CN114807004B - 一种三维细胞生长支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种三维细胞生长支架，所述三维细胞生长支架是由悬臂构建形成的三维网络结构，其中悬臂的横截面尺寸比细胞种子小，悬臂间形成的孔隙尺寸不小于细胞种子，且孔隙尺寸不大于成熟细胞。这一尺寸设计使得培养的单细胞具有三维形态的同时，也使细胞整体分布更接近体内状态，实现了对细胞空间分布的调节，促进和诱导了细胞功能化，在体外细胞培养、细胞基础学研究、药物筛选以及组织修复等方面具有很大应用潜力。同时，该三维细胞生长支架以水凝胶单体聚合而成的光刻胶为主要材料，采用飞秒激光技术制备得到，生物安全性高、加工方法简单且精度高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域。更具体地，涉及一种三维细胞生长支架及其制备方法。
背景技术
体内细胞赖以生长的微环境，为细胞提供机械支撑、扩展空间以及输送营养物质等，对细胞的黏附、迁移、增殖、分化、存活等生物行为有重要影响。然而目前广泛应用的体外细胞培养仍然是二维的，无法模拟体内真实生长微环境，细胞的生长状态与体内差别较大。三维支架细胞培养是利用三维结构模拟体内微环境环境，研究发现其对细胞的增殖分化的有效控制优于二维细胞培养。目前为止，三维支架培养有一定的研究，但是所用的支架要么孔隙和悬臂远小于细胞，要么远大多数大于细胞，细胞不论是落在悬臂上，还是落在孔隙中，其生长均同二维生长一样。
因此，需要提供一种能够诱导细胞实现真三维生长的支架，这将细胞基础学研究和组织工程中的创伤修复、药物筛选及递送等都有很重要的意义，有望开启体外细胞培养的新时代。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种三维细胞生长支架，该支架是由悬臂构建形成的三维网络结构，悬臂的横截面尺寸小于细胞种子，但是又能够支撑细胞种子，悬臂间形成的孔隙不小于细胞种子，且不大于成熟细胞的尺寸，因此，细胞在支架中可以定植在不同高度的不同位置，形成三维分布，可以更真实模拟体内细胞生长微环境。同时，细胞可以沿着悬臂表面向空间不同位置伸出伪足，形成三维伪足网络，使单细胞具有更接近体内的真三维形态，实现了低密度下细胞间的三维信息交互和物质运输。
本发明的另一个目的在于提供上述三维细胞生长支架的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种三维细胞生长支架，所述三维细胞生长支架是由悬臂构建形成的三维网络结构，其中悬臂的横截面尺寸比细胞种子小，悬臂间形成的孔隙尺寸不小于细胞种子，且孔隙尺寸不大于成熟细胞。
优选地，所述悬臂横截面面积与细胞种子尺寸的比值为1：(2-20)；孔隙大小与细胞种子尺寸的比值为1：(0.16-1)，孔隙大小与成熟细胞尺寸的比值为1：(1-3)。
优选地，所述三维细胞生长支架的高度为10-100μm。
当构建的形成细胞生长的3D支架的悬臂尺寸及其形成的孔隙尺寸都大于成熟细胞时，细胞无论落在悬臂上还是落入孔隙底部表面，细胞都是二维生长模式；当悬臂和孔隙尺寸都远小于细胞时，细胞生长支架相对于细胞来说只是一个图案化表面，细胞的生长介于二维和三维之间，细胞形态及其互交模式与二维细胞相近。二维培养的细胞沿着平面形成相互连接，进行信息交流和物质传递，这种通讯由于依附在平面上，所以是二维的网络(图4中的(a)图)。
而本发明中构建形成细胞生长支架的悬臂横截面尺寸比细胞种子略小，既能支撑住细胞种子，又能使细胞沿着悬臂表面向空间不同位置伸出伪足，形成空间三维伪足网络，使得单细胞具有三维形态，实现低细胞密度下细胞间的三维信息互交和物质运输；而孔隙尺寸不小于细胞种子时，细胞在支架中可以定植在不同高度的不同位置处，形成三维分布，如图2所示，更真实的模拟细胞在体内的生长环境，有望调节细胞空间分布，促进和诱导细胞功能化，在体外细胞培养、细胞基础学研究、药物筛选以及组织修复等方面具有很大应用潜力。三维细胞分布中，细胞能粘附在不同高度位置处，细胞间可以沿着支架悬臂形成横向和纵向交错的3D通讯网络(图4中的(b)图)。
优选地，所述悬臂的横截面尺寸为1-100μm2，所述孔隙的尺寸为25-10000μm2；优选地，所述悬臂的横截面尺寸为1-25μm2，所述孔隙的尺寸为10-2500μm2。更优选地，所述三维网络结构是由横截面为正方形的悬臂搭接而成的多层网格状结构，其中正方形的边长为1-10μm，每一层中悬臂间的间距为5-100μm；进一步地，正方形的边长为1-5μm，每一层中悬臂间的间距为10-50μm。其结构如图1所示，图中悬臂的高度和宽度即为横截面正方形的边长，孔隙边长就是悬臂间的间距，采用棒状悬臂搭接，是由于这种类型支架，每层的孔隙上方的中间位置存在一个悬臂。当细胞种子的尺寸小于孔隙尺寸，但大于孔径的一半时，细胞可以粘附在支架上不同高度位置处，即使在较低的密度下，细胞也可以依附着悬臂在间隙或者悬臂上形成真正的三维模式的生长和增殖。
进一步地，所述悬臂横截面的尺寸包括但不限于20μm2，40μm2，60μm2或80μm2；所述孔隙的尺寸包括但不限于100μm2、500μm2、1000μm2、1500μm2或2000μm2。
优选地，所述悬臂的材质为负性光刻胶；
优选地，所述负性光刻胶的主要原料为水凝胶单体。
优选地，所述凝胶单体选自丙烯酸酯改性明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、聚乙二醇聚二丙烯酸酯中的一种；
优选地，所述水凝胶选自丙烯酸酯改性明胶或聚乙二醇聚二丙烯酸酯。
为制备得到本发明中的三维细胞生长支架，本发明提供了下述制备过程：
将混合均匀的光刻胶原料放置在纳米光子学超细微加工系统中，设置好加工参数，光刻胶原料在激光扫描下发生聚合，去除未聚合的光刻胶原料，获得三维细胞生长支架。
优选地，光刻胶原料包括有水凝胶单体、交联剂、光敏剂和引发剂；
优选地，所述水凝胶单体、交联剂、光敏剂和光引发剂的质量比为(19-99.8)：(79-0)：(0.1-1)：(0.1-1)。
控制光刻胶原料中各组分的比例有利于得到结构均匀的支架，因为当原料中光敏剂和引发剂量过少，激光扫描过的区域产生的活性基团(自由基等)少，聚合性能就不好；而当光敏剂和引发剂的量过大，瞬时产生的自由基的量太多，会发生爆聚，这都会导致最终得到的支架结构不均匀。
优选地，所述加工参数包括有激光功率、扫描速度、悬臂尺寸、悬臂间距、加工周期。扫描速度和激光功率会影响水凝胶单体的聚合度，进而影响细胞生长支架的强度和形貌。
三维细胞生长支架的具体制备过程为：
S1：将水凝胶单体、交联剂、光敏剂和光引发剂混合，通过磁力搅拌得到透明均一的混合溶液；在带有十字划痕的干净盖玻片中心位置处放置一小块透明回形垫片，取少量搅拌均匀的透明液体滴在回形垫片中，盖上一片盖玻片，压实，使光刻胶充满回形空间，得待加工样品。
S2：将准备好的光刻胶原料放置在纳米光子学超细微加工系统的载物台上，保证样品稳定，打开加工程序，找好起始最佳聚焦平面，设置激光功率、扫描速度、悬臂尺寸、悬臂间距、加工周期等参数，让激光沿着程序设定的路径进行直写，激光扫描过的区域，光刻胶原料发生聚合。
S3：将加工后的样品取下，去掉盖玻片和回形垫片，用显影剂浸泡样品1-10min，或者直接用显影剂冲洗，去除未聚合的光刻胶，吹风机热风从背面吹干带结构的盖玻片，得到三维细胞生长支架。
具体地，S1中光刻胶原料的量不宜过大，过大时，玻璃片间光刻胶的毛细力更大，玻璃片分开时所需的力更大，这可能会导致结构掉落。S2中的最佳聚焦平面是指激光焦点处，此处的激光斑最细最圆，在这一平面处用最佳加工功率和速度进行画线，线条最细最浅。优选地，加工过程中激光功率为3-15mW，扫描速度为6-500μm/s；进一步地，激光功率更优选为4-10mW，扫描速度优选为50-200μm/s。
由于支架和玻璃片表面是物理粘附，样品在显影剂中浸泡时间过长或者冲洗力度过大，都会使结构掉落。因此，可以在加工结束后将样品放置一段时间，使得细胞生长支架和玻璃表面的粘附稳定后，再进行显影。S3中使用的显影剂优选为去离子水或无水乙醇，浸泡时间优选为2-5min。
本发明中三维细胞生长支架的应用过程包括：
1)细胞培养：将传代的细胞种子加入清洗和灭菌处理的后的带该三维细胞生长支架的培养皿，37℃，5％CO2培养箱内孵育48h；
2)荧光染色及激光共聚焦显微观察：将步骤1)中的细胞，去除细胞液，进行固定和通透后，进行肌动蛋白和细胞核共染；
3)逐级脱水及扫描电子显微镜观察：步骤2)观察过的细胞经过乙醇梯度脱水后，自然风干，喷金,进行扫描电子显微图像采集。
优选地，细胞支架在使用之前先进行消毒杀菌处理，可采用PBS缓冲液冲洗多次，或在紫外灯下照射不低于30min。
优选地，步骤1)所述细胞种子加入时需要防止气泡产生，因为气泡会扩散到3D支架上，被支架缚住，这些气泡会影响细胞在支架上的生长区域、以及增殖和粘附。
优选地，步骤2)所述荧光染色包括肌动蛋白染色和细胞核染色。肌动蛋白染色探针选择鬼笔环肽，细胞核染色探针可以是DAPI或者Hoechst。加入探针后需避光孵育一段时间。步骤2)中的鬼笔环肽染色避光孵育时间为20-90min，细胞核染色选用DAPI即染液，孵育时间为2-15min。
优选地，步骤3)梯度脱水主要通过将细胞依次在体积比分别为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的乙醇溶液中浸泡10-30min；更优选地，浸泡时间可以选10min或15min；进一步优选为10min。
上述细胞生长支架具有特殊的细胞相关性尺寸设计，这种特殊尺寸设计的细胞支架，可以更真实的模拟体内细胞生长微环境，实现单细胞的真三维生长形貌，有望调节细胞空间分布，促进和诱导细胞功能化，在体外细胞培养、细胞基础学研究、药物筛选以及组织修复等方面具有很大应用潜力。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种三维细胞生长支架，该支架是由悬臂构建形成的三维网络结构，悬臂横截面尺寸小于细胞种子，悬臂间形成的孔隙尺寸不小于细胞种子且不大于成熟细胞，这一尺寸设计使得单细胞具有三维形态的同时，也使细胞整体分布更接近体内状态，实现了对细胞空间分布的调节，促进和诱导细胞功能化，在体外细胞培养、细胞基础学研究、药物筛选以及组织修复等方面具有很大应用潜力。同时，该三维细胞生长支架以水凝胶单体聚合而成的光刻胶为主要材料，采用飞秒激光技术制备得到，生物安全性高、加工方法简单且精度高。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明中三维细胞生长支架的结构示意图。
图2示出本发明中三维细胞生长支架中细胞模拟体内真三维形貌的示意图。
图3示出实施例2中20μm孔隙三维细胞生长支架培养L929细胞48h后的激光扫描共聚焦显微镜图片，a为DAPI染细胞核的图片，b为鬼笔环肽染肌动蛋白的图片，c是所有荧光通道的叠加图。
图4示出本发明提出的二维细胞分布及三维细胞分布时细胞间的通讯网络示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
1)将聚合单体，交联剂，光敏剂和光引发剂混合在一起，通过磁力搅拌混合均匀，配制透明的液态光刻胶原料。其中，水凝胶单体、交联剂、光敏剂和光引发剂质量比为39:59:1:1。磁力搅拌至少30min。
2)在带有十字划痕的干净盖玻片中心位置处放置一小块透明回形垫片，取少量步骤1)配制好的光刻胶滴在回形垫片中，盖上一片盖玻片，压实，使光刻胶充满回形空间。
3)将步骤2)中准备好的样品小心放置在纳米光子学超细微加工系统的载物台上，为保持样品放置水平，且在加工过程中不移动，在样品上面放置压环来保证样品稳定。然后打开加工程序，找好起始最佳聚焦平面。其中，最佳加工功率为5.6mW，最佳加工速度为150μm/s。设置支架悬臂宽为3μm，高为3.5μm，悬臂间距为10μm，让激光沿着程序设定的路径进行直写，激光扫描过的区域聚合出10μm的3D细胞支架结构。每个盖玻片上制备至少两个相同参数的木堆。
4)将步骤3)加工中直写后的样品取下，去掉盖玻片和回形垫片，用去离子水或者无水乙醇浸泡者直接冲洗样品5min，去除未聚合的光刻胶，吹风机热风从背面吹干带结构盖玻片。
5)将步骤4)中制备好结构的盖玻片进行清洗和紫外灭菌处理。其中清洗是使用PBS和培养基多次冲洗表面，紫外灭菌处理是在超净台上紫外照射30min,保证结构表面无菌，便于细胞生长。
6)在经过步骤5)处理的支架上种植成纤维细胞L929，在37℃，5％CO2气氛下培养48h。
所得的三维细胞支架示意图如附图1，支架悬臂尺寸小于成纤维细胞种子尺寸，孔隙尺寸略大于成纤维细胞种子，但小于成熟细胞尺寸。成纤维细胞培养48h全部定植在支架上表面，但与二维平面上细胞不同的是，10μm支架上表面的这些细胞可以沿着悬臂间隙呈现横向星型铺展和Z向延伸，这种铺展增大了表面积，有利于物质传递和信息交互。
实施例2
1)将聚合单体，交联剂，光敏剂和光引发剂混合在一起，通过磁力搅拌混合均匀，配制透明的液态光刻胶。其中，水凝胶单体、交联剂、光敏剂和光引发剂质量比为39:59:1:1。磁力搅拌至少30min。
2)在带有十字划痕的干净盖玻片中心位置处放置一小块透明回形垫片，取少量步骤1)配制好的光刻胶滴在回形垫片中，盖上一片盖玻片，压实，使光刻胶充盈回形空间。
3)将步骤2)中准备好的样品小心放置在纳米光子学超细微加工系统的载物台上，为保持样品放置水平，且在加工过程中不移动，在样品上面放置压环来保证样品稳定。然后打开加工程序，找好起始最佳聚焦平面。其中，加工功率为5.6mW，加工速度为150μm/s。设置支架悬臂宽为3μm，高为3.5μm，棒间距为20μm，让激光沿着程序设定的路径进行直写，激光扫描过的区域聚合出20μm的3D细胞支架结构。
4)将步骤3)加工中直写后的样品取下，去掉盖玻片和回形垫片，用显去离子水或者无水乙醇浸泡者直接冲洗样品5min，吹风机热风从背面吹干带结构盖玻片。
5)将步骤4)中制备好结构的盖玻片进行清洗和紫外灭菌处理。清洗是使用PBS和培养基多次冲洗表面，紫外灭菌处理是在超净台上紫外照射30min,保证结构表面无菌，便于细胞生长。
6)在经过步骤5)处理的支架上种植成纤维细胞L929，在37℃，5％CO2气氛下培养48h。
细胞的三维生长的示意图如附图2，支架悬臂尺寸小于成纤维细胞种子尺寸，孔隙大于成纤维细胞种子，略小于成熟细胞尺寸。成纤维细胞培养48h后激光扫描共聚焦显微镜观察到的照片示于图3，其中的a是DAPI染色细胞核的结果，b是鬼笔环肽染色肌动蛋白骨架结果，c是所有荧光通道的叠加图，细胞在20μm孔隙的3D支架中不仅形貌是立体的，其分布位置也是三维立体的。
这种特殊尺寸设计的3D细胞支架能诱导细胞真三维生长，细胞的形貌立体，骨架延伸比二维平面上的细胞更复杂，支架上细胞骨架的片状伪足更多，细胞的表面积更大，伪足数目也更多。二维平面的细胞骨架扁平，片状伪足一般只有两到三个。3D支架上的细胞骨架立体，片状伪足数量增多一倍不止，片状伪足前端的丝状伪足相应增多，且Z方向也出现了肌动蛋白的铺展。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种三维细胞生长支架，其特征在于，所述三维细胞生长支架是由横截面为正方形的悬臂搭接形成的三维网络结构，且所述三维网络结构中每层的孔隙上方的中间位置存在一个悬臂； 所述孔隙的边长是悬臂间的间距；其中悬臂的横截面尺寸比细胞种子小，悬臂间形成的孔隙尺寸不小于细胞种子，且孔隙尺寸不大于成熟细胞；
所述悬臂的横截面尺寸为1-25μm2，所述孔隙的尺寸为10-2500μm2。
2.根据权利要求1所述的三维细胞生长支架，其特征在于，所述三维细胞生长支架的高度为10-100μm。
3.根据权利要求1所述的三维细胞生长支架，其特征在于，所述悬臂的材质为负性光刻胶。
4.根据权利要求3所述的三维细胞生长支架，其特征在于，所述负性光刻胶原料包括水凝胶单体。
5.根据权利要求4所述的三维细胞生长支架，其特征在于，所述水凝胶单体选自丙烯酸酯改性明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、聚乙二醇聚二丙烯酸酯中的一种。
6.根据权利要求4所述的三维细胞生长支架，其特征在于，所述水凝胶单体选自丙烯酸酯改性明胶或聚乙二醇聚二丙烯酸酯。
7.一种如权利要求1-6任一所述三维细胞生长支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将混合均匀的光刻胶原料放置在纳米光子学超细微加工系统中，设置好加工参数，光刻胶原料在激光扫描下发生聚合，去除未聚合的光刻胶原料，获得三维细胞生长支架。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述光刻胶原料包括有水凝胶单体、交联剂、光敏剂和光引发剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述水凝胶单体、交联剂、光敏剂和引发剂的质量比为：（19-99.8）：（79-0）：（0.1-1）：（0.1-1）。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述加工参数包括有激光功率、扫描速度、悬臂尺寸、悬臂间距、加工周期。
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