CN103623462A - 一种用于脊髓损伤修复的透明质酸定向通道复合支架材料 - Google Patents
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Abstract
一种用于脊髓损伤修复的透明质酸定向通道复合支架材料,由接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体和注入水凝胶抗体释放体内的包裹因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球组成,其中接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体的内部呈并行排列的纵向通道;包裹因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球呈圆球状,表面光滑;聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球包裹的因子是血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子。本发明的支架材料可通过改善神经再生微环境促进脊髓损伤修复。
Description
技术领域
本发明涉及一种透明质酸定向通道复合支架材料,更详细地涉及一种用于脊髓损伤修复的透明质酸定向通道复合支架材料。
本发明还涉及上述透明质酸定向通道复合支架材料的制备方法。
本发明还涉及上述透明质酸定向通道复合支架材料的应用。
背景技术
脊髓损伤主要由外伤引起,多发于青壮年。损伤造成脊髓局部神经元死亡,上、下行纤维束断裂,损伤平面以下感觉、运动及内脏功能障碍,导致不同程度地偏瘫或截瘫,很多患者终生残疾。目前,临床治疗主要是防止二次损伤、减轻炎症、康复锻炼等姑息疗法,尚不能从根本上解决神经再生及功能恢复的问题。
组织工程技术在修复脊髓损伤方面具有明显优势。通过在体外构建生物支架材料并植入脊髓损伤区,不仅可以有效地填补、桥接缺损,还能支持细胞长期存活,持续发挥作用,同时还可以通过支架材料携带有益的神经营养因子、细胞因子等,对脊髓损伤进行多靶点治疗,从而大大地提高修复效果。
透明质酸(hyaluronic acid,HA)因其属于细胞外基质的主要成分,具有高粘弹性,良好的生物相容性、生物可降解性,无毒、无免疫原性等优势而应用广泛。
脊髓难以修复的重要原因是局部恶劣的微环境,因此,通过植入组织工程支架填补桥接缺损,拮抗轴突再生抑制因子,补充神经营养因子,促进血管再生等措施改善微环境即可有效改善预后。我们制备了具有纵向通道的透明质酸水凝胶支架,在其中添加PLL以促进细胞粘附性,在支架上接枝NgR抗体(NgR-Ab)以封闭NgR从而阻断髓鞘崩解产生的抑制因子作用,通过聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)包裹脑源性神经营养因子(BDNF)和血管内皮生长因子(VEGF),并添加到支架材料中进行移植,即可使其在体内缓释,长期发挥作用,有效地促进血管再生,改善微循环,促进神经再生。
体外实验发现,构建的支架材料具有纵向通道结构,PLGA微球持续释放BDNF和VEGF并促进神经元和血管内皮细胞在HA材料上粘附、生长。将上述具有纵向通道的复合支架植入大鼠脊髓胸9-10段(T9-10)背侧半切损伤模型,观察发现此复合支架材料和组织整合良好,细胞迁移进入材料内部,移植组损伤面积减小,胶质瘢痕减轻,可见血管再生,神经纤维长入材料内部,动物后肢运动功能明显改善。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于脊髓损伤修复的透明质酸定向通道复合支架材料。
本发明的又一目的在于提供一种制备上述透明质酸定向通道复合支架材料的方法。
为实现上述目的,本发明提供的用于脊髓损伤修复的透明质酸定向通道复合支架材料,由接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体和注入水凝胶抗体释放体内的包裹因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球组成,其中:
接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体的内部呈并行排列的纵向通道;
包裹因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球呈圆球状,表面光滑;
聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球包裹的因子是血管内皮生长因子(PLGA-VEGF)和脑源性神经营养因子(PLGA-BDNF);
通过下述方法得到:
1)接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体:
(1)制备具有定向通道的透明质酸水凝胶:
透明质酸的水溶液与多聚赖氨酸混匀后加入己二酸二酰肼搅拌,加酸调pH值为4-5,再加入碳二亚胺酸盐搅拌,加碱调pH值为中性后将流体注入模具,浸入液氮中冷冻,冷冻干燥成型得到具有定向通道的透明质酸水凝胶;其中透明质酸:多聚赖氨酸的质量比为4-6:1,己二酸二酰肼:透明质酸的质量比为6-8:1;
(2)将高碘酸钠加入NogoR抗体磷酸盐溶液中搅拌,生理盐水中透析除去未反应的高碘酸钠及其反应残留物,过滤,得到无菌抗体溶液;将步骤1制备的具有定向通道的透明质酸水凝胶与抗体溶液混合,得到接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体;
2)制备包裹因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球:
聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶解于二氯甲烷中;取同质量的血管内皮生长因子(VEGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)分别溶于牛血清白蛋白(BSA)溶液中,制成血管内皮生长因子(VEGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)两种BSA溶液,各加入聚乳酸聚乙醇酸共聚物溶液中混匀,再加入聚乙烯醇水溶液用超声波混匀得到聚乳酸聚乙醇酸共聚物乳液;加入聚乙烯醇水溶液搅拌使二氯甲烷挥发,经离心重悬浮,将重悬的溶液预冻后于冷冻真空干燥仪中干燥,得到的粉末颗粒分别是包裹血管内皮生长因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球(表达为PLGA-VEGF)和包裹脑源性神经营养因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球(表达为PLGA-BDNF)。
所述的透明质酸定向通道复合支架材料中,接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体可切割成不同形状,内部通道的孔径为50μm,包裹因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球直径为200~500nm。
本发明提供有制备上述透明质酸定向通道复合支架材料的方法,步骤为:
1)接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体:
(1)制备具有定向通道的透明质酸水凝胶:
透明质酸的水溶液与多聚赖氨酸混匀后加入己二酸二酰肼搅拌,加酸调pH值为4-5,再加入碳二亚胺酸盐搅拌,加碱调pH值为中性后将流体注入模具,浸入液氮中冷冻,冷冻干燥成型得到具有定向通道的透明质酸水凝胶;其中透明质酸:多聚赖氨酸的质量比为4-6:1,己二酸二酰肼:透明质酸的质量比为6-8:1;
(2)将高碘酸钠加入NogoR抗体磷酸盐溶液中搅拌,生理盐水中透析除去未反应的高碘酸钠及其反应残留物,过滤,得到无菌抗体溶液;将步骤1制备的具有定向通道的透明质酸水凝胶与抗体溶液混合,得到接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体;
2)制备包裹因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球:
聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶解于二氯甲烷中;取同质量的血管内皮生长因子(VEGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)分别溶于BSA溶液中,制成血管内皮生长因子(VEGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)两种BSA溶液,各加入聚乳酸聚乙醇酸共聚物溶液中混匀,再加入聚乙烯醇水溶液用超声波混匀得到聚乳酸聚乙醇酸共聚物乳液;加入聚乙烯醇水溶液搅拌使二氯甲烷挥发,经离心重悬浮,将重悬的溶液预冻后于冷冻真空干燥仪中干燥,得到的粉末颗粒分别是包裹血管内皮生长因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球(PLGA-VEGF)和包裹脑源性神经营养因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球(PLGA-BDNF)。
其中,加酸调pH值是用1mol/L的HCl,加碱调pH值是用1mol/L的NaOH溶液。
其中,流体注入模具浸入液氮中冷冻后,入-80℃冰箱预冻后于冷冻真空干燥仪中干燥成型。
本发明的透明质酸定向通道复合支架材料可以用于脊髓损伤修复,将接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体植入脊髓损伤区后,分别将包裹血管内皮生长因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球和包裹脑源性神经营养因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球注入接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体内。
本发明以透明质酸(HA)为基质材料,添加左旋多聚赖氨酸(PLL)并将其塑形为纵向通道结构,接枝Nogo受体抗体(NogoR-Ab),添加可缓释脑源性神经营养因子(BDNF)和血管内皮生长因子(VEGF)的聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)微球,此复合支架材料可通过改善神经再生微环境促进脊髓损伤修复。从实验证明了此复合支架材料在体外、体内均具有纵向通道结构并有效释放BDNF和VEGF,在体外可促进神经元和血管内皮细胞粘附、生长,移植后可有效改善脊髓损伤大鼠的运动功能,减小损伤面积,减轻胶质瘢痕,促进血管再生,促进神经纤维再生并进入材料内部。本发明的透明质酸定向通道复合支架材料可以作为一种改善损伤微环境并进而促进脊髓损伤修复的组织工程材料。
附图说明
图1是本发明中构建的具有纵向通道的HA-PLL水凝胶支架材料大体形态(A)和扫描电镜图像的纵切面(B),以及扫描电镜图像的横切面(C)。
图2是本发明中构建的具有纵向通道的HA-PLL水凝胶支架材料接枝NogoR抗体的体外免疫荧光染色(A)和体内移植4周后的释放情况(B)。
图3是本发明中制备的PLGA微球大体形态(A)和PLGA-BDNF扫描电镜图像(B),以及PLGA-VEGF扫描电镜图像(C)。
图4是本发明制备的PLGA-BDNF微球体外释放曲线(A)和PLGA-VEGF微球体外释放曲线(B)。
图5是本发明HA纵向通道材料复合PLGA微球植入脊髓损伤区1周后BDNF的释放量(A)和VEGF的释放量(B)。
图6是本发明中HA水凝胶中添加PLGA-BDNF可促进神经元粘附、生长的细胞培养免疫荧光图片和细胞计数结果;其中A是神经元接种于HA材料上;B是神经元接种于HA材料上并添加PLGA-BDNF;C是NF+细胞计数结果。
图7是本发明中HA水凝胶中添加PLGA-VEGF可促进血管内皮细胞粘附、生长、增殖的细胞培养免疫荧光图片和细胞计数结果,其中A是血管内皮细胞接种于HA材料上;B是血管内皮细胞接种于HA材料上并添加PLGA-VEGF;C是ki67+细胞计数结果。
图8是本发明中用于修复脊髓损伤的HA定向通道复合支架材料移植于大鼠脊髓胸段背侧半切模型的手术操作图片,其中A是大鼠脊髓T9-10;B是大鼠脊髓背侧半切模型;C是材料植入。
图9显示动物存活4周后大体标本及HE染色可见植入的材料与组织整合良好,大量细胞迁移进入材料内部,材料保持纵向通道结构,而对照组脊髓形成较大缺损区,其中A、A1是模型对照组;B、B1是复合材料植入组。
图10显示单纯HA定向通道支架及复合支架植入后脊髓损伤面积比较。
图11是模型组,显示单纯HA支架和复合支架植入后4周GFAP表达情况,其中A是模型组;B是单纯HA支架植入组;C是复合支架植入组。
图12是模型组,显示单纯HA支架和复合支架植入后4周vWF表达情况,其中A是模型组;B是单纯HA支架植入组;C是复合支架植入组。
图13是模型组,显示单纯HA支架和复合支架植入后8周NF阳性纤维生长情况,其中A是模型组;B是单纯HA支架植入组;C是复合支架植入组。
图14是模型组,显示单纯HA支架和复合支架植入后动物运动功能恢复BBB评分。
具体实施方式
本发明的用于脊髓损伤修复的透明质酸定向通道复合支架材料可以通过下述方法得到:
1)制备水凝胶支架接枝NogoR抗体
(1)配1%的透明质酸(HA)水溶液,加入多聚赖氨酸(PLL)(HA:PLL=5:1),混匀后加入己二酸二酰肼(ADH)(ADH:HA=6:1),充分搅拌均匀后逐滴加入1mol/L HCl至pH值达到4~5,再加入碳二亚胺酸盐(EDC)充分搅拌,用1mol/L NaOH调pH值为7后将流体注入公知的模具中,浸入液氮中冷冻30min,入-80℃冰箱预冻后于冷冻真空干燥仪中干燥成型,得到具有定向通道的透明质酸水凝胶(HA定向通道支架)。
(2)将高碘酸钠加入NogoR抗体PBS溶液中,浓度为10mg/ml,搅拌30分钟后在生理盐水中透析3小时除去未反应的高碘酸钠及其反应残留物,用滤器过滤,得到无菌抗体溶液;将HA定向通道支架与无菌的抗体溶液混合,在超净台中反应24小时,得到水凝胶支架接枝NogoR抗体。
3)制备包裹因子的PLGA微球:取聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)0.2g溶解于2ml二氯甲烷中得到10%的PLGA溶液;分别取10μgVEGF和BDNF溶解于50mg/ml的BSA溶液2ml中,然后将其加入PLGA溶液中振荡混匀;加入1%聚乙烯醇(PVA)水溶液10ml,用超声波细胞粉碎机混匀得到PLGA乳液;加入0.3%PVA水溶液80ml,搅拌24小时使二氯甲烷完全挥发;经过离心重悬浮3次,最后将重悬的溶液预冻后于冷冻真空干燥仪中干燥得到粉末颗粒。
其中HA定向通道支架大体直径3mm,硬度适中,可自由切割成不同形状,内部呈并行排列的纵向通道,孔径约50μm;在体内可持续释放NogoR抗体至少4周;包裹因子的PLGA微球大体呈粉末状,扫描电镜下呈圆球状,表面光滑,直径约200~500nm。
本发明提供的制备用于脊髓损伤修复的透明质酸定向通道复合支架材料的方法,先将HA和PLL制备成具有纵向通道的水凝胶,运用氧化接枝法连接NogoR抗体,制备包裹BDNF和VEGF的PLGA微球,移植前将其注入HA材料中,获得用于脊髓损伤修复的透明质酸定向通道复合支架材料。
具体地,其主要步骤为:
1)取透明质酸纳0.20g,加去离子水20ml,配成1%的透明质酸溶液,充分搅拌均匀;加入多聚赖氨酸(PLL)0.04g,混匀后加入己二酸二酰肼(ADH)1.5g,充分搅拌;逐滴加入1mol/L HCl(约3ml)直至pH值达到4~5;再加入碳二亚胺酸盐(EDC)0.4g,充分搅拌10min~20min,溶液渐变为凝胶;用1mol/L NaOH调pH值为7后将流体注入公知的模具,上下端开放,周围以泡沫塑料包封,浸入液氮中冷冻30min;入-80℃冰箱预冻2小时后于冷冻真空干燥仪中干燥48小时成型。
2)将高碘酸钠加入NogoR抗体PBS溶液中,浓度为10mg/ml,搅拌30分钟后在生理盐水中透析3小时除去未反应的高碘酸钠及其反应残留物,用滤器过滤,得到无菌抗体溶液;将制备的HA定向通道水凝胶支架与无菌的抗体溶液混合,在超净台中反应24小时,得到接枝抗体的水凝胶抗体释放体。
3)取聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)0.2g溶解于2ml二氯甲烷中,得到10%的PLGA溶液;分别取10μg VEGF和BDNF,溶解于50mg/ml BSA溶液2ml中;然后将其加入PLGA溶液中振荡混匀;加入1%聚乙烯醇(PVA)水溶液10ml,用超声波细胞粉碎机混匀得到PLGA乳液;加入0.3%PVA水溶液80ml,搅拌24小时使二氯甲烷完全挥发;经过离心重悬浮3次,最后将重悬的溶液于-80℃冰箱预冻2小时后于冷冻真空干燥仪中干燥48小时得到粉末颗粒。
本发明的透明质酸(HA)定向通道复合支架材料,从实验证明了HA支架具有定向通道结构,能够持续释放NogoR抗体及BDNF和VEGF,植入脊髓损伤区后,材料与组织整合良好,可减小损伤面积和胶质瘢痕,促进血管和神经纤维再生,有效改善动物的运动功能。本发明推荐透明质酸定向通道复合材料可以作为一种改善损伤微环境并进而促进脊髓损伤修复的组织工程材料。
本发明首先采用HA和PLL在EDC介导下用ADH进行交联的方法制备HA水凝胶,运用液氮梯度冷冻法将水凝胶塑造成具有纵向通道结构,运用氧化接枝法将NogoR抗体接枝于支架材料上,制备包裹BDNF和VEGF的PLGA微球并在支架材料植入前注入其中,最终获得用于脊髓损伤修复的具有定向通道结构的复合支架材料。
以下结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。
实施例1
1)透明质酸水凝胶定向通道支架制备
根据相关文献,取透明质酸纳0.20g,加去离子水20ml,配成1%的透明质酸溶液,充分搅拌均匀;加入多聚赖氨酸(PLL)0.04g,混匀后加入己二酸二酰肼(ADH)1.5g,充分搅拌;逐滴加入1mol/L HCl(约3ml)直至pH值达到4~5;再加入碳二亚胺酸盐(EDC)0.4g,充分搅拌10min~20min,溶液渐变为凝胶;用1mol/L NaOH调pH值为7后将流体注入公知的模具,上下端开放,周围以泡沫塑料包封,浸入液氮中冷冻30min;入-80℃冰箱预冻2小时后于冷冻真空干燥仪中干燥48小时成型。
2)透明质酸水凝胶定向通道支架接枝NogoR抗体
将高碘酸钠加入NogoR抗体PBS溶液中,浓度为10mg/ml,搅拌30分钟后在生理盐水中透析3小时除去未反应的高碘酸钠及其反应残留物,用滤器过滤,得到无菌抗体溶液;将制备的HA定向通道水凝胶支架与无菌的抗体溶液混合,在超净台中反应24小时,得到接枝抗体的水凝胶抗体释放体。
3)制备包裹BDNF和VEGF的PLGA微球
取聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)0.2g溶解于2ml二氯甲烷中,得到10%的PLGA溶液;分别取10μg VEGF和BDNF,溶解于50mg/ml BSA溶液2ml中;然后将其加入PLGA溶液中振荡混匀;加入1%聚乙烯醇(PVA)水溶液10ml,用超声波细胞粉碎机混匀得到PLGA乳液;加入0.3%PVA水溶液80ml,搅拌24小时使二氯甲烷完全挥发;经过离心重悬浮3次,最后将重悬的溶液于-80℃冰箱预冻2小时后于冷冻真空干燥仪中干燥48小时得到粉末颗粒。
4)透明质酸水凝胶定向通道复合支架制备
将HA定向通道支架植入脊髓损伤区后,用微量注射器分别将PLGA-BDNF和PLGA-VEGF(100μg/ml)10μl注入凝胶材料中即形成透明质酸水凝胶定向通道复合支架。
本发明制备的用于脊髓损伤修复的透明质酸定向通道复合支架材料的大体形态,扫描电镜,体外和体内释放,荧光显微镜图像表征见图1、2、3、4、5。
从图1中可见,HA定向通道材料大体呈圆柱状,直径3mm(等同与大鼠脊髓直径),可任意切割。扫描电镜观察到材料内部呈平行的纵向通道结构,孔径约50μm,通道之间相互交通;横切面可见纵向通道相互排列紧密,类似蜂窝煤状结构。
从图2中可见,NogoR抗体成功接枝于HA支架上并在体内可持续释放至少4周。
从图3中可见,PLGA微球大体呈粉末状,扫描电镜可见微球呈圆球形,表明光滑,直径200~500nm。
从图4中可见,PLGA微球在体外可持续释放BDNF和VEGF。
从图5中可见,PLGA微球在体内可释放BDNF和VEGF。
实施例2
透明质酸复合支架材料对神经元的体外作用
在实施例1中制备所得的透明质酸复合支架材料上接种大鼠皮层神经元,同时神经元也接种在普通透明质酸水凝胶上,培养1周后NF免疫荧光染色并计数随机10个视野的NF阳性细胞数,统计发现接种在透明质酸复合支架材料上的NF阳性细胞数明显多于接种在普通透明质酸水凝胶上的细胞数目,说明透明质酸复合支架材料可以促进神经元粘附、生长(请参阅图6)。
实施例3
透明质酸复合支架材料对血管内皮细胞的体外作用
在实施例1中制备所得的透明质酸复合支架材料上接种人脐动脉内皮细胞,同时也接种在普通透明质酸水凝胶上,培养1周后ki67免疫荧光染色并计数随机10个视野的ki67阳性细胞数,统计发现接种在透明质酸复合支架材料上的ki67阳性细胞数明显多于接种在普通透明质酸水凝胶上的细胞数目,说明透明质酸复合支架材料可以促进血管内皮细胞粘附、生长和增殖(请参阅图7)。
实施例4
复合材料与脊髓组织相容性
将实施例1中制备所得复合支架材料植入大鼠T9-10脊髓背侧半切模型,单纯模型和单纯HA材料植入作为对照,动物存活4周后大体观察发现材料与组织整合良好,HE染色可见大量细胞迁移进入材料内部,材料在体内仍保持纵向通道结构,而模型组脊髓组织呈现较大缺损区(请参阅图8、图9)。
实施例5
材料植入减小损伤面积,减轻胶质瘢痕
取实施例4中动物脊髓组织做冰冻切片并进行GFAP免疫荧光染色,可见材料植入组GFAP荧光强度较模型组显著降低,表明材料植入可有效减轻胶质瘢痕。以GFAP阳性边界统计损伤面积(每组5张切片,n=6),可见材料植入组损伤面积明显减小(请参阅图10、图11)。
实施例6
复合材料促进血管再生
取实施例4中动物脊髓组织做冰冻切片并进行vWF免疫荧光染色,可见复合材料植入组vWF阳性血管数明显多于模型组和普通材料植入组,表明复合材料植入可促进脊髓损伤周边血管再生(请参阅图12)
实施例7
复合材料促进神经纤维再生
将实施例1中制备所得复合支架材料植入大鼠T9-10脊髓背侧半切模型,单纯模型和单纯HA材料植入作为对照,动物存活8周后取脊髓组织做冰冻切片并进行NF免疫荧光染色,可见复合材料植入组NF阳性神经纤维明显多于普通材料植入组,而模型组缺损区内则无NF阳性纤维,表明复合材料植入可促进神经纤维再生进入材料内部(请参阅图13)。
实施例8
支架材料促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复
将实施例1中制备所得复合支架材料植入大鼠T9-10脊髓背侧半切模型,单纯模型和单纯HA材料植入作为对照,术后观察大鼠运动功能恢复情况并进行BBB评分,结果发现脊髓损伤大鼠术后双后肢运动功能完全丧失,2周后各组动物均有不同程度恢复,材料植入组运动功能恢复明显优于模型组,而复合材料移植组则优于普通材料组。表明透明质酸支架材料特别是复合支架材料植入大鼠脊髓损伤区后可明显改善动物运动功能(请参阅图14)。
Claims (9)
1.一种用于脊髓损伤修复的透明质酸定向通道复合支架材料,由接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体和注入水凝胶抗体释放体内的包裹因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球组成,其中:
接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体的内部呈并行排列的纵向通道;
包裹因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球呈圆球状,表面光滑;
聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球包裹的因子是血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子;
通过下述方法得到:
1)接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体:
(1)制备具有定向通道的透明质酸水凝胶:
透明质酸的水溶液与多聚赖氨酸混匀后加入己二酸二酰肼搅拌,加酸调pH值为4-5,再加入碳二亚胺酸盐搅拌,加碱调pH值为中性后将流体注入模具,浸入液氮中冷冻,冷冻干燥成型得到具有定向通道的透明质酸水凝胶;
其中,透明质酸:多聚赖氨酸的质量比为4-6:1;
己二酸二酰肼:透明质酸的质量比为6-8:1;
(2)将高碘酸钠加入NogoR抗体磷酸盐溶液中搅拌,生理盐水中透析除去未反应的高碘酸钠及其反应残留物,过滤,得到无菌抗体溶液;将步骤1制备的具有定向通道的透明质酸水凝胶与抗体溶液混合,得到接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体;
2)制备包裹因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球:
聚乳酸聚乙醇酸共聚物溶解于二氯甲烷中;
取同质量的血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子分别溶于牛血清白蛋白溶液中,制成血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子两种牛血清白蛋白溶液,各加入聚乳酸聚乙醇酸共聚物溶液中混匀,再加入聚乙烯醇水溶液用超声波混匀得到聚乳酸聚乙醇酸共聚物乳液;
加入聚乙烯醇水溶液搅拌使二氯甲烷挥发,经离心重悬浮,将重悬的溶液预冻后于冷冻真空干燥仪中干燥,得到的粉末颗粒分别是包裹血管内皮生长因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球和包裹脑源性神经营养因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球。
2.根据权利要求1所述的透明质酸定向通道复合支架材料,其中,接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体可切割成不同形状,内部通道的孔径为50μm,包裹因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球直径为200~500nm。
3.根据权利要求1所述的透明质酸定向通道复合支架材料,其中,加酸调pH值是用1mol/L的HCl,加碱调pH值是用1mol/L的NaOH溶液。
4.根据权利要求1所述的透明质酸定向通道复合支架材料,其中,流体注入模具浸入液氮中冷冻后,入-80℃冰箱预冻后于冷冻真空干燥仪中干燥成型。
5.一种制备权利要求1所述透明质酸定向通道复合支架材料的方法,步骤为:
1)接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体:
(1)制备具有定向通道的透明质酸水凝胶:
透明质酸的水溶液与多聚赖氨酸混匀后加入己二酸二酰肼搅拌,加酸调pH值为4-5,再加入碳二亚胺酸盐搅拌,加碱调pH值为中性后将流体注入模具,浸入液氮中冷冻,冷冻干燥成型得到具有定向通道的透明质酸水凝胶;
其中,透明质酸:多聚赖氨酸的质量比为4-6:1;
己二酸二酰肼:透明质酸的质量比为6-8:1
(2)将高碘酸钠加入NogoR抗体磷酸盐溶液中搅拌,生理盐水中透析除去未反应的高碘酸钠及其反应残留物,过滤,得到无菌抗体溶液;将步骤1制备的具有定向通道的透明质酸水凝胶与抗体溶液混合,得到接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体;
2)制备包裹因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球:
聚乳酸聚乙醇酸共聚物溶解于二氯甲烷中;
取同质量的血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子分别溶于牛血清白蛋白溶液中,制成血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子两种牛血清白蛋白溶液,各加入聚乳酸聚乙醇酸共聚物溶液中混匀,再加入聚乙烯醇水溶液用超声波混匀得到聚乳酸聚乙醇酸共聚物乳液;
加入聚乙烯醇水溶液搅拌使二氯甲烷挥发,经离心重悬浮,将重悬的溶液预冻后于冷冻真空干燥仪中干燥,得到的粉末颗粒分别是包裹血管内皮生长因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球和包裹脑源性神经营养因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,加酸调pH值是用1mol/L的HCl,加碱调pH值是用1mol/L的NaOH溶液。
7.根据权利要求5所述的方法,其中,流体注入模具浸入液氮中冷冻后,入-80℃冰箱预冻后于冷冻真空干燥仪中干燥成型。
8.权利要求1所述透明质酸定向通道复合支架材料在脊髓损伤修复方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,将接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体植入脊髓损伤区后,分别将包裹血管内皮生长因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球和包裹脑源性神经营养因子的聚乳酸聚乙醇酸共聚物微球注入接枝NogoR抗体的水凝胶抗体释放体内。
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