CN106146912A - 一种具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医用材料和组织工程领域,具体涉及了一种具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶及其制备方法。所述制备方法为:制备PDMS胶微图案模板;配制海藻酸钠溶液,并混合钙盐粉末,将所得混合体系浇筑在PDMS胶微图案模板上,置于酸性气体环境中熏蒸;或者,将海藻酸钠溶液浇筑于PDMS胶微图案模板上后,用透析膜密封并置于钙离子溶液中,使海藻酸钠与钙离子充分反应交联形成具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶。本发明制备所得海藻酸钙水凝胶具有精细的三维微图案,可以使细胞限定在三维微图案里,调控细胞的形态、分布和排列,从而模拟细胞在机体内的生存环境,可用于细胞与组织再生培养的研究。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料和组织工程领域,具体涉及了一种具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶及其制备方法。
背景技术
随着生物医学工程和组织工程的发展,近年来生物材料的微图案化研究和三维仿生构建越来越受到关注。机体细胞大多生存在一个稳定的、具有复杂且精细的三维微环境中。这个赖以生存的微环境不仅给细胞提供支撑和连接,还通过细胞间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用,提供营养,交流信息,获得各种生化和机械信号,维持其正常的生理活动。三维生物材料支架能够影响细胞粘附、增殖、分化,为细胞提供生长模板,控制细胞的形状,影响组织和器官的生长。在体外构建细胞和生物材料支架的复合体,并研究细胞与材料间的相互作用,其中一个关键点就是要模拟机体内的形貌、结构和功能等细胞外环境。与传统的细胞工程研究方法相比,生物材料的三维微图案化,能更好模拟细胞在机体内的生存环境,调控细胞行为并形成仿生结构。因此,随着组织工程的不断发展,生物材料的微图案技术越来越受到重视,并得以广泛的研究和应用。
高分子水凝胶由于其良好的可塑性、仿生性、生物相容性,越来越多用于组织工程支架的选择。与传统的高分子支架材料相比,水凝胶材料支架性质更接近于机体内的组织环境。水凝胶作为集吸水、保水、控释于一体的高分子功能材料,可以很好的传递、供给细胞营养,调节细胞的生长和分化,同时还可以作为药物和生长因子缓释体系,更好地模拟各种机体内物化环境。此外,水凝胶分子具有极好的可塑性,可通过微图案筑模或三维打印方式,形成具有高度仿生的精细结构,从而更好更全面地调控细胞行为,是优秀的研究细胞与生物材料相互作用的组织工程载体。
目前被广泛研究和应用的天然高分子水凝胶材料有胶原、明胶、透明质酸、琼脂糖、壳聚糖、海藻酸钙等。但大多数由于其机械强度或弹性模量较低,固化交联后易于溶胀变形,形貌结构易于降解不稳定,因此在三维微图案的构建上具有一定局限性。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足,目的在于提供一种具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶及其制备方法。
为实现上述发明目的,本发明所采用的技术方案为:
一种具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)通过负光刻胶光刻在硅片上制备微图案,通过PDMS胶倒模固化后,揭模,将PDMS胶置于培养皿内,作为PDMS胶微图案模板;
(2)配制海藻酸钠溶液,向海藻酸钠溶液中加入钙盐粉末,进行超声或搅拌直至钙盐粉末在海藻酸钠溶液中分散均匀,得到海藻酸钠与钙盐粉末的混合体系;将所得海藻酸钠与钙盐粉末的混合体系浇筑在步骤(1)所述置于培养皿内的PDMS胶微图案模板上,使海藻酸钠与钙盐粉末的混合体系在PDMS胶微图案模板表面形成均匀的薄层,随后将培养皿置于酸性气体环境中,使钙盐粉末缓慢释放出钙离子,钙离子与海藻酸钠充分反应交联形成海藻酸钙水凝胶;
或者,将海藻酸钠溶液浇筑与步骤(1)所述置于培养皿内的PDMS胶微图案模板上,用透析膜将培养皿密封后置于钙离子溶液中,钙离子缓慢透过透析膜进入到培养皿中,海藻酸钠与钙离子充分反应交联形成海藻酸钙水凝胶;
(3)将步骤(2)所得海藻酸钙水凝胶取出,揭除PDMS胶微图案模板,置于水中浸泡去除残余杂质后,得到具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶。
上述方案中,所述钙盐粉末为碳酸钙、硫酸钙、磷酸钙和羟基磷灰石中的一种。
上述方案中,所述钙盐粉末和海藻酸钠的摩尔比是1:2~2:1。
上述方案中,所述海藻酸钠溶液的质量浓度为0.5wt%~5wt%。
上述方案中,所述酸性气体环境为二氧化碳气体环境、二氧化氮气体环境、由醋酸熏蒸产生的气体环境、或盐酸熏蒸产生的气体环境。
上述方案中,在酸性气体环境中,钙离子与海藻酸钠反应交联的时间为6小时以上;
上述方案中,所述钙离子溶液为氯化钙溶液、硝酸钙溶液、碳酸氢钙溶液、硫酸氢钙溶 液和氢氧化钙溶液中的一种,所述钙离子溶液中钙离子的浓度为0.1~5mol/L。
上述方案中,所述钙离子溶液为氯化钙溶液。
上述方案中,所述钙离子透过透析膜与海藻酸钠反应交联的时间为12小时以上。
上述方案中,所述微图案为三角形阵列、矩形阵列、正方形阵列、圆形阵列、直条纹、环状条纹或网状条纹。
上述方案中,所述微图案中每个图案单元的当量直径尺寸为20μm~0.5mm。本发明所表述的“当量直径”是指每个图案单元的横截面积等同于圆形的面积所对应直径。
上述制备方法制备得到的具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶。
本发明的有益效果:(1)本发明所述制备方法首次构建出具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶,并且解决了海藻酸钙成型过快难于控制交联速度和交联程度的难题,获得了小尺寸的三维微图案海藻酸钙水凝胶,所述海藻酸钙水凝胶的三维微图案中每个图案单元的当量直径尺寸小于100μm;(2)本发明所述制备方法操作简单,易加工成型,微图案结构稳定性好,具有可控的机械强度和韧性;(2)本发明制备的具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶,具有良好的生物活性和生物相容性,具有精细的三维微图案,可以使细胞高效的限定在三维微图案里,可以调控细胞的形态、分布和排列,使细胞形成可控的点阵或网状结构,从而模拟细胞在机体内的生存环境,可用于细胞与组织再生培养的研究。
附图说明
图1为本发明所设计的微图案掩膜板。
图2为本发明所述具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶实物图。
图3为本发明所述具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶的显微照片。
图4为本发明所述具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶的扫描电镜图。
图5为在本发明所述具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶上培养细胞的显微图片。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面结合实施例进一步阐明本发明的内容,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
一种具有三角形点阵状陷阱三维微图案海藻酸钙水凝胶,通过如下方法制备得到:
(1)用设计好的掩膜版,通过微图案负光刻法,制备出边长30μm、间距50μm、深度50μm的三角形凹槽阵列一级光刻胶微图案模板,在其表面浇筑PDMS胶预聚物,60℃烘箱中交联固化12小时后,剥离揭膜,得到二级PDMS胶微图案模板,微图案朝上置于直径3cm的培养皿中;
(2)配制浓度20mg/mL海藻酸钠水溶液20mL,向其中加入0.1g的羟基磷灰石粉末,搅拌10min至分散均匀,得到海藻酸钠与羟基磷灰石粉末的混合体系;
(3)取步骤(2)所得混合体系5mL浇筑在步骤(1)所述置于培养皿中的PDMS胶微图案模板上,使混合体系在PDMS胶表面形成均匀的薄层;再将培养皿放在滴加有醋酸溶液的大培养皿中,放进37℃烘箱里反应交联12小时;
(4)待交联反应结束后,揭除PDMS胶模板,并数次置于水中浸泡去除残余杂质,即得到具有三角形阵列三维微图案的海藻酸钙水凝胶,其中每个三角形图案单元的边长为30μm(当量直径约为22.5μm)。所述具有点阵状三维微图案的海藻酸钙水凝胶的显微照片图如图3中(a)所示。
实施例2
一种具有直条纹状三维微图案海藻酸钙水凝胶,通过如下方法制备得到:
(1)用设计好的掩膜版,通过微图案负光刻法,制备出宽度50μm、间距50μm、深度50μm的条纹状凹槽一级光刻胶微图案模板,在其表面浇筑PDMS胶预聚物,60℃烘箱中交联固化12小时后,剥离揭膜,得到二级PDMS胶微图案模板,微图案朝上置于直径3cm的培养皿中;
(2)配制浓度10mg/mL海藻酸钠水溶液20mL,其中加入0.06g磷酸钙粉末,搅拌10min至分散均匀,得到海藻酸钠与磷酸钙粉末的混合体系;
(3)取步骤(2)所得混合体系5mL浇筑在步骤(1)所述置于培养皿中的PDMS胶微图案模板上,使混合体系在PDMS胶表面形成均匀的薄层;再将培养皿放在滴加有盐酸溶液 的大培养皿中,放进37℃烘箱里反应交联6小时;
(4)待交联反应结束后,揭除PDMS胶模板,并数次置于水中浸泡去除残余杂质,即得到具有直条纹状沟槽三维微图案的海藻酸钙水凝胶,其中每个直条纹图案单元的宽度(当量直径)为50μm。所述具有直条纹状沟槽三维微图案的海藻酸钙水凝胶的显微照片图如图3中(b)所示。
实施例3
一种具有网状条纹三维微图案结构的海藻酸钙水凝胶,通过如下方法制备:
(1)用设计好的掩膜版,通过微图案负光刻法,制备出宽度50μm、间距200μm、深度50μm的网状条纹凹槽一级光刻胶微图案模板,在其表面浇筑PDMS胶预聚物,60℃烘箱中交联固化12小时后,剥离揭膜,得到二级PDMS胶微图案模板,微图案朝上置于直径3cm的培养皿中;
(2)配制浓度10mg/mL海藻酸钠水溶液20mL,其中加入0.05g碳酸钙粉末,搅拌10min至分散均匀,得到海藻酸钠与磷酸钙粉末的混合体系;
(3)取步骤(2)所得混合体系5mL浇筑在步骤(1)所述置于培养皿中的PDMS胶微图案模板上,使混合体系在PDMS胶表面形成均匀的薄层;在将培养皿放进37℃的二氧化碳培养箱中反应交联6小时;
(4)待交联反应结束后,揭除PDMS胶模板,并数次置于水中浸泡去除残余杂质,即得到具有网状条纹三维微图案的海藻酸钙水凝胶,其中每个网状条纹凹槽图案单元的宽度(当量直径)为50μm。所述具有网状条纹三维微图案的海藻酸钙水凝胶的显微照片图如图3中(c)所示。
实施例4
一种具有环状条纹三维微图案结构的海藻酸钙水凝胶,通过如下方法制备:
(1)用设计好的掩膜版,通过微图案负光刻法,制备出宽度50μm、间距50μm、深度50μm的环状条纹凹槽一级光刻胶微图案模板,在其表面浇筑PDMS胶预聚物,60℃烘箱中交联固化12小时后,剥离揭膜,得到二级PDMS胶微图案模板,微图案朝上置于直径3cm 的培养皿中;
(2)将5mg/mL的海藻酸钠溶液浇筑在步骤(1)所述置于培养皿内的PDMS胶微图案模板上,盖上透析膜,除去中间气泡、密封后,置于0.1mol/L的氯化钙溶液中,钙离子缓慢透过透析膜进入到培养皿中,海藻酸钠与钙离子充分反应交联12小时后,形成海藻酸钙水凝胶;
(3)待交联反应结束后,揭除PDMS胶模板,并数次置于水中浸泡去除残余杂质,即得到具有环状条纹三维微图案的海藻酸钙水凝胶,其中每个环状条纹凹槽图案的宽度(当量直径)为50μm。所述具有环状条纹三维微图案的海藻酸钙水凝胶的显微照片图如图3中(d)所示。
本发明还进一步研究了海藻酸钠、钙盐粉末的用量对海藻酸钙水凝胶弹性模量的影响,三维微图案结构的海藻酸钙水凝胶的制备方法大体同实施例1,不同之处在于:海藻酸钠水溶液的用量为12mL,钙盐粉末为碳酸钙,海藻酸钠水溶液浓度、碳酸钙的用量以及海藻酸钙水凝胶的弹性模量见下表1。表1说明了:用本发明制备得到的海藻酸钙水凝胶有不同的弹性模量,具有可控的机械强度和韧性,可以更好的调控细胞的生长。
表1海藻酸钙水凝胶的弹性模量
海藻酸钠水溶液浓度(mg/mL) | 5 | 10 | 20 | 30 |
碳酸钙质量(g) | 0.015 | 0.03 | 0.06 | 0.09 |
弹性模量(MPa) | 0.0276 | 0.096 | 0.12 | 0.125 |
将本发明制备得到的具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶用于细胞培养研究,在所述具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶上培养细胞,显微图片结果如图5所示,从图5可知:细胞限定在小于100μm尺寸的三维微图案里稳定生长。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例,而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)通过负光刻胶光刻在硅片上制备微图案,通过PDMS胶倒模固化后,揭模,将PDMS胶置于培养皿中,作为PDMS胶微图案模板;
(2)配制海藻酸钠溶液,向海藻酸钠溶液中加入钙盐粉末,进行超声或搅拌直至钙盐粉末在海藻酸钠溶液中分散均匀,得到海藻酸钠与钙盐粉末的混合体系,将所得海藻酸钠与钙盐粉末的混合体系浇筑在步骤(1)所述置于培养皿中的PDMS胶微图案模板上,使海藻酸钠与钙盐粉末的混合体系在PDMS胶微图案模板表面形成均匀的薄层;随后将培养皿置于酸性气体环境中熏蒸,使钙盐粉末缓慢释放出钙离子,钙离子与海藻酸钠充分反应交联形成海藻酸钙水凝胶;
或者,将海藻酸钠溶液浇筑在步骤(1)所述置于培养皿中的PDMS胶微图案模板上,再用透析膜将培养皿密封后置于钙离子溶液中,钙离子透过透析膜与海藻酸钠充分反应交联形成海藻酸钙水凝胶;
(3)将步骤(2)所得海藻酸钙水凝胶取出,揭除PDMS胶微图案模板,置于水中浸泡去除残余杂质后,得到具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述钙盐粉末为碳酸钙、硫酸钙、磷酸钙和羟基磷灰石中的一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述钙盐粉末和海藻酸钠的摩尔比是1:2~2:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述海藻酸钠溶液的质量浓度为0.5wt%~5wt%。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述酸性气体环境为二氧化碳气体环境、二氧化氮气体环境、由醋酸熏蒸产生的气体环境、或盐酸熏蒸产生的气体环境。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在酸性气体环境下,钙离子与海藻酸钠反应交联的时间为6小时以上。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述钙离子溶液为氯化钙溶液、硝酸钙溶液、碳酸氢钙溶液、硫酸氢钙溶液和氢氧化钙溶液中的一种,所述钙离子溶液中钙离子的浓度为0.1~5 mol/L。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述钙离子透过透析膜与海藻酸钠反应交联的时间为12小时以上。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述微图案中每个图案单元的当量直径尺寸为20μm~0.5mm。
10.权利要求1~9任一所述制备方法制备得到的具有三维微图案的海藻酸钙水凝胶。
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