CN114292743A - 一种电场辅助下的打印装置、水凝胶微球的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种电场辅助下的打印装置，包括电压电源、气泵、注射泵、收集装置，电源电压提供可调节的电场，气泵连接注射泵提供可调节的压力，收集装置用于收集微球。本发明采用基于电场力和气压力的挤出打印方法制备多孔甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)微球，可通过改变电压、气压和喷嘴尺寸，方便地调节水凝胶微球的直径。压电辅助式挤出打印用于生产分散，形状、尺寸和沉积位置可控的低浓度GelMA微球，方法既简单又经济；微球的圆度和尺寸均匀性均高于传统制造方法制备的微球。此外，GelMA是一种可生物降解的材料，避免了在体内长期存在可能产生的副作用和二次手术，载间充质干细胞(MSCs)的GelMA微球可治疗神经损伤、骨缺损及软骨缺损等。
Description
技术领域
本发明涉及一种电场辅助下的打印装置、水凝胶微球的制备方法及应用。
背景技术
目前最常用的细胞培养方式是传统的二维(2D)贴壁培养，该方法虽然简单、成本低，但细胞在形态、结构和功能方面都与其在体内自然生长的状态相去甚远。2D培养的细胞贴附于培养器皿壁上，且一经贴壁就迅速铺展，并很快进入对数生长期，一般数天后就铺满培养器皿表面。2D培养在硬基质上进行，且不能模拟体内三维立体的自然微环境，包括细胞外基质(ECM)和邻近细胞，从而影响细胞的基因表达、信号转导等，最终导致所培养的细胞逐渐丧失其在生物体内的生物学特性及功能[1-4]。故2D培养的细胞自我更新及多向分化能力与体内差异较大。同时，在临床应用上，2D培养也具有一定局限性。一方面2D培养的细胞需经消化步骤后再进行后续移植操作，对细胞有较大的损伤，无法为组织工程技术提供高质量的细胞，另一方面2D培养由于表面积体积比的限制[5]，难以大规模培养，无法为组织工程技术提供数百万的细胞量。综上，为了更好地模拟体内细胞生长的微环境和输送高质量的细胞，有必要找到更仿生的培养模式。
三维(3D)细胞培养是指将细胞与具有三维结构的支架材料共同培养,使细胞能够在三维立体空间生长、增殖和分化。3D培养提供了一个可复制的、可控的微环境，并真实模拟体内环境的关键特征，包括细胞-细胞和细胞-ECM相互作用。水凝胶微球作为支架，是细胞附着的基质，可作为控制药物释放的载体，也可与细胞形成3D组织结构重建体内受损组织以恢复其功能。3D培养在软基质上进行，更为仿生。细胞在支架上生长，具有较大的表面积体积比，能产生数以百万计的细胞，无需消化即可直接移植至受损区，在组织工程方面具有较大应用前景。目前，常用的微球打印方法有数字光投影技术(DLP)打印和微流控打印。虽然这两种打印方法的精度会提高，但因为需要特定的仪器，成本也较高。且DLP打印常用于快速构建复杂的大型结构，如骨、软骨、气管等，在制造小尺度结构方面的应用较少。微流控打印则存在水油相分离的问题[6]，且产量较低。因此，有必要研究一种新型的简便、经济、产量较高、直径可控、均匀的制造方法，构建一个3D微球培养模型，以便在组织工程中发挥重要作用。
发明内容
本发明为克服上述现有技术所述的至少一种不足。
本发明的首要目的是提供一种电场辅助下的打印装置，包括电压电源、气泵、注射泵、收集装置，所述气泵设于所述注射泵的上方，所述收集装置设于所述注射泵的下方。电源电压提供可调节的电场(电势差等于电场强度乘以距离)，气泵连接注射泵提供可调节的压力，收集装置用于收集微球。
进一步的，所述注射泵上设有正和负电极。
进一步的，所述注射泵上设有金属环电极，所述金属环电极数量至少为2，包括一个正电极，一个负电极。
本发明的另一目的是提供一种水凝胶微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1.生物墨水的制备；
S2.将生物墨水装入注射器；
S3.使用如权利要求1-3所述的压电辅助式挤出打印装置制备。
进一步的，步骤S1中，是在50mL 0.5％海藻酸钠水溶液中加入0.25g冻干甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)和0.025g苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)作为生物墨水。
进一步的，步骤S2中，是将2-3mL生物墨水缓慢地贴壁加入一个带有26-28G输液针的5ml注射器。
进一步的，步骤S2中，设置电压值为6-7kV，气泵压力为12-16kPa，可根据不同的电压值和气泵压力值调节微球直径。
进一步的，接收和存储微球的溶液为5％的氯化钙水溶液，接触海藻酸钠后形成海藻酸钙用于微球的快速固化，再利用405nm波长的紫外光或420-450nm波长的蓝光对微球进行不可逆性光固化(GelMA与LAP的交联)。
进一步的，步骤S3后，需在磷酸盐缓冲盐水中洗涤3次，在4％的柠檬酸钠溶液中浸泡30分钟用于去除海藻酸钙，从而形成表面多孔结构，然后将微球灭菌。细胞可以粘附在微球表面并进行增殖，经诱导后细胞能成神经、成脂、成骨、成软骨向分化。
本发明的又一目的是提供压电辅助式挤出打印装置制备的水凝胶微球在神经损伤、骨缺损、软骨缺损修复中的应用。
与背景技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用基于电场力和气压力的挤出打印方法制备多孔GelMA微球，可通过改变电压、气压和喷嘴尺寸，方便地调节微球的直径。压电辅助式挤出打印用于生产分散，形状、尺寸和沉积位置可控的低浓度GelMA微球，方法既简单又经济；微球的圆度和尺寸均匀性均高于传统挤出打印法制备的微球。此外，GelMA是一种可生物降解的材料，避免了长期存在体内可能产生的副作用和二次手术，载间充质干细胞(MSCs)的GelMA微球有力地促进了大鼠脊髓损伤治疗的发展。由于MSCs具有多向分化的潜能，这种修复方法也可应用于坐骨神经损伤、骨缺损、软骨缺损等其他损伤的修复。
附图说明
图1是基于压电辅助式挤出打印技术的水凝胶微球的制备流程。
图2为依照本发明实施例1中制备的GelMA水凝胶微球的直径分布分析。
图3为依照本发明实施例1中制备的GelMA水凝胶微球的电子显微镜照片。
图4为依照本发明实施例2中制备的大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)在GelMA水凝胶微球表面的细胞增殖情况
图5为依照本发明实施例2中制备的rBMSCs在GelMA水凝胶微球表面的干性维持情况。
图6为依照本发明实施例2中rBMSCs在GelMA水凝胶微球表面成神经分化情况。
图7为依照本发明实施例2中rBMSCs在GelMA水凝胶微球表面成脂肪分化情况。
图8为依照本发明实施例2中rBMSCs在GelMA水凝胶微球表面成骨分化情况。
图9为依照本发明实施例2中rBMSCs在GelMA水凝胶微球表面成软骨分化情况。
图10为依照本发明实施例3中对大鼠脊髓损伤动物模型中八周后脊髓的大体图。
图11为依照本发明实施例3中对大鼠脊髓损伤动物模型中八周后再生脊髓的β-tubulin免疫组织化学染色图。
图12为依照本发明实施例3中对大鼠脊髓损伤动物模型中八周后再生脊髓的β-tubulin阳性细胞统计图。
其中，1为气压泵提供的气压；2为生物墨水；3为带负电的上金属环；4为带正电的下金属环；5为微滴；6为接地的收集装置；7为紫外光。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施实例对本发明作进一步详细说明。附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；对于本领域技术人员来说，某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。
3D细胞培养系统包括各种搅拌或灌注生物反应器系统，利用合适的生物材料作为支架来模拟自然微环境，生成复杂的、功能性的三维结构。Van Wezel[7]于1967年首次开发了微载体(MCs)培养系统，将单层培养和悬浮培养结合在一起。MCs通常是指直径为90-350μm[8]的微球，密度略高于水，约为1.02-1.04g/cm3。MCs细胞培养在悬浮模式下进行，细胞在MCs表面附着并生长，且在微球上培养细胞可将载细胞的微球直径移植至受损区，无需消化后再移植，大大减少对细胞的损伤。此外，选择合适的生物材料制造MCs对其发挥作用具有重要意义。理想的微球材料应具有良好的生物相容性、可生物降解性、高孔隙率、和适当的机械强度。GelMA是天然聚合物的衍生物，通过在明胶中加入甲基丙烯酸酯基团而合成[9,10]。它具有良好的机械性能和生物相容性。且GelMA在光引发剂的帮助下可由紫外光或蓝光激发固化反应，形成适于细胞生长的三维结构。由于这些特性，GelMA在生物打印领域得到了越来越多的关注，并具有巨大的应用潜力。传统挤压打印和微流控打印是目前常用的打印方法。然而，传统挤压打印的微球尺寸和圆度可控性较低。而微流控打印的成本相对较高，并且存在水相与油相分离的问题[6]。因此,构建一种合适的微球制备方法十分重要。
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本发明采用一种新型的压电辅助挤出打印装置来制备多孔GelMA微球。相较于传统的2D培养系统，细胞在微球上的活力、增殖、干性以及细胞的多向分化能力，均有明显的提高。同时该3D培养方法可用于大鼠脊髓损伤动物模型的修复，表明其具有临床应用的潜力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
1.压电辅助挤出打印装置的搭建
压电辅助挤出打印装置由一个电压电源、一个气泵、一个固定有两个金属环(环绕)电极的注射泵和一个接地的收集装置组成。由电压功率产生的静电力和气泵产生的压力共同克服了表面张力和粘性力，使微滴从喷嘴中分离出来。上下金属环电极分别与负极和正极相连，以控制释放的微滴移动。此外，在接地金属板上放置烧杯作为液滴接收器。
2.GelMA微球的制备
利用压电辅助挤出打印装置制备凝胶微球。在50mL0.5％海藻酸钠水溶液中加入0.25g冻干GelMA和0.025g LAP作为生物墨水。随后，将2-3mL生物墨水缓慢地贴壁加入一个带有26-28G输液针的5ml注射器。同时设置电压值为6-7kV，气泵压力为12-16kPa。微球的合成是通过海藻酸钠与氯化钙接触后形成海藻酸钙使微球快速固化，再利用405nm波长的紫外光或420-450nm波长的蓝光对微球进行不可逆性光固化(GelMA与LAP的交联)。
实施例1：基于压电辅助挤压打印技术的水凝胶微球的制备
(1)压电辅助挤出打印装置的搭建
压电辅助挤出打印装置由一个电压电源、一个气泵、一个固定有两个金属环电极的注射泵和一个接地的收集装置组成。由电压功率产生的静电力和气泵产生的压力共同克服了表面张力和粘性力，使微滴从喷嘴中分离出来。上下金属环电极分别与负极和正极相连，以控制释放的微滴移动。此外，在接地金属板上放置烧杯作为液滴接收器。
(2)GelMA微球的制备
利用压电辅助挤出打印装置制备凝胶微球。在50mL0.5％海藻酸钠水溶液中加入0.25g冻干GelMA和0.025g LAP作为生物墨水。随后，将2mL生物墨水缓慢地贴壁加入一个带有27G输液针的5ml注射器。同时设置电压值为6.72kV，气泵压力为14.4kPa。微球的合成是通过海藻酸钠与氯化钙接触后形成海藻酸钙使微球快速固化，再利用405nm波长的紫外光对微球进行不可逆性光固化(GelMA与LAP的交联)。
(3)GelMA微球的预处理
选取上述GelMA水凝胶微球，使得微球在磷酸盐缓冲盐水中洗涤3次，在4％的柠檬酸钠中浸泡30分钟用于去除海藻酸钙形成表面多孔结构。然后，将微球灭菌，备用。
如图1所示，基于压电辅助挤出打印技术的水凝胶微球的制备流程。
如图2所示，所得GelMA水凝胶微球尺寸均匀，直径约在300μm左右。
如图3所示，SEM显示GelMA水凝胶微球表面存在大量的微孔，有利于细胞粘附。
实施例2：rBMSCs在GelMA水凝胶微球表面的细胞增殖、干性维持、成神经向分化、成脂向分化、成骨向分化和成软骨向分化的能力
3D培养系统是将rBMSCs接种在微球上，置于低粘附六孔板中培养，命名MC-rBMSCs组。2D培养体系是将rBMSCs单层培养于常规6孔板上，命名为平面Polystryrene(PS)-rBMSCs组。
采用活/死染色法检测rBMSCs的活力。培养1、3、5和7天后，用活/死染色试剂盒对细胞进行染色。
将rBMSCs在微球和平面上扩增14天后，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测OCT4基因的表达水平。
将rBMSCs在微球和平面上神经源性分化14天后，采用qRT-PCR检测NESTIN和βIII-TUBULIN基因的表达水平。
将rBMSCs在微球和平面上成脂分化16天后，采用qRT-PCR检测ADIPOQ、FABP和DLK基因的表达水平。
将rBMSCs在微球和平面上成骨分化12天后，采用qRT-PCR检测ALP和COL1基因的表达水平。
将rBMSCs在微球和平面上成软骨分化21天后，采用qRT-PCR检测SOX9和COMP基因的表达水平。
如图4所示，活/死染色结果显示rBMSCs在微球上培养1、3、5、7天后细胞密度逐渐增加。
如图5所示，qRT-PCR定量结果显示相较于平面，在微球上rBMSCs的干性维持能力更好。
如图6所示，qRT-PCR定量结果显示相较于平面，在微球上rBMSCs的成神经分化能力更好。
如图7所示，qRT-PCR定量结果显示相较于平面，在微球上rBMSCs的成脂分化能力更好。
如图8所示，qRT-PCR定量结果显示相较于平面，在微球上rBMSCs的成骨分化能力更好。
如图9所示，qRT-PCR定量结果显示相较于平面，在微球上rBMSCs的成软骨分化能力更好。
实施例3：基于压电辅助挤出打印技术的水凝胶微球在大鼠脊髓损伤动物模型中的应用
选用雌性，200-300g的大鼠，并随机分为两组:rBMSCs组和MC-rBMSCs组。经腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠。剃掉大鼠胸段背侧的毛并用2％碘伏消毒。在该区域作一长度约2cm的纵向切口，沿脊柱分离筋膜和肌层，暴露第9胸椎段(T9)至T11椎段。在T10处行椎板切除术，并取出椎板，暴露脊髓。完整切除脊髓0.5cm，按组别加入20微升浓度为600000cells/ml的rBMSCs悬液或浓度为16000微球/ml的MC-rBMSCs悬液。然后，分层缝合软组织和皮肤。待麻醉完全恢复后，对大鼠进行检查，确认其后肢是否瘫痪。如果大鼠能在麻醉恢复后立即使用后肢，则被排除。连续7天腹腔注射100单位/kg青霉素G，以预防感染。将大鼠置于单独笼中，每12小时人工排尿一次。术后监测8周。
如图10所示，术后8周大鼠脊髓的大体图，可见脊髓有一定的狭窄，术区已有组织修复。
如图11所示，术后8周大鼠脊髓的免疫组织化学图，可见相较于rBMSCs组，MC-rBMSCs组中的再生脊髓组织中有大量的β-tubulin阳性细胞。
如图12所示，对术后8周大鼠脊髓的免疫组织化学图中β-tubulin阳性细胞的定量分析，可见相较于rBMSCs组，MC-rBMSCs组中的β-tubulin阳性细胞较多。
Claims (10)
1.一种电场辅助下的打印装置，其特征在于，包括电压电源、气泵、注射泵、收集装置，电源电压提供可调节的电场，气泵连接注射泵提供可调节的压力，收集装置用于收集微球。
2.根据权利要求1所述的一种电场辅助下的打印装置，其特征在于，所述注射泵上设有正和负电极。
3.根据权利要求1所述的一种电场辅助下的打印装置，其特征在于，所述注射泵上设有金属环电极，所述金属环电极数量至少为2，包括一个正电极，一个负电极。
4.一种水凝胶微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1.生物墨水的制备；
S2.将生物墨水装入注射器；
S3.使用如权利要求1-3所述的压电辅助式挤出打印装置制备。
5.根据权利要求4所述的一种水凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤S1中，是在50mL0.5％海藻酸钠水溶液中加入0.25g冻干甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)和0.025g苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)作为生物墨水。
6.根据权利要求4所述的一种水凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤S2中，是将2-3mL真空抽滤后的生物墨水缓慢、贴壁地加入一个带有26-28G喷头的5ml注射器。
7.根据权利要求4所述的一种水凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤S2中，设置电压值为6-7kV，气泵压力为12-16kPa，可生产的微球直径范围为100-500μm。
8.根据权利要求4所述的一种水凝胶微球的制备方法，其特征在于，接收和存储微球的溶液为5％的氯化钙水溶液，接触海藻酸钠后形成海藻酸钙用于微球的快速固化，再利用405nm波长的紫外光或420-450nm波长的蓝光对微球进行不可逆性光固化。
9.根据权利要求4所述的一种水凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤S3后，需在磷酸盐缓冲盐水中洗涤3次，在4％的柠檬酸钠溶液中浸泡30分钟用于去除海藻酸钙，并形成多孔结构，然后将微球灭菌后备用。
10.压电辅助式挤出打印的水凝胶微球在脊髓损伤修复的应用。
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