CN105294955A - 一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶及其制备方法。所述光固化水凝胶以具有光固化性能的改性高分子材料为原料制备而成，以直条纹状、网状或环状条纹的微图案结构分割为多个不同区域，同一区域内的光固化水凝胶硬度相同，不同区域之间光固化水凝胶的硬度相同或不同，整个光固化水凝胶至少有两种硬度。本发明一方面通过控制紫外照射固化程度，使得光固化水凝胶各区域的弹性模量不同，另一方面弹性模量不同的各区域在光固化水凝胶上呈现出微图案结构，将弹性模量与微图案结构相结合，可以实现细胞在光固化水凝胶上有选择性地粘附、增殖与分化，从而达到可控的细胞分选或细胞选区分化。

Description

一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶及其制备方法。

背景技术

细胞分选是指在复杂环境中，将不同种属来源、不同组织类别的细胞实现筛选和区分的方法。而干细胞选区分化是指通过外界因素的条件作用下，使干细胞在不同区域实现不同水平和不同方向的分化。通过对基底材料的设计可以实现体外细胞分选与选区分化，即可以模拟体内复杂环境，使共培养的细胞按照设计分别在特定区域生长，或使干细胞在设定区域分别分化成各种群，从而在体外仿生形成复杂的多细胞的组织结构。进一步地，通过该基底材料的体内植入，募集机体干细胞的选择性地粘附并诱导其分化行使某特定功能，是一个极具科学意义和临床应用的途径。

研究表明，为了达到细胞的选择性区域粘附、迁移和生长，或促使干细胞分化程度的不同，目前研究集中在通过基底表面的拓扑结构差异设计。例如，在阵列型排列的纳米孔表面，细胞更趋近于向稀疏的纳米孔表面粘附、迁移和增殖；而密集且坚硬的岛状微纳结构表面，则更有利于间充质干细胞向成骨方向分化或促进成骨细胞的生长。然而，上述这种基底表面拓扑结构的研究，更多集中于细胞学的基础研究层面上，尚无法大规模在临床医学上获得广泛应用。

此外，最新研究报告表明，基质弹性模量(stiffness)也可影响细胞的粘附、生长和分化能力。例如，在弹性模量较低的基底表面更有益于神经细胞的粘附、生长；相反，成骨细胞在弹性模量较高的基底表面更易生存。再例如，在无诱导培养基的环境下，根据弹性模量的不同，基底硬度由低到高会促使间充质干细胞分别向神经细胞、肌细胞、成纤维细胞、成骨细胞分化。

因此，通过设计并调节基底材料的弹性模量，即可实现细胞在其上有选择性地粘附、增殖与分化，从而达到可控的细胞分选或细胞选区分化。而目前的技术仅局限于对基底表面拓扑结构的限定区域设计，基底材料非连续性的硬度调控，或者采用微图案中特异性的生长因子的介入，而很少涉及直接在单一基底表面实现不同区域硬度的调控。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶及其制备方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶，其特征在于，以具有光固化性能的改性高分子材料为原料制备而成，所述光固化水凝胶以直条纹状、网状或环状条纹的方式分割为多个不同区域，同一区域内的光固化水凝胶硬度相同，不同区域之间光固化水凝胶的硬度相同或不同，整个光固化水凝胶至少有两种硬度。

上述方案中，所述光固化水凝胶只有两种硬度或光固化水凝胶上各区域的硬度呈梯度变化；当所述光固化水凝胶以直条纹状或环状条纹的微图案结构分割为多个不同区域时，所述整个光固化水凝胶只有两种硬度的情况是：相邻两区域硬度不同、相间隔区域硬度相同；当光固化水凝胶以网状的微图案结构分割为多个不同区域时，所述整个光固化水凝胶只有两种硬度的情况是：水平方向上相邻两区域硬度不同、相间隔区域硬度相同；竖直方向上相邻两区域硬度不同、相间隔区域硬度相同。

一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)高分子改性：将高分子与过量光交联剂和催化剂共混使之进行化学反应，反应结束后，对反应物进行提纯，除去残留的光交联剂和催化剂，得到纯化的改性高分子，冻干备用；

(2)微图案掩膜板的制备：按照直条纹状、网状或环状条纹的微图案结构将掩膜板划分为多个不同区域，在掩膜板部分区域上粘贴遮光材料，同一区域内掩膜板的透光度相同，不同区域之间掩膜板的透光度相同或不同，整个掩膜板至少有两种透光度；

(3)将步骤(1)得到的改性高分子配置成改性高分子溶液，加入水溶性的光引发剂，混合均匀后，浇注、平铺在惰性基底表面，在惰性基底表面的高分子溶液上方近距离地平行搁置微图案掩膜板，对改性高分子溶液进行紫外照射固化，紫外光透过微图案掩膜板照射在惰性基底表面上，使惰性基底表面上的改性高分子固化交联，随后移去微图案掩膜板，继续紫外照射进一步固化，直至惰性基底表面形成稳定的水凝胶；

(4)脱除惰性基底，将紫外照射固化后的水凝胶浸没于中性缓冲溶液体系中，除去杂质，得到各区域的硬度分布呈现一定的微图案结构的水凝胶。

上述方案中，步骤(1)所述高分子为可溶性丝状蛋白和/或多糖，所述可溶性丝状蛋白为胶原蛋白、纤连蛋白、丝素和明胶中的一种或几种；所述多糖为透明质酸、硫酸角质素、硫酸软骨素、壳聚糖、海藻酸钠、纤维素和氨基聚糖中的一种或几种。

上述方案，步骤(1)所述光交联剂为甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，甲基丙烯酰氯、甲基丙烯酸异氰基乙酯、甲基丙烯酸N-羟琥珀酸亚胺酯等能提供双键和锚定基团的双功能团分子中的任意一种或几种，其中优选为甲基丙烯酸缩水甘油酯，步骤(1)所述催化剂为三乙胺、三丙胺或三甲胺。

上述方案中，步骤(1)所述提纯为透析或用20倍以上体积的丙酮溶液沉淀离心清洗。

上述方案中，所述掩膜板只有两种透光度或掩膜板上各区域的透光度呈梯度变化；当所述掩膜板以直条纹状或环状条纹的微图案结构分割为多个不同区域时，所述掩膜板只有两种透光度的情况是：相邻两区域透光度不同、相间隔区域透光度相同；当掩膜板以网状的微图案结构分割为多个不同区域时，所述掩膜板只有两种硬度的情况是：水平方向上相邻两区域透光度不同、相间隔区域透光度相同；竖直方向上相邻两区域透光度不同、相间隔区域透光度相同。

上述方案中，步骤(3)所述光引发剂为Irgacure2959、Irgacure784、Irgacure651、Irgacure1173、Irgacure819或二苯基乙二酮。

上述方案中，所述光固化水凝胶的厚度为1-10mm，所述紫外照射的紫外光波长为365nm，功率为1-50W，所述紫外光透过微图案掩膜板照射在惰性基底表面上使改性高分子固化交联的时间为5-30min，所述移去微图案掩膜板继续紫外照射进一步固化的时间为5-30min。

上述方案中，步骤(3)中除了向改性高分子溶液中加入水溶性的光引发剂之外，还加入了丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸聚乙二醇酯或甲基丙烯酸聚乙二醇酯。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明所述水凝胶的结构骨架(backbone)均为天然高分子，与细胞或体内待修复组织有良好的亲和能力，所需原料简单易得，成本较低，天然无毒性，并且具有良好的可成型性、可降解能力和可控的机械性能；

(2)本发明通过接枝光交联剂改性高分子，通过控制接枝率，以及交联体系的高分子的浓度可以调节水凝胶的固化程度和弹性模量；

(3)本发明通过调控微图案掩膜板各区域的透光度，依靠掩膜板的选择性遮盖，可以控制透过掩膜板照射在光固化水凝胶表面的紫外光强度，从而调节不同图案区域水凝胶的固化程度与机械强度；

(4)本发明制备得到的光固化水凝胶具有稳定的结构和弹性模量；同时，掩膜板透光度的分布设计为微图案结构，制备得到的光固化水凝胶的不同区域的硬度分布也呈现微图案结构，进而影响细胞行为，在无诱导因子的条件下，可应用于体外模拟血管、神经或骨小梁等组织器官中细胞生长的微环境；

(5)本发明一方面通过控制紫外照射固化程度，使得光固化水凝胶各区域的硬度不同(即弹性模量不同)，另一方面硬度不同的各区域在光固化水凝胶上呈现出微图案结构(直条纹状、网状或环状条纹)，将弹性模量与微图案结构相结合，在两者的协同作用下，可以较好地实现细胞在光固化水凝胶上有选择性地粘附、增殖与分化，从而达到可控的细胞分选或细胞选区分化。

附图说明

图1为接上GMA的胶原的FTIR图。

图2为在本发明微图案掩膜板设计的微图案结构，从左到右依次为直条纹状微图案结构、直条纹状微图案结构、网状微图案结构、网状微图案结构和环状条纹微图案结构。

图3为本发明制备得到的光固化水凝胶。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶，通过如下方法制备得到：

(1)高分子改性：将1g胶原蛋白以5mg/ml浓度溶解于0.5M的乙酸溶液中，加入溶有10mlTEA和10mlGMA的丙酮溶液50ml，在37℃环境中磁力搅拌3天；然后将混合溶液加入透析袋中，置于超纯水的外环境中，每隔6小时换超纯水一次，以充分除去残余有机溶剂和杂质离子，透析2天后将透析纯化的产物冻干，于冰箱-20℃保存待用；

(2)微图案掩膜板的制备：掩膜板上有宽度为50μm、间距50μm的直条纹形状的透光区域，其余区域为黑色不透光区域；

(3)将步骤(1)得到的改性胶原蛋白以10mg/ml的浓度溶解于0.5M的乙酸溶液中，加入1wt％的Irgacure2959，充分混合均匀，浇注、平铺在塑料皿底表面上(约2mm高度)，在距离塑料皿底表面的液面约2mm左右高度位置平行搁置微图案掩膜板，使用功率10W的紫外灯以垂直于塑料皿底表面方向照射10分钟，紫外光透过微图案掩膜板照射在改性胶原溶液上，使塑料皿上的改性胶原溶液固化交联，随后移去微图案掩膜板，继续紫外照射5分钟进一步固化，得到整体固化的胶原蛋白水凝胶；

(4)脱除塑料皿底，将紫外照射固化后的胶原蛋白水凝胶浸没于PBS缓冲溶液体系中(更换3次，每次1小时)，除去杂质的同时使胶原蛋白在中性环境中形成纤维，得到各区域的硬度分布呈现直条纹交替排列的光固化胶原水凝胶。

本实施例制备得到的光固化水凝胶各区域的弹性模量(即硬度)呈直条纹状交替排列，可以使共培养的上皮细胞和平滑肌细胞交替呈条纹状排列生长，从而在体外模拟血管组织。

实施例2

一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶，通过如下方法制备得到：

(1)高分子改性：将1g胶原蛋白以5mg/ml浓度溶解于0.5M的乙酸溶液中，加入溶有30mlTEA和30mlGMA的丙酮溶液150ml，在37℃环境中磁力搅拌3天；然后将混合溶液加入透析袋中，置于超纯水的外环境中，每隔6小时换超纯水一次，以充分除去残余有机溶剂和杂质离子，透析2天后将透析纯化的产物冻干，于冰箱-20℃保存待用；

(2)微图案掩膜板的制备：掩膜板上有边长为200μm、间距50μm的正方形阵列透光区域，其余区域为黑色不透光区域；

(3)将步骤(1)得到的改性胶原蛋白以60mg/ml的浓度溶解于水中，加入溶有0.5gIrgacure2959的丙酮溶液1ml，充分混合均匀，浇注、平铺在塑料皿底表面上(约2mm高度)，在距离塑料皿底表面的液面约2mm左右高度位置平行搁置微图案掩膜板，使用功率10W的紫外灯以垂直于塑料皿底表面方向照射10分钟，紫外光透过微图案掩膜板照射在改性胶原溶液上，使塑料皿上的改性胶原溶液固化交联，随后移去微图案掩膜板，继续紫外照射5分钟进一步固化，得到整体固化的胶原蛋白水凝胶；

(4)脱除塑料皿底，将紫外照射固化后的胶原蛋白水凝胶浸没于含有0.5％戊二醛的PBS缓冲溶液体系中再次交联明胶蛋白水凝胶30分钟后，使用PBS缓冲溶液浸泡清洗(更换3次，每次1小时)，除去杂质，得到阵列正方形与周围网状区域的硬度不同的光固化水凝胶。

实施例3

一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶，通过如下方法制备得到：

(1)高分子改性：将1g透明质酸以10mg/ml浓度溶解于PBS缓冲溶液中，加入溶有30mlTEA和30ml甲基丙烯酸异氰基乙酯的丙酮溶液150ml，在37℃环境中磁力搅拌5天；然后将混合溶液加入到5倍体积的丙酮中沉淀后，用PBS溶解，重复该步骤3次以充分除去残余有机溶剂和杂质离子，将纯化的产物冻干，于冰箱-20℃保存待用；

(2)微图案掩膜板的制备：掩膜板上有边长为30μm、间距50μm的小正方形阵列透光区域，其余区域为黑色不透光区域；

(3)将步骤(1)得到的改性透明质酸以50mg/ml的浓度溶解于水中，加入溶有0.5gIrgacure2959的丙酮溶液1ml，，充分混合均匀，浇注、平铺在塑料皿底表面上(约2mm高度)，在距离塑料皿底表面的液面约2mm左右高度位置平行搁置微图案掩膜板，使用功率10W的紫外灯以垂直于塑料皿底表面方向照射10分钟，紫外光透过微图案掩膜板照射在改性胶原溶液上，使塑料皿上的改性透明质酸溶液固化交联，随后移去微图案掩膜板，继续紫外照射5分钟进一步固化，得到整体固化的透明质酸水凝胶；

(4)脱除塑料皿底，将紫外照射固化后的透明质酸水凝胶浸没于PBS缓冲溶液体系中(更换3次，每次1小时)，除去杂质，得到阵列正方形与周围网状区域的硬度不同的光固化水凝胶。

实施例4

一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶，通过如下方法制备得到：

(1)高分子改性：将1g壳聚糖以5mg/ml浓度溶解于0.5M的乙酸溶液中，加入溶有30mlTEA和30ml甲基丙烯酸N-羟琥珀酸亚胺酯的丙酮溶液150ml，在37℃环境中磁力搅拌3天；然后将混合溶液加入透析袋中，置于超纯水的外环境中，每隔6小时换超纯水一次，以充分除去残余有机溶剂和杂质离子，透析2天后将透析纯化的产物冻干，于冰箱-20℃保存待用；

(2)微图案掩膜板的制备：掩膜板上有长200μm、宽20μm，间距50μm的长条形阵列透光区域，其余区域为黑色不透光区域；

(3)将步骤(1)得到的改性壳聚糖以50mg/ml的浓度溶解于水中，加入溶有0.5gIrgacure2959的丙酮溶液1ml，，充分混合均匀，浇注、平铺在塑料皿底表面上(约2mm高度)，在距离塑料皿底表面的液面约2mm左右高度位置平行搁置微图案掩膜板，使用功率10W的紫外灯以垂直于塑料皿底表面方向照射8分钟，紫外光透过微图案掩膜板照射在改性壳聚糖溶液上，使塑料皿上的改性胶原溶液固化交联，随后移去微图案掩膜板，继续紫外照射5分钟进一步固化，得到整体固化的壳聚糖水凝胶；

(4)脱除塑料皿底，将紫外照射固化后的改性壳聚糖水凝胶浸没于PBS缓冲溶液体系中(更换3次，每次1小时)，除去杂质，得到阵列长条形区域与其他区域的硬度不同的光固化水凝胶。

实施例5

一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶，通过如下方法制备得到：

(1)高分子改性：将1g硫酸软骨素以3mg/ml浓度溶解于0.5M的乙酸溶液中，加入溶有30mlTEA和30ml甲基丙烯酰氯的丙酮溶液150ml，在37℃环境中磁力搅拌3天；然后将混合溶液加入到5倍体积的丙酮中沉淀后，用PBS溶解，重复该步骤3次以充分除去残余有机溶剂和杂质离子，将纯化的产物冻干，于冰箱-20℃保存待用；

(2)微图案掩膜板的制备：掩膜板上有边长为50μm、间距50μm的正方形阵列透光区域，其余区域为黑色不透光区域；

(3)将步骤(1)得到的改性硫酸软骨素以30mg/ml的浓度溶解于水中，加入溶有0.5gIrgacure2959的丙酮溶液1ml，充分混合均匀，浇注、平铺在塑料皿底表面上(约2mm高度)，在距离塑料皿底表面的液面约2mm左右高度位置平行搁置微图案掩膜板，使用功率10W的紫外灯以垂直于塑料皿底表面方向照射5分钟，紫外光透过微图案掩膜板照射在改性胶原溶液上，使塑料皿上的改性硫酸软骨素溶液固化交联，随后移去微图案掩膜板，继续紫外照射5分钟进一步固化，得到整体固化的硫酸软骨素水凝胶，

(4)脱除塑料皿底，将紫外照射固化后的硫酸软水凝胶浸没于PBS缓冲溶液体系中(更换3次，每次1小时)，除去杂质，得到阵列长条形区域与周围网状区域的硬度不同的光固化水凝胶。

本实施例制备得到的光固化水凝胶各区域的弹性模量(即硬度)呈网状分布(阵列长条形区域与周围网状区域的硬度不同)，可以应用于干细胞的软骨分化。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶，其特征在于，以具有光固化性能的改性高分子材料为原料制备而成，所述光固化水凝胶以直条纹状、网状或环状条纹的微图案结构分割为多个不同区域，同一区域内的光固化水凝胶硬度相同，不同区域之间光固化水凝胶的硬度相同或不同，整个光固化水凝胶至少有两种硬度。

2.根据权利要求1所述的光固化水凝胶，其特征在于，所述光固化水凝胶只有两种硬度或光固化水凝胶上各区域的硬度呈梯度变化；当所述光固化水凝胶以直条纹状或环状条纹的微图案结构分割为多个不同区域时，所述整个光固化水凝胶只有两种硬度的情况是：相邻两区域硬度不同、相间隔区域硬度相同；当光固化水凝胶以网状的微图案结构分割为多个不同区域时，所述整个光固化水凝胶只有两种硬度的情况是：水平方向上相邻两区域硬度不同、相间隔区域硬度相同；竖直方向上相邻两区域硬度不同、相间隔区域硬度相同。

3.权利要求1~2任一所述的用于多细胞分选和干细胞选区分化的光固化水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）高分子改性：将高分子与过量光交联剂和催化剂共混使之进行化学反应，反应结束后，对反应物进行提纯，除去残留的光交联剂和催化剂，得到纯化的改性高分子，冻干备用；

（2）微图案掩膜板的制备：按照直条纹状、网状或环状条纹的微图案结构将掩膜板划分为多个不同区域，在掩膜板部分区域上粘贴遮光材料，同一区域内掩膜板的透光度相同，不同区域之间掩膜板的透光度相同或不同，整个掩膜板至少有两种透光度；

（3）将步骤（1）得到的改性高分子配置成改性高分子溶液，加入水溶性的光引发剂，混合均匀后，浇注、平铺在惰性基底表面，在惰性基底表面的高分子溶液上方近距离地平行搁置微图案掩膜板，对高分子溶液进行紫外照射固化，紫外光透过微图案掩膜板照射在惰性基底表面上，使惰性基底表面上的改性高分子固化交联，随后移去微图案掩膜板，继续紫外照射进一步固化，直至形成稳定固化的水凝胶；

（4）脱除惰性基底，将紫外照射固化后的水凝胶浸没于中性缓冲溶液体系中，除去杂质，得到各区域的硬度分布呈现一定的微图案结构的光固化水凝胶。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述掩膜板只有两种透光度或掩膜板上各区域的透光度呈梯度变化；当所述掩膜板以直条纹状或环状条纹的微图案结构分割为多个不同区域时，所述掩膜板只有两种透光度的情况是：相邻两区域透光度不同、相间隔区域透光度相同；当掩膜板以网状的微图案结构分割为多个不同区域时，所述掩膜板只有两种硬度的情况是：水平方向上相邻两区域透光度不同、相间隔区域透光度相同；竖直方向上相邻两区域透光度不同、相间隔区域透光度相同。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述光固化水凝胶的厚度为1~10mm，所述紫外照射的紫外光波长为365nm，功率为1~50W，所述紫外光透过微图案掩膜板照射在惰性基底表面上使改性高分子固化交联的时间为5~30min，所述移去微图案掩膜板继续紫外照射进一步固化的时间为5~30min。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述高分子为可溶性丝状蛋白和/或多糖，所述可溶性丝状蛋白为胶原蛋白、纤连蛋白、丝素和明胶中的一种或几种，所述多糖为透明质酸、硫酸角质素、硫酸软骨素、壳聚糖、海藻酸钠、纤维素和氨基聚糖中的一种或几种。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述光交联剂为甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酰氯、甲基丙烯酸异氰基乙酯和甲基丙烯酸N-羟琥珀酸亚胺酯中的一种或几种。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂为三乙胺、三丙胺或三甲胺。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为Irgacure2959、Irgacure784、Irgacure651、Irgacure1173、Irgacure819或二苯基乙二酮。

10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中除了向改性高分子溶液中加入水溶性的光引发剂之外，还加入了丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸聚乙二醇酯或甲基丙烯酸聚乙二醇酯。