CN111139213B

CN111139213B - 多层次结构支架及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111139213B
Application number: CN202010011513.8A
Authority: CN
Inventors: 姚睿; 冯璐
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2020-01-06
Filing date: 2020-01-06
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2040-01-06
Also published as: WO2021139124A1; US20230048690A1; CN111139213A

Abstract

本发明涉及一种多层次结构支架及其制备方法与应用。本发明多层次结构支架具有从厘米到微米尺度的结构，用于细胞三维培养、体外大规模扩增、体外类组织构建、组织工程与再生医学、病理模型研究、新药研发和药物毒理学研究等领域。所述多层次结构支架具有宏观结构可定制、层级结构可调控、孔径大小可调节、孔隙率和通透率高、细胞负载高、弹性模量高、机械性能好、细胞功能好以及细胞可无损收集的特点。

Description

多层次结构支架及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物组织工程技术领域，具体涉及一种多层次结构支架及其制备方法与应用。

背景技术

一般来说，成人细胞移植的单次剂量必须达到10⁸～10⁹个细胞才能实现有效的功能。同时，干细胞治疗产品必须要满足安全性、有效性和最小批次间差异，以确保稳定的治疗效果。因此，能够实现干细胞的扩增、分化和/或功能维护以及无害的收获并具有成本效益的策略亟待开发。

与平面培养相比，三维(3D)细胞培养可以通过重建细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用来减少体外培养与天然组织之间的差异，具有很大的优势。对于微米等级的培养系统，微载体已被用于间充质干细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞的大规模扩增平台。对于尺寸更大一些的扩增平台，由天然和/或合成生物材料组成的3D支架已被用于造血干细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞的扩增。在基质材料中，海藻酸盐和明胶由于具有良好的生物相容性、生物可降解性和交联条件温和的特点而被广泛使用。此外，藻酸盐的水化特性和明胶在细胞培养温度下实现可逆交联的特性，使得在生理条件下的细胞的无损收集成为可能。然而，大规模体外扩增系统的发展仍然存在挑战，即目前仍缺乏一个可以同时满足以下条件的扩增系统：1)大量细胞被吸收并均匀分布在整个培养系统；2)有充足的营养成分的运输，机械稳定性可支持长期培养；3)收获后的细胞/细胞集群保持其表型和功能。

发明内容

本发明实施例提供一种多层次结构支架，其具有较高的孔隙率和通透率，且细胞负载高，力学性能好，生物学性能好，能够用于三维(3D)细胞培养，且支架内细胞可无损回收。

一种多层次结构支架，包括支架本体，其中，

所述支架本体的内部具有平均孔径10～500μm的贯穿大孔；

所述支架本体的孔隙率为10％-95％；

所述支架本体的杨氏模量为0.1kPa-10MPa。

在本发明一些实施例中，所述支架本体的宏观结构为柱状、块状、片状、囊状、管状或任意形状组合。

在本发明一些实施例中，所述支架本体为圆柱体、正方体或棱柱体。

在本发明一些实施例中，所述支架本体的内部具有平均孔径100～200μm级别的贯穿大孔。

在本发明一些实施例中，所述支架本体的孔隙率为50％-90％。

在本发明一些实施例中，所述支架本体的孔隙率为例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。

在本发明一些实施例中，所述支架本体的杨氏模量为30-220kPa。

在本发明一些实施例中，所述支架本体的杨氏模量为0.1kPa、0.5kPa、1kPa、1.5kPa、2kPa、3kPa、4kPa、5kPa、6kPa、7kPa、8kPa、9kPa、10kPa、0.1MPa、0.5MPa、1MPa、1.5MPa、2MPa、3MPa、4MPa、5MPa、6MPa、7MPa、8MPa、9MPa或10MPa。

在本发明一些实施例中，所述支架本体还具有至少一个中空通道。进一步地，所述中空通道贯穿所述支架本体的顶部和底部。

在本发明一些实施例中，所述中空通道为两个、三个、四个或四个以上。

在本发明一些实施例中，所述中空通道的直径为0.5-5cm，例如2cm。

在本发明一些实施例中，所述支架本体的高度与直径(指外径)的比例为(0.1-10):(10-0.1)，例如1:1。

在本发明一些实施例中，所述支架本体的高度为4-10cm，例如6cm；和/或，所述支架本体的直径(指外径)为4-10cm，例如6cm。

在本发明一些实施例中，所述支架本体的孔隙率为75％-90％。

在本发明一些实施例中，所述支架本体具有上尺寸为1～50cm的三维结构。在一些具体实施例中，所述支架本体具有尺寸为1cm×1cm×0.5cm的三维结构。

在本发明一些实施例中，所述支架本体所述支架本体由50～800μm左右的材料微丝组成。

在本发明一些实施例中，所述支架本体具有间隔0.1～100mm的中空通道。

在本发明一些实施例中，所述多层次结构支架具有较好的弹性。

在本发明一些实施例中，所述多层次结构支架在压缩时表现出至少20％-70％或更高的压缩应变而不发生永久形变或机械破坏。

在本发明一些实施例中，所述支架本体由生物相容性材料制成。

在本发明一些实施例中，所述生物相容性材料选自天然材料和/或人工合成材料。

在本发明一些实施例中，所述天然材料选自藻酸盐、藻酸盐衍生物、明胶、明胶衍生物、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白、糖蛋白衍生材料、壳聚糖、壳聚糖衍生物、层连接蛋白、纤连接蛋白和纤维蛋白、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶中的至少一种，更优选海藻酸钠和/或明胶。

在本发明一些实施例中，所述人工合成材料选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚谷氨酸-聚乙二醇、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙醇酸、聚乙二醇-聚二氧六环酮、聚乙二醇、聚四氟乙烯、聚氧化乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮、以及以上材料的衍生物和聚合物中的至少一种，更优选聚乙醇酸或聚乳酸。

在本发明一些实施例中，制备所述支架本体所用的交联剂选自以下的一种或多种：二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物，优选为氯化钙。

在本发明一些实施例中，所述支架本体由聚乙醇酸和纤维蛋白制成，所用的交联剂为凝血酶。

本发明多层次结构支架结构可控，具有从厘米到微米尺度的可控的多层次结构，宏观结构可定制且微观孔隙可调节。

本发明所制得的多层次结构支架更适合于培养干细胞，例如肝脏干细胞(LifeTechnologies)、胚胎干细胞(ATCC)等。

本发明还提供上述多层次结构支架的制备方法，包括以下步骤：

1)将生物相容性材料与相应的交联剂制成前体溶液；

2)以所述前体溶液为材料制备成三维结构体；

3)冷冻所述三维结构体；

4)干燥冷冻后的所述三维结构体，从而得到多层次结构支架。

研究发现，将所述前体溶液制备成三维结构体，并进一步冷冻和干燥后，不仅可以形成宏观空隙，而且还能够形成具有多层次的结构支架。

根据本发明所述多层次结构支架的制备方法，所述生物相容性材料与上文含义相同，选自天然材料和/或人工合成材料，主要是一些具有生物兼容性的水凝胶材料。

在本发明一些具体实施方式中，所述生物相容性材料的质量百分比浓度为0.1％～80％，优选为1％～25％。

根据本发明多层次结构支架的制备方法，所述交联剂选自包含以下的一种或多种物质：以氯化钙为代表的二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物。在本发明一些具体实施方式中，所述交联剂为氯化钙。

在本发明一些具体实施方式中，所用交联溶液的质量百分比浓度为0.1mM～10M，优选1mM～100mM。

在本发明一些具体实施方式中，所述生物相容性材料与交联剂溶液按1000:1-1:1000的体积比混合，优选10:1～1:10。

在本发明一些具体实施方式中，是将所述生物相容性材料制成溶液(其溶剂优选为氯化钠溶液)，然后与交联剂溶液制成前体溶液。

在本发明一些具体实施方式中，所述生物相容性材料为海藻酸盐和明胶，所述交联液为氯化钙。

海藻酸盐和明胶均为天然生物材料，细胞相容性好。海藻酸盐可与钙离子混合后可以迅速实现预交联，并可以在生理条件下被降解；明胶具有温敏特性，可通过调节温度实现可逆交联。以含有由海藻酸盐、明胶和氯化钙制成的前体溶液，制备多层次结构支架。

在本发明一些具体实施方式中，是将浓度为1％～25％的聚乙醇酸溶液(其溶剂优选为0.1％～10％氯化钠溶液)、浓度为1％～25％的纤维蛋白原溶液(其溶剂优选为0.1％～10％氯化钠溶液)和浓度为1～2000mM的凝血酶溶液均匀混合制成前体溶液，制备多层次结构支架，其具有细胞相容性好、孔隙率较大适合细胞种植和生长、孔隙尺寸合适细胞生长、力学性能与天然组织相似、可无损收集细胞等优点。

在本发明一些具体实施方式中，所述前体溶液中聚乙醇酸的浓度为0.1-21％，纤维蛋白的浓度为0.1-21％，凝血酶的浓度为0.1-1000mM。

根据本发明多层次结构支架的制备方法，可采用如下方法将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维结构体：铸模法(或工艺)、消失模法(或工艺)、生物3D打印法(或工艺)、喷墨打印法(或工艺)、熔融沉积成型法(或工艺)、静电纺丝法(或工艺)、静电驱动打印法(或工艺)、颗粒浸出法(或工艺)、气体发泡技术法(或工艺)、立体光刻技术法(或工艺)、激光烧结技术法(或工艺)。

在本发明一些具体实施方式中，采用铸模法(或工艺)。

在本发明一些具体实施方式中，采用消失模法(或工艺)。

在本发明一些具体实施方式中，采用生物3D打印法(或工艺)。

根据本发明多层次结构支架的制备方法，步骤(3)冷冻所述三维结构体，从而得到固态的立体三维结构。其中以梯度方式冷冻所述三维结构体，优选地，在4℃下孵育0.5～24h，然后在-20℃下孵育0.5～48h，然后-80℃下孵育0.5～48h。该方法可以得到具有贯通性的大孔，便于细胞种植和长期培养；同时能提高支架的力学性能，方便操作和运输。

根据本发明多层次结构支架的制备方法，前述的方法，步骤(4)干燥所述冷冻的立体三维结构，从而得到具有多层级结构的支架。其中以真空冷冻干燥的方式干燥所述冷冻的三维结构体，优选地在-4℃～-80℃、1～1000Pa的条件下进行真空冷冻干燥。

根据本发明多层次结构支架的制备方法，可通过模具内腔尺寸和结构、计算机建模等方法调节所述多层次结构支架的宏观尺寸。并可根据需要制成块状、片状、囊状、管状或任意形状的组合。

本发明还提供根据前述方法制得的多层级结构支架。

本发明还提供上述多层次结构支架在至少如下一个方面的应用：1)细胞体外培养和/或大规模扩增；2)药物开发、药物筛选、药物检测或药物测试；3)构建药理模型、病理模型、组织/器官模型；4)制备体内组织修复或再生的材料；5)制备矫正或整形的植入物。

本发明还提供一种细胞三维培养方法，包括将细胞或细胞与生物相容性材料的混合物接种于上述多层次结构支架上进行三维培养。进一步地，还包括进行细胞收集和/或检测的步骤。

其中，所述细胞选自以下一种或多种细胞：各种来源的胚胎干细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞、各种器官来源的干细胞、各种器官来源的祖细胞、间充质干细胞、各种干细胞诱导分化得到的细胞、各种器官来源的成纤维细胞、各种器官来源的上皮细胞、各种器官来源的表皮细胞、各种器官来源的内皮细胞、各种器官来源的肌细胞、羊膜细胞、视锥细胞、神经细胞、血细胞、红细胞、白细胞、血小板、血管细胞、吞噬细胞、免疫细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、浆细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞、单核吞噬细胞系统的细胞、黑色素细胞、软骨细胞、骨来源细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、分泌细胞、脂肪细胞、纤毛细胞、胰腺细胞、肾细胞、肠粘膜细胞、肝细胞、肝来源的干细胞或祖细胞、肝巨噬细胞、枯否细胞、星状细胞、胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞和其他各种组织和器官来源细胞，以及各种肿瘤细胞、各种用于免疫治疗的细胞、各种经过基因编辑、病毒包装或改造的细胞与细胞系。

基于如上所述的理由，所述细胞特别优选为干细胞，更优选为胚胎干细胞或肝脏干细胞。

其中，所述生物相容性材料为藻酸盐、藻酸盐衍生物、明胶、明胶衍生物、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白、糖蛋白衍生材料、壳聚糖、壳聚糖衍生物、层连接蛋白、纤连接蛋白和纤维蛋白、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶中的至少一种，优选胶原及其衍生物。

具体地，前述的方法，制得的负载细胞的多层次结构支架可用采用静态或动态培养系统，例如借助各种形式的生物反应器、脉动培养、芯片、灌注等培养系统。

具体地，前述的方法，根据所选生物学材料的特性，实现在生理条件对多层级结构支架的内部的细胞/细胞团簇的收集，且从多层结构支架内收集细胞的过程对细胞/细胞团簇的形态、表型和功能均无影响，收获的细胞/细胞团簇可用于细胞生物学研究、组织修复、细胞移植治疗、新药研发、药物筛选、药物检测、病理/药理模型构建以及各种组织芯片模型的构建。

前述的方法，所获得的负载细胞的多层次结构支架，在体外研究中的应用包括但不限于细胞培养、细胞扩增、细胞生物学研究、药物开发、药物筛选、药物检测、药物测试、构建病理模型、构建药理模型、组织/器官模型、组织修复或再生以及矫正或整形的植入物。

本发明还包括上述方法培养所得的细胞三维培养物。

有益效果：

籍由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明所述多层级结构支架具有个性化、可定制、细胞负载高、孔隙率和通透率高、孔径大小可调节、弹性模量高以及可注射移植的特点。

1)本发明中的具有多层级结构的支架细胞负载率高。本发明的具有多层级结构的支架因其具有的多层级结构及大孔特性，细胞可均匀的分布于支架内且具有较高的负载率，能够负载药物和/或细胞以用作药物载体和/或治疗性植入物；

2)本发明中的具有多层级结构的支架具有良好的生物相容性。本发明的具有多层级结构的支架采用生物相容性材料作为基质材料，具有非常好的生物相容性，可用于体内植入；

3)本发明中的具有多层级结构的支架机械性能好。本发明的具有多层级结构的支架相比于常规/相同组分的凝胶支架表现出更高的机械稳定性；

4)本发明中的具有多层级结构的支架具有良好的生物学性能。本发明的具有多层级结构的支架可以负载多种细胞，并显著地促进了细胞的增殖、细胞聚集成团、细胞活性，维持与提高细胞功能；

5)本发明中的具有多层级结构的支架可以实现细胞的无损收集。本发明中具有多层级结构的支架由生物相容性材料作为基质材料，可以在生理条件下被水解而实现对支架内细胞/细胞团的无损收集。

附图说明

图1为本发明一个实施例多层级结构支架的示意图。

图2为本发明一些实施例多层级结构支架的示意图。

图3为本发明实施例1中肝脏干细胞在多层级结构支架上的培养情况。图3A为肝脏干细胞在支架内增殖7天后的分布情况与成团状态；图3B为相同条件下平面培养的肝脏干细胞、具有多层级结构的3D支架上的肝脏干细胞以及水化支架后收获的肝脏干细胞的肝脏特异性基因的转录水平。

图4为本发明实施例2中使用的单喷头三维打印网格样结构的示意图。

图5为本发明实施例2中制备的三维打印具有多层级结构支架的形貌表征。其中，图5A为三维打印形成的网格状三维结构体的示意图；图5B为三维打印技术制备的多层级结构支架的俯视图；图5C为三维打印技术制备的多层级结构支架的侧视图；图5D为扫描电镜观察的具有多层级结构支架的微观形貌。

图6为本发明实施例2中胚胎干细胞在具有多层级结构支架中的培养情况。其中，图6A为光镜下胚胎干细胞在多层级结构支架中培养4天后的分布与成团情况；图6B为培养4天后，平面培养的胚胎干细胞与多层级结构支架内的胚胎干细胞与Day0相比的增殖情况；图6C为相同条件下平面培养的胚胎干细胞、具有多层级结构的3D支架上的胚胎干细胞以及水化支架后收获的胚胎干细胞的全能性基因的转录水平。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。

本文中使用的术语“交联溶液”是指在配制前天溶液中与生物相容性材料起到交联作用的溶液，其可以是本领域技术人员公知可用于使得生物相容性材料发生交联从而形成具有一定黏度溶液的材料，例如氯化钙溶液，优选1～100mM，例如5mM浓度的氯化钙溶液。

本文中使用的术语“三维打印”是指：经由与自动的或半自动的、计算机辅助的三维成型装置(例如三维打印机)相匹配的方法，利用三维打印相容的原料进行的三维精确沉积。

图1、图2分别为本发明实施例多层级结构支架的示意图。

实施例1通过铸模法制备具有多层级结构支架

本实施例提供一种多层级结构支架，如图1所示，该多层级结构支架包括支架本体，其中，所述支架本体的内部具有平均孔径100μm左右的贯穿大孔，所述支架本体的孔隙率为75％，所述支架本体的杨氏模量为220kPa；所述支架本体的高度为6cm，直径(指外径)为6cm，所述支架本体还具有中空的通道，所述通道的直径为2cm。

本实施例提供上述多层级结构支架的制备方法，包括如下步骤：

1.生物材料溶液的制备

21％聚乙醇酸溶液：将聚乙醇酸粉末(Sigma-Aldrich)与0.9％氯化钠溶液按照21:100的质量比混合，用磁力搅拌器搅拌约5分钟，在100℃条件下加热直至其均匀溶解，冷却后分装，置于4℃保存。

21％纤维蛋白溶液：将纤维蛋白原粉末(Sigma-Aldrich)与0.9％氯化钠溶液按照21:100的质量比混合，，在37℃条件下加热直至其均匀溶解。

2.交联溶液的制备

600mM凝血酶溶液：将凝血酶粉末溶于去离子水中制成600mM的凝血酶溶液作为交联液。

3.前体溶液的制备

将如上所述制备的21％聚乙醇酸溶液、21％纤维蛋白原溶液、600mM凝血酶溶液均匀混合，获得最终浓度为7％聚乙醇酸、7％纤维蛋白以及200mM凝血酶的前体溶液。

4.铸模法制备三维结构体

将上述前体溶液倒入预设好的模具中，如图1所示，形成体积为外圆直径6cm，中空直径2cm，高6cm的中空圆柱体样三维结构体。

5.冷冻制备的三维结构体

梯度冷却预凝胶三维结构体，具体步骤为将三维结构体在4℃保存24h，-20℃保存48h。

6.干燥冷冻的三维结构体

在-80℃，500Pa的低温、高真空度条件下干燥三维结构体24h，形成具有层级结构的支架。为了支架后续的生物学应用，支架在紫外照射下灭菌2h后无菌条件下保存。

利用本实施例1构建的多层级结构支架对肝脏干细胞进行培养，具体如下：7.将肝脏干细胞接种到具有层级结构支架内

将肝脏干细胞(Life Technologies)以10⁴个/mL的密度均匀分散在其细胞培养基中形成细胞悬液，将1mL细胞混悬液滴加在三维细胞支架中，细胞培养箱中静置24h。

8.检测支架内细胞的分布、增殖、成团和代谢活性

给予接种后细胞的支架足量细胞培养基，置于常规细胞培养条件下(37℃，5％CO₂孵箱)进行培养，每2～3天更换新鲜培养基。

本实施例1中肝脏干细胞在铸模法构建的多层级结构支架上的培养情况见图3。

图3A为肝脏干细胞在具有多层级结构支架中培养7天后的形貌。光镜下可以观察到细胞在支架内均匀分布，形成大小均一的团簇，如图中箭头所示。

第0天、第7天分别对三维结构体内细胞进行活死染色检测。本发明使用2uMCalcein-AM(Dojindo，C326)和4.5uM PI(Dojindo，P346)的混合溶液分别对活(绿色)/死(红色)细胞进行染色，染色避光进行，持续15分钟。使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)观察记录。打印结束Day0结构体内细胞存活率约98％左右。

分别在第3天、第7天检测肝脏干细胞在具有多层级结构支架中的增殖情况。与常规二维培养相比，在初始负载细胞数量、培养环境、培养液和培养条件等完全相同的情况下，通过常用的细胞代谢活性检测试剂盒鉴定(CellTiter-

Cell Viability Assay，Promega)，各个检测时间点都显示出在本发明所制备的具有多层级结构的支架中培养肝脏干细胞与二维培养使得所培养细胞的代谢活性无显著差异。

9.检测支架上肝脏干细胞的功能

为了检测支架上肝脏干细胞的功能，采用免疫荧光染色检测了成熟肝细胞特异性标记蛋白的表达(如ALB和MRP2)。

免疫荧光染色：用磷酸缓冲液(PBS)(BI,02-024-1AC)洗涤结构；4％多聚甲醛在室温下固定30分钟，用PBS洗涤3次，每次5分钟；含0.3％Triton-X(Sigma,X100)和5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Multicell,800-096-EG)的混合液封闭1小时；吸出封闭缓冲液，加入稀释后的一抗(含0.3％Triton-X和1％BSA)，ALB(Abcam，ab83465)和MRP2(Abcam,ab3373)，4℃过夜孵育。用PBS洗涤3次，每次5分钟；加入对应二抗Alexa

594(abcam，ab150080)和Alexa

488(abcam，ab150113)，室温避光孵育2小时后，用PBS洗涤3次，每次5分钟；接着加入DAPI染细胞核，室温避光孵育5分钟。用激光共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)观察记录。

10.支架内细胞团簇的无损收集与收获细胞团簇的表型、功能维持

本实验中的具有多层级结构支架是由可水解的天然材料构成，可以在生理条件下被水解而实现支架内细胞的无损收集。

采用qPCR技术分别检测平面培养的、支架内的细胞团簇、以及水解支架后收获的细胞团簇的成熟肝细胞相关基因的转录水平。结果如图3B所示，3D支架内的细胞的基因转录水平显著高于平面培养的细胞水平，其中3D支架内的细胞的ALB的表达水平是平面培养的细胞的15倍，而3D支架内的细胞的MRP2的表达水平是平面培养的细胞的4倍。这说明在支架上培养了7天后，肝脏干细胞显著向成熟肝细胞分化。而水解结构后可以收获的细胞团簇，其ALB和MRP2的基因表达水平与3D支架内的细胞没有差异。表明水解支架获得细胞这一过程对细胞的形态、表型和功能均没有影响。

qPCR技术：

提取细胞RNA操作步骤：用PBS洗涤结构1次，每个结构加入1ml Trizol(Gibco,15596026)，反复吹打混匀，在室温静置10分钟，然后转移至1.5ml的EP管中，加入200ul氯仿，快速摇30秒，室温放置5分钟后，在4℃以12000g条件离心10分钟。去除上清液，加入等体积异丙醇，在4℃以12000g条件离心10分钟。弃去上清，用75％无水乙醇洗涤沉淀，风干后可获得RNA，使用DEPC水溶解。用spectrophotometer(Thermo Scientific)来检测RNA浓度及纯度。

RNA反转录操作步骤：采用PrimeScript^TMII 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，6210)，完全按照试剂盒说明书来进行操作。RNA含量均调整为5ng。引物为：OligodT Primer。反转录PCR程序为：42℃50min，95℃，5min，4℃保温，所用PCR仪(ABI，SimpliAmpTM热循环仪)。

荧光定量PCR操作步骤：使用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(ThermoScientific,K0251)，试剂盒，完全按照试剂盒说明书进行操作。按要求加入反应液后，将反应板置于qPCR仪进行检测，反应程序为：95℃，10min，95℃15s，60℃30s，40个循环，72℃30s，72℃10min。获得基因在不同时间点的表达(图3B)。

qPCR所用引物序列如下(5′-3′)：

ALB引物序列：

Forward：GCACAGAATCCTTGGTGAACAG

Reverse：ATGGAAGGTGAATGTTTCAGCA

MRP2引物序列：

Forward：TGAGCAAGTTTGAAACGCACAT

Reverse：AGCTCTTCTCCTGCCGTCTCT

实施例2通过单喷头三维打印制备具有多层级结构的支架

本实施例提供一种多层级结构支架，如图4、图5所示，该多层级结构支架包括支架本体，其中，所述支架本体的内部具有平均孔径100μm左右的贯穿大孔，所述支架本体的孔隙率为95％，所述支架本体的杨氏模量为30kPa；所述支架本体具有尺寸为1cm×1cm×0.5cm三维结构，所述支架本体由300μm左右的材料微丝组成，所述支架本体具有间隔约为1cm的中空通道。

进一步次，所述支架本体由多个层级的结构组成。

1.按与实施例1相同的方法制备浓度为7％聚乙醇酸、7％纤维蛋白原以及200mM凝血酶的前体溶液。

2.通过单喷头三维打印制备具有多层级结构的支架

使用单喷头挤压式打印机构建立体三维结构，单喷头3D打印机的示意图如图4所示。将前体溶液收集至无菌注射器内，无菌注射器装载到生物三维打印设备中(Regenovo,Bio-architect X)，该打印机配备了非破坏性光学相干层析成像(OCT)系统，可以实现在打印过程中的无损监测，以保证样品质量，减少批次内和批次间差异。打印机以支持速度、轮廓速度、网格速度和挤出速度分别为50mm/s,50mm/s,50mm/s,50μL/s的参数条件下，在无菌的可温控的底面平台上三维打印，底面平台温度设置为0℃，形成体积为3cm/3cm/1cm的水凝胶三维结构体，示意图如图5A所示。

3.冷冻制备的三维结构体

梯度冷却预凝胶三维结构体，具体步骤为将三维结构体在4℃保存24h，-20℃过夜保存。

4.干燥冷冻的三维结构体

在-80℃，500Pa的低温、高真空度条件下干燥三维结构体24h，形成具有层级结构的支架。为了支架后续的生物学应用，支架在紫外照射下灭菌2h后无菌条件下保存。干燥冷冻后的具有多层级结构支架的宏观结构如图5B(俯视图)和图5C(侧视图)所示。采用扫描电镜观察了支架微观的大孔结构，支架内贯穿大孔直径在100～300μm，如图5D所示。

利用本实施例构建的多层级结构支架对胚胎干细胞进行培养，具体如下：

5.将胚胎干细胞接种到具有层级结构支架内

将胚胎干细胞(Life Technologies)以10⁴个/mL的密度均匀分散在其细胞培养基中形成细胞悬液，将1mL细胞混悬液滴加在三维细胞支架中，采用动态种植的方法，将加入细胞悬液的支架在水平振动筛(WD-9405F,Beijing Hinsr Technology Co.，Ltd.)上以5000RPM速度旋转培养，在细胞培养条件下(37℃，5％CO₂孵箱)持续12h。

6.检测支架内细胞的分布、增殖、成团和代谢活性

给予接种后细胞的支架足量细胞培养基，置于常规细胞培养条件下(37℃，5％CO2孵箱)进行培养，每2～3天更换新鲜培养基。图6A为胚胎干细胞在具有多层级结构支架中培养7天后的形貌，箭头所指为胚胎干细胞团簇。光镜下可以观察到细胞在支架内均匀分布，形成大小均一的团簇，

第0天、第7天分别对三维结构体内细胞进行活死染色检测。本发明使用2uMCalcein-AM(Dojindo，C326)和4.5uM PI(Dojindo，P346)的混合溶液分别对活(绿色)/死(红色)细胞进行染色，染色避光进行，持续15分钟。使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)观察记录。打印结束Day0结构体内细胞存活率约99％左右。

图6B图为胚胎干细胞在三维打印具有多层级结构支架中增殖情况。与常规二维培养相比，在初始负载细胞数量、培养环境、培养液和培养条件等完全相同的情况下，通过常用的细胞代谢活性检测试剂盒鉴定(CellTiter-

Cell Viability Assay，Promega)，各个检测时间点都显示出在本发明所制备的三维打印的具有多层级结构支架中培养胚胎干细胞相比于二维培养使得所培养细胞的代谢活性显著提高。

7.检测支架上胚胎干细胞的全能性

为了检测支架上胚胎干细胞的全能性，采用免疫荧光染色检测了经典的全能性标记蛋白的表达(如OCT4和Ecad)。

免疫荧光染色：用磷酸缓冲液(PBS)(BI,02-024-1AC)洗涤结构；4％多聚甲醛在室温下固定30分钟，用PBS洗涤3次，每次5分钟；含0.3％Triton-X(Sigma,X100)和5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Multicell,800-096-EG)的混合液封闭1小时；吸出封闭缓冲液，加入稀释后的一抗(含0.3％Triton-X和1％BSA)，OCT4(Abcam,ab19857)和E-cadherin(Abcam,ab231303)，4℃过夜孵育。用PBS洗涤3次，每次5分钟；加入对应二抗Alexa

594(abcam，ab150080)和Alexa

8.支架内细胞团簇的无损收集与收获细胞团簇的表型、功能维持

采用qPCR技术分别检测平面培养的、支架内的细胞团簇、以及水解支架后收获的细胞团簇的经典全能性相关基因的转录水平。结果如图6C所示，平面培养的细胞、3D支架内的细胞以及水解结构后收获的细胞团簇的全能性基因转录水平没有显著差异。表明在我们的具有多层级结构的支架上培养以及水解支架获得细胞这些过程对细胞的形态、表型和全能性均没有影响。

qPCR技术：提取细胞RNA操作步骤：用PBS洗涤结构1次，每个结构加入1ml Trizol(Gibco,15596026)，反复吹打混匀，在室温静置10分钟，然后转移至1.5ml的EP管中，加入200ul氯仿，快速摇30秒，室温放置5分钟后，在4℃以12000g条件离心10分钟。去除上清液，加入等体积异丙醇，在4℃以12000g条件离心10分钟。弃去上清，用75％无水乙醇洗涤沉淀，风干后可获得RNA，使用DEPC水溶解。用spectrophotometer(Thermo Scientific)来检测RNA浓度及纯度。

荧光定量PCR操作步骤：使用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(ThermoScientific,K0251)，试剂盒，完全按照试剂盒说明书进行操作。按要求加入反应液后，将反应板置于qPCR仪进行检测，反应程序为：95℃，10min，95℃15s，60℃30s，40个循环，72℃30s，72℃10min。获得基因在不同时间点的表达(图6B)。

qPCR所用引物序列如下(5′-3′)：

OCT4引物序列：

Forward：GAAGCAGAAGAGGATCACCTTG

Reverse：TTCTTAAGGCTGAGCTGCAAG

Nanog引物序列：

Forward：CCTCAGCCTCCAGCAGATGC

Reverse：CCGCTTGCACTTCACCCTTTG

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 清华大学

<120> 多层次结构支架及其制备方法与应用

<130> KHP191116275.3

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcacagaatc cttggtgaac ag 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaaggtg aatgtttcag ca 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgagcaagtt tgaaacgcac at 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agctcttctc ctgccgtctc t 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagcagaag aggatcacct tg 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcttaaggc tgagctgcaa g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctcagcctc cagcagatgc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgcttgcac ttcacccttt g 21

Claims

1.一种多层次结构支架的制备方法，包括以下步骤：

1）将生物相容性材料与相应的交联剂制成前体溶液；

2）以所述前体溶液为材料制备成三维结构体；

3）冷冻所述三维结构体；

4）干燥冷冻后的所述三维结构体，从而得到多层次结构支架；

所述生物相容性材料的质量百分比浓度为1%~25%；所用交联溶液的质量百分比浓度为1mM~100mM；所述生物相容性材料与交联剂溶液按10:1~1:10的体积比混合；

所述前体溶液是由浓度为1%~25%的聚乙醇酸溶液、浓度为1%~25%的纤维蛋白原溶液和浓度为1~2000mM的凝血酶溶液制成；

其中以梯度方式冷冻所述三维结构体，在4℃下孵育0.5~24 h，然后在-20℃下孵育0.5~48 h，然后-80℃下孵育0.5~48 h；以真空冷冻干燥的方式干燥所述冷冻的三维结构体，在-4℃~-80℃、1~1000 Pa的条件下进行真空冷冻干燥。

2.权利要求1所述方法制备的所述多层次结构支架。

3.根据权利要求2所述的多层次结构支架，其中，

所述支架本体的内部具有平均孔径10~500 μm的贯穿大孔；

所述支架本体的孔隙率为10%-95%；

所述支架本体的杨氏模量为 0.1kPa-10Mpa；

所述支架本体还具有至少一个中空通道；所述中空通道贯穿所述支架本体的顶部和底部；所述中空通道的直径为0.5-5cm。

4.根据权利要求2所述的多层次结构支架，其中，

所述支架本体的宏观结构为柱状、块状、片状、囊状或管状；和/或，

所述支架本体为圆柱体、正方体或棱柱体；和/或，

所述支架本体的内部具有平均孔径100~200 μm级别的贯穿大孔；和/或，

所述支架本体的孔隙率为50%-90%；和/或，

所述支架本体的杨氏模量为30-220kPa。

5.根据权利要求2所述的多层次结构支架，其中，

所述支架本体的高度与直径的比例为（0.1-10）:（10-0.1）；和/或，

所述支架本体的高度为4-10cm；和/或，

所述支架本体的直径为4-10cm；和/或，

所述支架本体的孔隙率为75%-90%。

6.根据权利要求2所述的多层次结构支架，其中，

所述支架本体的高度与直径的比例为1:1；和/或，

所述支架本体的高度为6cm；和/或，

所述支架本体的直径为6cm；和/或。

7.根据权利要求2所述的多层次结构支架，其中，

所述支架本体具有上尺寸为1~50 cm的三维结构；和/或，

所述支架本体所述支架本体由50~800 μm左右的材料微丝组成；和/或，

所述支架本体具有间隔0.1~100 mm的中空通道。

8.根据权利要求2所述的多层次结构支架，其中，

所述支架本体具有上尺寸为1cm×1cm×0.5cm的三维结构。

9.根据权利要求2所述的多层次结构支架，其中，所述多层次结构支架在压缩时表现出至少20%-70%或更高的压缩应变而不发生永久形变或机械破坏。

10.权利要求2-9任一项所述多层次结构支架在至少如下一个方面的应用：1）细胞体外培养和/或大规模扩增；2）药物开发、药物筛选、药物检测或药物测试；3）构建药理模型、病理模型、组织/器官模型；4）制备体内组织修复或再生的材料；5）制备矫正或整形的植入物。

11.一种细胞三维培养方法，包括将细胞或细胞与生物相容性材料的混合物接种于权利要求2-9任一项所述多层次结构支架上进行三维培养。

12.根据权利要求11所述的细胞三维培养方法，还包括进行细胞收集和/或检测的步骤。

13.根据权利要求11或12所述的细胞三维培养方法，其中，

所述细胞选自以下一种或多种细胞：各种来源的胚胎干细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞、各种器官来源的干细胞、各种器官来源的祖细胞、间充质干细胞、各种干细胞诱导分化得到的细胞、各种器官来源的成纤维细胞、各种器官来源的上皮细胞、各种器官来源的表皮细胞、各种器官来源的内皮细胞、各种器官来源的肌细胞、羊膜细胞、视锥细胞、神经细胞、血细胞、红细胞、白细胞、血小板、血管细胞、吞噬细胞、免疫细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、浆细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞、单核吞噬细胞系统的细胞、黑色素细胞、软骨细胞、骨来源细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、分泌细胞、脂肪细胞、纤毛细胞、胰腺细胞、肾细胞、肠粘膜细胞、肝细胞、肝来源的干细胞或祖细胞、肝巨噬细胞、枯否细胞、星状细胞、胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞和其他各种组织和器官来源细胞，以及各种肿瘤细胞、各种用于免疫治疗的细胞、各种经过基因编辑、病毒包装或改造的细胞与细胞系。

14.根据权利要求13所述的细胞三维培养方法，其中，所述细胞为胚胎干细胞或肝脏干细胞。