CN104027847A - 一种附带血管网流道的人工软组织体的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，先设计出带血管结构的软组织支架模型，将模型逐一等距分层，制造各层的光掩膜板；然后将细胞与胶原溶液混合均匀，注入光固化水凝胶和光引发剂，得到光固化复合溶液；将光固化复合溶液注射到工作台上，盖上光掩膜板，使用面曝光技术固化光固化复合溶液，然后层层固化累加，获得带血管结构的光固化水凝胶软组织支架；向支架的血管结构中种植血管内皮细胞，使血管内皮细胞附着在血管管道表面，在体外进行静态培养和动态培养，得到附带血管网流道的人工软组织体。本发明能够解决软组织大块缺损修复中大块组织工程软组织支架内细胞的存活问题，以及软组织支架血管网络制造和血管化的问题。

Description

一种附带血管网流道的人工软组织体的制造方法

技术领域

本发明人工软组织体制备领域，具体涉及一种附带血管网流道的人工软组织体的制造方法。

背景技术

软组织在机体中发挥非常重要的作用，而遗传、创伤、疾病和衰老等往往造成软组织的缺失或功能丧失，严重威胁人类健康。因此，功能性软组织的再生一直是再生医学领域面临的重要问题。组织工程的发展为软组织的损伤和功能缺失带来了新的治疗希望，它应用工程学和生物学原理，联合或单独使用生物材料、细胞和生长因子等，研究开发能够维持、修复甚至替代受损的软组织的组织工程替代物。

面向皮肤组织工程支架，皮肤的表皮层薄而坚韧，微结构用于呼吸与排汗，皮下真皮组织具有立体微观血管管道结构，用于输送营养，因此在制造皮肤组织工程支架时，要结合水凝胶与血管支架制造工艺；面向肌肉组织工程支架制造，考虑肌肉组织构造复杂，由大量相同极向的肌纤维细胞组成，其中密布血管和神经组织，在细胞之间存在少量致密结缔组织。高密度、高分化的肌细胞呈单轴向分布结构，有利于通过神经的支配对响应的刺激做出反应，完成肌肉组织的收缩和舒张运动，实现人体运动整体协调。实现肌肉组织运动功能，首先要在结构上实现细胞生长单轴定向，并且考虑细胞生长的营养和氧气供给问题。

而现有的软组织组织工程支架在制造水凝胶支架中存在修复体积小、支架血管化、细胞生长氧气和营养供给等方面的不足。

发明内容

本发明的目的在于提供一种附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，以解决现有技术在制造水凝胶支架中存在的修复体积小，及支架血管化、细胞生长氧气和营养供给等方面不足的问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，包括以下步骤：

1)利用CAD软件设计出带血管结构的软组织支架模型，将设计出的软组织支架模型逐一等距分层，分层后得到各层支架，然后分别制造出用于制造各层支架的各个光掩膜板；

2)将细胞与胶原溶液混合均匀，使细胞包埋在胶原小球中，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝胶，再加入光引发剂，得到混合有细胞的光固化复合溶液；

3)将配制的光固化复合溶液注射到工作台上的无菌操作区内，盖上光掩膜板，使用面曝光技术固化光固化复合溶液，然后层层固化累加，获得带血管结构的光固化水凝胶软组织支架；

4)向带血管结构的光固化水凝胶软组织支架的血管结构中种植血管内皮细胞，使血管内皮细胞附着在血管管道表面，在体外进行静态培养和动态培养，实现多细胞的共培养，得到附带血管网流道的人工软组织体。

所述步骤1)中根据生物体动脉血管网络结构及其氧气和营养的扩散效果来设计带血管结构的软组织支架模型，设计的带血管结构的软组织支架模型中氧气和营养的扩散距离为200μm，血管直径为800μm～1mm；软组织支架模型的分层厚度为800μm～1mm。

所述步骤1)中各个光掩膜板分别根据各层支架的结构设计加工，具体制造方法是：首先保持硅片表面的清洁和干燥，然后在硅片上涂胶，前烘蒸发掉胶中的有机溶剂，放入曝光机中曝光，后烘去除驻波效应，最后显影，把设计的掩膜图形制作到硅片上，形成光掩膜板。

所述步骤2)中的细胞为成肌细胞、骨髓间充质干细胞或卫星细胞，胶原溶液中的胶原为Ⅰ型胶原，混合液中细胞的混合密度为1×10⁵～1×10⁷个/ml，混合液中胶原的浓度为1mg/ml～5mg/ml，混合液的pH值为7.3～7.5。

所述步骤2)中的光固化水凝胶为聚乙二醇丙烯酸酯(PEGDA)或聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEG-dma)；光引发剂为2-羟基-4’-(2-羟乙基)-2-对羟基苯甲酸甲酯(I2959)、1-羟基苯基酮(I184)或2,2-二甲氧基-1,2-二苯基甲烷1-1(I651)；光固化复合溶液中光固化水凝胶的质量浓度为10％～30％，光引发剂的质量浓度为1％。(上述光引发剂购买自西格玛奥德里奇公司，括号内为相应的商品型号。)

所述步骤3)中采用面曝光技术固化光固化复合溶液时的激光功率为150mW～300mW，激光波长为355nm。

所述的层层固化累加是指：按照软组织支架模型中各层支架的顺序从下向上依次制造各层支架，先用最底层支架对应的光掩膜版固化制作最底层支架，然后在最底层支架上利用其上一层支架对应的光掩膜版，在最底层支架上直接固化制作其上一层支架，依次类推，直至完成整个带血管结构的光固化水凝胶软组织支架的制作。

所述步骤4)中种植血管内皮细胞时直接向血管结构内注射含血管内皮细胞的溶液，让血管内皮细胞贴附在血管结构表面，或着向血管结构内注射含有血管内皮细胞的动物血液。

所述步骤4)中静态培养是将种植血管内皮细胞的光固化水凝胶软组织支架浸没在培养液中，在细胞培养箱中培养1～3天，细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％；

动态培养是将种植血管内皮细胞的光固化水凝胶软组织支架放入带有培养液的常规动态培养系统中，将动态培养系统放置到细胞培养箱中培养3～7天，细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％；动态培养注射设置为：注射器运行分4～10个阶段进行，每阶段注射1～5ml培养液，每阶段的注射时间为5～60min。

当面向肌肉组织工程制备人工软组织体时，为满足光固化水凝胶软组织支架内细胞定向生长的要求，在体外培养过程中给予预定刺激，促进细胞沿单轴方向定向生长，所述的预定刺激包括电刺激、力刺激和或流体动力刺激。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明针对现有的软组织工程支架在制造水凝胶支架中存在修复体积小，及支架血管化、细胞生长氧气和营养供给等方面不足的问题，采用光固化水凝胶与胶原微球均匀复合的方式制造光固化水凝胶软组织支架，并在该支架中制造血管网络结构以制造大块的附带血管网流道的人工软组织体，用以解决大缺损软组织的修复问题。本发明在制造附带血管网流道的人工软组织体时综合考虑了胶原微球与细胞的复合工艺，胶原微球与光固化水凝胶的成型工艺，以及水凝胶血管网络结构制造问题。本发明在制造光固化水凝胶软组织支架时选择的材料为可光固化的材料，其在制造工艺上适用性强，针对所选择组织的不同，所要求的力学强度也不同，对光固化材料的选择性范围广泛。选择光掩模法制造光固化水凝胶软组织支架，其工艺方法能够达到一定的制造精度，满足支架的结构精度要求。本发明考虑到细胞的生存影响因素，用胶原作为细胞的载体，将细胞包裹在胶原中，解决了在细胞生长空间限制的问题，胶原不仅给细胞提供足够的粘附、爬行、生存空间，也为细胞的生存提供营养；然后与光固化水凝胶均匀混合，利用可光固化的水凝胶，通过光掩模法在支架内部制造出血管网络结构，在血管网络中种植血管内皮细胞，促进支架的血管化，血管结构通入培养液为细胞的生存提供营养和氧气，植入体内能够更好地与体内软组织血管网络结合，促进体内软组织的修复与再生。

附图说明

图1附带血管网的人工软组织体结构，其中(a)为三层的软组织支架结构，(b)为单层支架内血管结构。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附带血管网流道的人工软组织体的制造，是将包埋有细胞的胶原小球与光致水凝胶复合，经光固化成型为多孔立体结构，经体外细胞培养实现人工软组织体的功能化与血管化，该支架制造过程是：首先，根据软组织血管结构及其氧气和营养的扩散性原理，利用CAD设计软件仿生设计具有三维血管网的人工软组织结构并进行等距分层(如图1所示)；再根据人工软组织各个分层结构制造出光掩膜板，安装在曝光机上；配制胶原溶液并与肌细胞、干细胞等混合制成悬液，制备包埋细胞的胶原小球，再与光致水凝胶材料混合；将其与光引发剂混合获得的复合溶液注射到光掩膜板下工作台，然后进行面曝光，层层累加获得附带血管网流道的水凝胶支架。之后，向支架血管结构种植血管内皮细胞，使细胞附着在支架血管管道表面。经体外静态培养和动态培养多细胞共培养进行组织分化。根据不同软组织的需求，为实现人工软组织(如面向肌肉组织的组织工程支架)内细胞形态的定向性生长要求，在体外给予一定的刺激，实现细胞的定向生长，最终得到具有一定功能的人工软组织体。

实施例1

1)根据生物体动脉血管网络结构及其氧气和营养的扩散效果，利用CAD软件设计出带血管结构的软组织支架模型，将设计出的软组织支架模型逐一等距分层，分层后得到各层支架，然后分别制造出用于制造各层支架的各个光掩膜板；

其中设计的带血管结构的软组织支架模型中氧气和营养的扩散距离为200μm，考虑水凝胶的成型工艺，设计血管直径为800μm；模型分层厚度与水凝胶成型工艺有关和血管孔径大小有关，设计软组织支架模型的分层厚度为800μm；

各个光掩膜板分别根据各层支架的结构设计加工，具体制造方法是：首先保持硅片表面的清洁和干燥，然后在硅片上涂胶，前烘蒸发掉胶中的有机溶剂，放入曝光机中曝光，后烘去除驻波效应，最后显影，把设计的掩膜图形制作到硅片上，形成光掩膜板；

2)将细胞与胶原溶液混合均匀，使细胞包埋在胶原小球中，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝胶，再加入光引发剂，得到混合有细胞的光固化复合溶液；

其中细胞为成肌细胞，胶原溶液中的胶原为Ⅰ型胶原，混合液中细胞的混合密度为1×10⁵个/ml，混合液中胶原的浓度为1mg/ml，混合液呈中性，其pH值为7.3；光固化水凝胶为聚乙二醇丙烯酸酯(PEGDA)；光引发剂为2-羟基-4’-(2-羟乙基)-2-对羟基苯甲酸甲酯(I2959)(购买自西格玛奥德里奇公司)；光固化复合溶液中光固化水凝胶的质量浓度为10％，光引发剂的质量浓度为1％；

3)采用打印技术用注射泵将配制的光固化复合溶液注射到工作台上的无菌操作区内，注射的体积是根据设计的每层支架的体积决定，注射的体积由程序控制，注射后盖上光掩膜板，使用面曝光技术固化光固化复合溶液，然后层层固化累加，获得带血管结构的光固化水凝胶软组织支架；

其中采用面曝光技术固化光固化复合溶液时的激光功率为150mW，激光波长为355nm；

层层固化累加是指：按照软组织支架模型中各层支架的顺序从下向上依次制造各层支架，先用最底层支架对应的光掩膜版固化制作最底层支架，然后在最底层支架上利用其上一层支架对应的光掩膜版，在最底层支架上直接固化制作其上一层支架，依次类推，直至完成整个带血管结构的光固化水凝胶软组织支架的制作；

4)向带血管结构的光固化水凝胶软组织支架的血管结构中种植血管内皮细胞，使血管内皮细胞附着在血管管道表面，在体外进行静态培养和动态培养，实现多细胞的共培养，得到附带血管网流道的人工软组织体；

其中种植血管内皮细胞时直接向血管结构内注射含血管内皮细胞的溶液，让血管内皮细胞贴附在血管结构表面；

静态培养是将种植血管内皮细胞的光固化水凝胶软组织支架浸没在培养液中，在细胞培养箱中培养1天，细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％；

动态培养是将常规的动态系统连接起来(包括注射泵、注射器、三通阀、培养液、注射泵控制面板等)，将种植血管内皮细胞的光固化水凝胶软组织支架放入带有培养液的动态培养系统中，将动态培养系统(除注射泵控制面板外)放置到细胞培养箱中培养3天，细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％；动态培养注射设置为：选择注射器为20ml，注射器运行分4个阶段进行，每阶段注射1ml培养液，每阶段的注射时间为5min。

实施例2

1)根据生物体动脉血管网络结构及其氧气和营养的扩散效果，利用CAD软件设计出带血管结构的软组织支架模型，将设计出的软组织支架模型逐一等距分层，分层后得到各层支架，然后分别制造出用于制造各层支架的各个光掩膜板；

其中设计的带血管结构的软组织支架模型中氧气和营养的扩散距离为200μm，考虑水凝胶的成型工艺，设计血管直径为1mm；模型分层厚度与水凝胶成型工艺有关和血管孔径大小有关，设计软组织支架模型的分层厚度为1mm；

各个光掩膜板分别根据各层支架的结构设计加工，具体制造方法是：首先保持硅片表面的清洁和干燥，然后在硅片上涂胶，前烘蒸发掉胶中的有机溶剂，放入曝光机中曝光，后烘去除驻波效应，最后显影，把设计的掩膜图形制作到硅片上，形成光掩膜板；

2)将细胞与胶原溶液混合均匀，使细胞包埋在胶原小球中，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝胶，再加入光引发剂，得到混合有细胞的光固化复合溶液；

其中细胞为骨髓间充质干细胞，胶原溶液中的胶原为Ⅰ型胶原，混合液中细胞的混合密度为5×10⁶个/ml，混合液中胶原的浓度为3mg/ml，混合液呈中性，其pH值为7.4；光固化水凝胶为聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEG-dma)；光引发剂为1-羟基苯基酮(I184)(购买自西格玛奥德里奇公司)；光固化复合溶液中光固化水凝胶的质量浓度为25％，光引发剂的质量浓度为1％；

3)采用打印技术用注射泵将配制的光固化复合溶液注射到工作台上的无菌操作区内，注射的体积是根据设计的每层支架的体积决定，注射的体积由程序控制，注射后盖上光掩膜板，使用面曝光技术固化光固化复合溶液，然后层层固化累加，获得带血管结构的光固化水凝胶软组织支架；

其中采用面曝光技术固化光固化复合溶液时的激光功率为200mW，激光波长为355nm；

层层固化累加是指：按照软组织支架模型中各层支架的顺序从下向上依次制造各层支架，先用最底层支架对应的光掩膜版固化制作最底层支架，然后在最底层支架上利用其上一层支架对应的光掩膜版，在最底层支架上直接固化制作其上一层支架，依次类推，直至完成整个带血管结构的光固化水凝胶软组织支架的制作；

4)向带血管结构的光固化水凝胶软组织支架的血管结构中种植血管内皮细胞，使血管内皮细胞附着在血管管道表面，在体外进行静态培养和动态培养，实现多细胞的共培养，得到附带血管网流道的人工软组织体；

其中种植血管内皮细胞时直接向血管结构内注射含有血管内皮细胞的动物血液；

静态培养是将种植血管内皮细胞的光固化水凝胶软组织支架浸没在培养液中，在细胞培养箱中培养2天，细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％；

动态培养是将常规的动态系统连接起来(包括注射泵、注射器、三通阀、培养液、注射泵控制面板等)，将种植血管内皮细胞的光固化水凝胶软组织支架放入带有培养液的动态培养系统中，将动态培养系统(除注射泵控制面板外)放置到细胞培养箱中培养5天，细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％；动态培养注射设置为：选择注射器为20ml，注射器运行分6个阶段进行，每阶段注射3ml培养液，每阶段的注射时间为20min；

5)当面向肌肉组织工程制备人工软组织体时，为满足光固化水凝胶软组织支架内细胞定向生长的要求，在体外培养过程中给予预定刺激(电刺激和力刺激)，促进细胞沿单轴方向定向生长。

实施例3

1)根据生物体动脉血管网络结构及其氧气和营养的扩散效果，利用CAD软件设计出带血管结构的软组织支架模型，将设计出的软组织支架模型逐一等距分层，分层后得到各层支架，然后分别制造出用于制造各层支架的各个光掩膜板；

其中设计的带血管结构的软组织支架模型中氧气和营养的扩散距离为200μm，考虑水凝胶的成型工艺，设计血管直径为900μm；模型分层厚度与水凝胶成型工艺有关和血管孔径大小有关，设计软组织支架模型的分层厚度为900μm；

各个光掩膜板分别根据各层支架的结构设计加工，具体制造方法是：首先保持硅片表面的清洁和干燥，然后在硅片上涂胶，前烘蒸发掉胶中的有机溶剂，放入曝光机中曝光，后烘去除驻波效应，最后显影，把设计的掩膜图形制作到硅片上，形成光掩膜板；

2)将细胞与胶原溶液混合均匀，使细胞包埋在胶原小球中，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝胶，再加入光引发剂，得到混合有细胞的光固化复合溶液；

其中细胞为卫星细胞，胶原溶液中的胶原为Ⅰ型胶原，混合液中细胞的混合密度为1×10⁷个/ml，混合液中胶原的浓度为5mg/ml，混合液呈中性，其pH值为7.5；光固化水凝胶为聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEG-dma)；光引发剂为2,2-二甲氧基-1,2-二苯基甲烷1-1(I651)(购买自西格玛奥德里奇公司)；光固化复合溶液中光固化水凝胶的质量浓度为30％，光引发剂的质量浓度为1％；

3)采用打印技术用注射泵将配制的光固化复合溶液注射到工作台上的无菌操作区内，注射的体积是根据设计的每层支架的体积决定，注射的体积由程序控制，注射后盖上光掩膜板，使用面曝光技术固化光固化复合溶液，然后层层固化累加，获得带血管结构的光固化水凝胶软组织支架；

其中采用面曝光技术固化光固化复合溶液时的激光功率为300mW，激光波长为355nm；

层层固化累加是指：按照软组织支架模型中各层支架的顺序从下向上依次制造各层支架，先用最底层支架对应的光掩膜版固化制作最底层支架，然后在最底层支架上利用其上一层支架对应的光掩膜版，在最底层支架上直接固化制作其上一层支架，依次类推，直至完成整个带血管结构的光固化水凝胶软组织支架的制作；

4)向带血管结构的光固化水凝胶软组织支架的血管结构中种植血管内皮细胞，使血管内皮细胞附着在血管管道表面，在体外进行静态培养和动态培养，实现多细胞的共培养，得到附带血管网流道的人工软组织体；

其中种植血管内皮细胞时直接向血管结构内注射含血管内皮细胞的溶液，让血管内皮细胞贴附在血管结构表面；

静态培养是将种植血管内皮细胞的光固化水凝胶软组织支架浸没在培养液中，在细胞培养箱中培养3天，细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％；

动态培养是将常规的动态系统连接起来(包括注射泵、注射器、三通阀、培养液、注射泵控制面板等)，将种植血管内皮细胞的光固化水凝胶软组织支架放入带有培养液的动态培养系统中，将动态培养系统(除注射泵控制面板外)放置到细胞培养箱中培养7天，细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％；动态培养注射设置为：选择注射器为20ml，注射器运行分10个阶段进行，每阶段注射5ml培养液，每阶段的注射时间为60min；

5)当面向肌肉组织工程制备人工软组织体时，为满足光固化水凝胶软组织支架内细胞定向生长的要求，在体外培养过程中给予预定刺激(流体动力刺激)，促进细胞沿单轴方向定向生长。

实施例4

1)根据生物体动脉血管网络结构及其氧气和营养的扩散效果，利用CAD软件设计出带血管结构的软组织支架模型，将设计出的软组织支架模型逐一等距分层，分层后得到各层支架，然后分别制造出用于制造各层支架的各个光掩膜板；

其中设计的带血管结构的软组织支架模型中氧气和营养的扩散距离为200μm，考虑水凝胶的成型工艺，设计血管直径为850μm；模型分层厚度与水凝胶成型工艺有关和血管孔径大小有关，设计软组织支架模型的分层厚度为850μm；

各个光掩膜板分别根据各层支架的结构设计加工，具体制造方法是：首先保持硅片表面的清洁和干燥，然后在硅片上涂胶，前烘蒸发掉胶中的有机溶剂，放入曝光机中曝光，后烘去除驻波效应，最后显影，把设计的掩膜图形制作到硅片上，形成光掩膜板；

2)将细胞与胶原溶液混合均匀，使细胞包埋在胶原小球中，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝胶，再加入光引发剂，得到混合有细胞的光固化复合溶液；

其中细胞为骨髓间充质干细胞，胶原溶液中的胶原为Ⅰ型胶原，混合液中细胞的混合密度为1×10⁶个/ml，混合液中胶原的浓度为2mg/ml，混合液呈中性，其pH值为7.4；光固化水凝胶为聚乙二醇丙烯酸酯(PEGDA)；光引发剂为2-羟基-4’-(2-羟乙基)-2-对羟基苯甲酸甲酯(I2959)(购买自西格玛奥德里奇公司)；光固化复合溶液中光固化水凝胶的质量浓度为20％，光引发剂的质量浓度为1％；

3)采用打印技术用注射泵将配制的光固化复合溶液注射到工作台上的无菌操作区内，注射的体积是根据设计的每层支架的体积决定，注射的体积由程序控制，注射后盖上光掩膜板，使用面曝光技术固化光固化复合溶液，然后层层固化累加，获得带血管结构的光固化水凝胶软组织支架；

其中采用面曝光技术固化光固化复合溶液时的激光功率为250mW，激光波长为355nm；

层层固化累加是指：按照软组织支架模型中各层支架的顺序从下向上依次制造各层支架，先用最底层支架对应的光掩膜版固化制作最底层支架，然后在最底层支架上利用其上一层支架对应的光掩膜版，在最底层支架上直接固化制作其上一层支架，依次类推，直至完成整个带血管结构的光固化水凝胶软组织支架的制作；

4)向带血管结构的光固化水凝胶软组织支架的血管结构中种植血管内皮细胞，使血管内皮细胞附着在血管管道表面，在体外进行静态培养和动态培养，实现多细胞的共培养，得到附带血管网流道的人工软组织体；

其中种植血管内皮细胞时直接向血管结构内注射含血管内皮细胞的溶液，让血管内皮细胞贴附在血管结构表面；

静态培养是将种植血管内皮细胞的光固化水凝胶软组织支架浸没在培养液中，在细胞培养箱中培养1天，细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％；

动态培养是将常规的动态系统连接起来(包括注射泵、注射器、三通阀、培养液、注射泵控制面板等)，将种植血管内皮细胞的光固化水凝胶软组织支架放入带有培养液的动态培养系统中，将动态培养系统(除注射泵控制面板外)放置到细胞培养箱中培养4天，细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％；动态培养注射设置为：选择注射器为20ml，注射器运行分8个阶段进行，每阶段注射4ml培养液，每阶段的注射时间为40min。

实施例4制得的附带血管网流道的人工软组织体的弹性模量约为0.92MPa，其强度与面向的软组织强度有关。

本发明用包埋细胞的胶原小球与光固化水凝胶制造带有血管网络的大块组织工程软组织支架，胶原小球包埋细胞，是以胶原作为细胞的生长载体，为细胞提供粘附、爬行、生长的空间，同时为细胞的生存提供一定得营养和氧气，尽可能实现支架的功能化。利用光固化水凝胶快速成型和光掩模技术制造附带血管网流道的人工软组织体，血管网络为内部细胞提供充分的氧气和营养，同时也是满足软组织自身的结构，并在移植时与体内血管网络更好的接合。因此本发明能够制造出活性及生物兼容性好的大块人工软组织体，解决现有的软组织工程支架在制造水凝胶支架中存在修复体积小，及支架血管化、细胞生长氧气和营养供给等方面不足的问题，并解决软组织大块缺损修复中大块组织工程软组织支架内细胞的存活问题，以及软组织支架血管网络制造和血管化的问题。

Claims (10)

1.一种附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)利用CAD软件设计出带血管结构的软组织支架模型，将设计出的软组织支架模型逐一等距分层，分层后得到各层支架，然后分别制造出用于制造各层支架的各个光掩膜板；

2)将细胞与胶原溶液混合均匀，使细胞包埋在胶原小球中，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝胶，再加入光引发剂，得到混合有细胞的光固化复合溶液；

3)将配制的光固化复合溶液注射到工作台上的无菌操作区内，盖上光掩膜板，使用面曝光技术固化光固化复合溶液，然后层层固化累加，获得带血管结构的光固化水凝胶软组织支架；

4)向带血管结构的光固化水凝胶软组织支架的血管结构中种植血管内皮细胞，使血管内皮细胞附着在血管管道表面，在体外进行静态培养和动态培养，实现多细胞的共培养，得到附带血管网流道的人工软组织体。

2.根据权利要求1所述的附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，其特征在于：所述步骤1)中根据生物体动脉血管网络结构及其氧气和营养的扩散效果来设计带血管结构的软组织支架模型，设计的带血管结构的软组织支架模型中氧气和营养的扩散距离为200μm，血管直径为800μm～1mm；软组织支架模型的分层厚度为800μm～1mm。

3.根据权利要求1或2所述的附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，其特征在于：所述步骤1)中各个光掩膜板分别根据各层支架的结构设计加工，具体制造方法是：首先保持硅片表面的清洁和干燥，然后在硅片上涂胶，前烘蒸发掉胶中的有机溶剂，放入曝光机中曝光，后烘去除驻波效应，最后显影，把设计的掩膜图形制作到硅片上，形成光掩膜板。

4.根据权利要求1所述的附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，其特征在于：所述步骤2)中的细胞为成肌细胞、骨髓间充质干细胞或卫星细胞，胶原溶液中的胶原为Ⅰ型胶原，混合液中细胞的混合密度为1×10⁵～1×10⁷个/ml，混合液中胶原的浓度为1mg/ml～5mg/ml，混合液的pH值为7.3～7.5。

5.根据权利要求1或4所述的附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，其特征在于：所述步骤2)中的光固化水凝胶为聚乙二醇丙烯酸酯或聚乙二醇甲基丙烯酸酯；光引发剂为2-羟基-4’-(2-羟乙基)-2-对羟基苯甲酸甲酯、1-羟基苯基酮或2,2-二甲氧基-1,2-二苯基甲烷1-1；光固化复合溶液中光固化水凝胶的质量浓度为10％～30％，光引发剂的质量浓度为1％。

6.根据权利要求1所述的附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，其特征在于：所述步骤3)中采用面曝光技术固化光固化复合溶液时的激光功率为150mW～300mW，激光波长为355nm。

7.根据权利要求1或6所述的附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，其特征在于：所述的层层固化累加是指：按照软组织支架模型中各层支架的顺序从下向上依次制造各层支架，先用最底层支架对应的光掩膜版固化制作最底层支架，然后在最底层支架上利用其上一层支架对应的光掩膜版，在最底层支架上直接固化制作其上一层支架，依次类推，直至完成整个带血管结构的光固化水凝胶软组织支架的制作。

8.根据权利要求1所述的附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，其特征在于：所述步骤4)中种植血管内皮细胞时直接向血管结构内注射含血管内皮细胞的溶液，让血管内皮细胞贴附在血管结构表面，或着向血管结构内注射含有血管内皮细胞的动物血液。

9.根据权利要求1或8所述的附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，其特征在于：所述步骤4)中静态培养是将种植血管内皮细胞的光固化水凝胶软组织支架浸没在培养液中，在细胞培养箱中培养1～3天，细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％；

动态培养是将种植血管内皮细胞的光固化水凝胶软组织支架放入带有培养液的常规动态培养系统中，将动态培养系统放置到细胞培养箱中培养3～7天，细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％；动态培养注射设置为：注射器运行分4～10个阶段进行，每阶段注射1～5ml培养液，每阶段的注射时间为5～60min。

10.根据权利要求1、2、4、6或8所述的附带血管网流道的人工软组织体的制造方法，其特征在于：当面向肌肉组织工程制备人工软组织体时，为满足光固化水凝胶软组织支架内细胞定向生长的要求，在体外培养过程中给予预定刺激，促进细胞沿单轴方向定向生长，所述的预定刺激包括电刺激、力刺激和或流体动力刺激。