, 30분 및 1시간 인가한 것) 각각을 0.3%의 농도가 되도록 증류수에 녹인 후 트랙킹 염색약과 함께 폴리아클릴 아마이드 겔에 로딩하여 100V의 전압하에서 2시간 동안 전기영동을 수행하였다. 이후 0.2% 톨루이딘 블루 시약을 이용하여 겔을 염색한 다음, 3% 아세트산 용액을 이용하여 탈색하고 각각의 히알루론산의 분자량을 확인하였다. 이때 대조군으로는 초음파를 인가하지 않은 것을 사용하였다. 또한, 본 발명자들은 Rheometer를 이용하여 각각의 시간으로 초음파를 인가하여 분해시킨 히알루론산의 시간에 따른 점도 변화를 측정하였으며, 점도 변화의 측정은 당업계에 공지된 Rheometer 기기의 사용 설명서에 따라 수행하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 전기영동 분석 결과에서도 NMR 분석과 동일하게 초음파 인가로 인한 다른 부가적인 화합물은 생성되지 않았다는 것을 알 수 있었고, 초음파 분해 처리 시간에 따라 히알루론산의 분자량이 변화하고 있는 것으로 나타났으며, 초음파 분해 처리 시간이 길수록 히알루론산은 더 많이 분해되어 저분자량의 히알루론산이 생성되는 것을 알 수 있었다. 즉, 초음파를 인가하지 않은 경우, 고분자량의 히알루론산이 많은 양으로 존재하고 있는 반면, 초음파를 10분 및 30분 인가한 것에 비해 1시간 인가한 경우에는 고분자량 히알루론산의 양이 감소한 것으로 나타났고, 저분자량의 히알루론산이 증가한 것으로 나타났다.

또한, 초음파 처리 시간에 따른 히알루론산의 점도 변화를 측정한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 초음파를 처리하지 않은 대조군의 경우 고분자량의 히알루론산이 분해되지 않아 점도가 높은 상태를 계속 유지하고 있는 반면, 초음파를 처리한 경우에는 히알루론산이 분해되어 점도가 대조군에 비해 현저하게 낮아지는 것으로 나타났다.

< 실시예 4>

세포독성 실험

상기 실시예 1을 통해 수득한 초음파 처리된 히알루론산에 대하여 여러 가지 농도에서의 세포 독성 실험을 수행하였다. 실험방법은 상기 초음파 처리 시간(0분, 10분, 30분 및 1시간)에 따라 수득한 히알루론산을 각각 0.1%, 0.01% 및 0.001 %가 되도록 hMSC 배양용 배지(DMEM, Gibco 11885)에 녹인 후, 34℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후, 상기 배지를 96웰 플레이트에서 하루 동안 배양된 세포에 각각 200 ㎕씩 분주하였다. 이때 각 well당 세포의 수는 1.0 × 10⁴(P = 7)이 되도록 하였으며, 배지는 2틀에 한번 씩 교체해주었고, 1일째, 3일째, 5일째 세포의 생존 정도를 관찰하였는데, 세포의 생존정도는 ethidium-1 HD/calcein AM (Invitrogen L3224)의 LIVE/DEAD 어세이 방법을 통해 확인하였다. 또한, 양성대조군으로는 웰 플레이트 바닥을 사용하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 초음파 분해된 본 발명의 히알루론산은 초음파 분해에 의해 세포의 독성을 유발시키는 어떠한 화학물질도 없다는 것을 알 수 있었고, 따라서 초음파 처리에 의해 분해된 히알루론산은 생체에 아무런 부작용 없이 사용 가능하므로 생체 적합성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

초음파로 분해된 히알루론산의 생체친화성 분석

초음파로 분해된 본 발명의 히알루론산의 생체친화성 테스트를 위해 흰쥐를 이용한 동물실험을 수행하였다, 즉, 흰쥐에 생리식염수에 용해된 sodim iodate를 복강에 주사(50 mg/kg 체중)하여 황반변성(AMD) 흰쥐 모델을 제작한 것을 사용하였으며, 흰쥐 중간엽 줄기세포(rMSC)는 3 passage의 세포를 사용하였고, SC 배양액(DMEM 90%, FBS 10%, BDNF 10 ng/ml)과 상기 본 발명의 히알루론산 화합물(10분간 초음파를 처리한 것)을 1:3의 비율로 희석하여 동물 주사 용량 10 ul에 1× 10⁵개의 세포가 탑재되도록 하였다. 이후 상기 황반변성 모델 흰쥐의 안구에 히알루론산과 rMSC의 혼합물을 주사하였는데, 먼저 흰쥐를 4% chloral hydrate(ml/100 g 체중)로 마취시킨 후 prone position에서 우측 안구에 산동제를 점안하여 동공을 확대시키고, 얼음에 재워 놓은 rMSC-히알루론산 복합체를 고압 소독된 30G 주사기에 채워 넣은 다음, 미세수술 현미경 하에서 공막(sclera)을 관통하여 안구 위4분구(superior quadrant)의 망막밑 공간(subretinal space) 및 안구앞방(anterior chamber)을 지나 코쪽 4분구(nasal quadrant)의 유리체 공간(intravitreous body)으로 각각 주사하였다. 이후 2주간 경과시킨 다음 양안을 적출하고, 시각신경원반(optic disc)에서부터 섬모체(ciliary body)에 이르는 부위의 rMSC 주사 부위를 포함한 안구 4분구의 조직을 취하여 광학현미경용 wax 포매 조직 절편 작성하고 염색하였으며, rMSC 주사군 및 실험대조군은 망막의 중간부분에서 망막 및 맥락막(choroid) 조직상을 촬영하여 비교 분석하였다. 이때 대조군으로는 rMSC-히알루론산 복합체를 투여하지 않은 황반변성(AMD) 흰쥐를 사용하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, rMSC-히알루론산 복합체를 망막밑공간으로 주사한 경우, 대조군인 AMD의 3주 망막은 색소상피가 손상 받고 이어서 망막분리가 심하게 일어나 있는 것으로 관찰된 반면, AMD 1주 후에 subretinal space로 히알루론산-hMSC 주사한 경우에는 분리된 망막의 광수용 세포층이 보다 안정적인 배열상을 보이는 것으로 나타났다. 또한, rMSC-히알루론산 복합체를 유리체 공간으로 주사한 경우에는 대조군에 비해 AMD 1주 후 히알루론산-hMSC를 주사한 군이 대조군 망막의 신경절 세포층에 비해 신경세포의 배열이나 수적인 면에서 정상적인 모습으로 회복되어 있는 것으로 나타났다.

< 실시예 6>

본 발명에 따라 제조된 초음파 처리된 히알루론산의 겔화 온도 측정

상기 실시예 1을 통해 수득한 초음파 처리된 히알루론산에 대하여 플루로닉 127의 혼합용액의 젤화 온도 측정을 수행하였다. 실험 방법은 10분, 30분 1시간 초음파 분해 처리 된 히알루론산을 각 0.3 %로 만든 용액에, 플루로닉을 최종 농도가 18% 되게 넣어 준 후 하루 동안 저온 저장실에서 rotator를 이용하여 잘 섞어 준다. 얼음에 박아서 거품을 없앤 뒤, 레오미터를 이용하여 겔화 온도를 측정하였다. 측정 조건은, ramp rate 2 ℃/min, oscillation stress는 0.5968로 맞추고, 10℃에서 50℃ 사이에서 겔화 온도를 측정하였다.

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 초음파 분해 처리 시간이 긴 히알루론산을 이용한 경우 겔화 온도가 늦게 형성 되는 것을 확인할 수 있었으며, 겔화 온도에서의 점탄성률은 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 이는, 초음파 분해처리 시간이 길어질수록 히알루론산의 분자량이 낮아져, 플루로닉 127과 네트워크를 형성하는데 걸리는 시간이 보다 더 걸리기 때문이며, 마찬가지로 초음파 분해 처리를 더 오래할 수록 분자량이 낮아지기 때문에 겔을 형성 하였을 때 점탄성률이 낮게 형성된다.

이상과 같은 결과를 통해, 본 발명자들은 본 발명의 방법에 따라 초음파로 분해된 히알루론산의 경우 세포에 대한 독성 물질이 생성되지 않아 체내 안정성이 우수하고, 초음파 처리된 히알루론산을 생체용 고분자지지체로 사용할 경우 생체친화성이 우수하므로 조직 공학 재료 및 약물 전달 물질의 제조에 유용하게 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

1. 생분해성 고분자를 용매에 녹인 후, 0~48 시간 동안 0~10℃에서 저온 보관하는 단계; 및
   0~4℃의 온도 하에서 초음파의 인가 전압 세기 및 인가 시간을 조절하여 상기 생분해성 고분자의 분자량을 감소시키는 단계를 포함하는, 생분해성 고분자의 분자량을 조절하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 생분해성 고분자는 히알루론산, 키토산, 키틴, 알긴산, 헤파린, 전분, 잔탄, 플루란 및 폴리 아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 천연 고분자인 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자의 분자량을 조절하는 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 용매는 증류수인 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자의 분자량을 조절하는 방법. 　
4. 제1항에 있어서,
   상기 초음파의 인가 전압 세기 2 V~1.0 kV 인 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자의 분자량을 조절하는 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 초음파의 인가 시간은 1초~24시간 인 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자의 분자량을 조절하는 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 생분해성 고분자는 다공성 지지체, 필름, 디스크 또는 비드 형태인 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자의 분자량을 조절하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의해 분자량이 조절된 생분해성 고분자.
8. 제7항에 있어서,
   상기 분자량이 조절된 생분해성 고분자는 평균분자량이 1,000 Da~15,000,000 Da인 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자.
9. 제7항에 있어서,
   상기 생분해성 고분자는 히알루론산, 키토산, 키틴, 알긴산, 헤파린, 전분, 잔탄, 플루란 및 폴리 아미노산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 천연 고분자인 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 생분해성 고분자를 조직재생용 지지체, 약물전단용 고분자, 하이드로겔, 드레싱용 고분자 및 화장품용 고분자로 이루어진 군 중에서 선택되는 소재로 사용하는 방법.

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