CN111467575B - 一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片及其制备方法和应用 - Google Patents

一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片及其制备方法和应用，补片由依次叠加的微针阵列层、集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞的平行排列的碳纳米管层及水凝胶支架层组成。通过将水凝胶前聚体溶液填充到模板孔隙中固化形成微针阵列层，随后沉积平行排列的碳纳米管层，最后再次灌注水凝胶前聚体溶液并固化，剥离模板后得到导电微针补片，将其用于后续的诱导多能干细胞分化培养。本发明提供的补片制备方法简便，不受细胞来源限制，有望成为心肌梗塞治疗的有效治疗载体。

Description

一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，涉及一种补片材料，尤其涉及一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片及其制备方法和应用。
背景技术
心脏为人体循环系统提供源源不断的动力，通过血液输送为组织和器官供应氧气、营养物质等，并且带走代谢废物，对于维持人类基本的生命活动具有重要意义。近年来，各种心血管疾病尤其是心肌梗塞的发病率持续增加，严重威胁到了人类的健康，已成为一个棘手的社会问题。因此，研发出能够重建梗死心肌组织功能的有效治疗方法，是目前生物医学领域亟待解决的问题之一。
目前，细胞疗法包括直接注射或利用细胞补片进行治疗，在抑制不良组织重塑、减少炎症反应、促进心肌再生方面具有很大的潜力。其中干细胞疗法，特别是与聚合物补片集成的干细胞，已经被广泛应用于心梗治疗，在恢复受损心脏功能方面具有明显的优势。然而，由于心脏生理环境复杂，直接将干细胞用于体内治疗在分化率和保留率方面存在很大的不确定性，从而增加了治疗的风险。此外,尽管胚胎干细胞(ESC)或间充质干细胞(MSC)集成的心脏补片能够提高细胞移植率,这种生物混合的补片通常附着力较差，功能单一，受限于细胞来源,并且无法控制细胞取向以模仿真正的心脏组织。因此，具有良好附着力、多功能、细胞来源广泛且能够诱导取向的细胞补片仍然有待开发。
在本发明中，我们设计并制备了一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞的导电微针补片，可用于心肌梗塞模型的治疗。
发明内容
本发明提供一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片及其制备方法和应用，以解决传统细胞补片附着力差、功能单一、细胞来源受限、无法控制细胞取向以及难以模拟真实心脏组织活性的缺点。
为实现上述目的，本发明提供一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片，具有这样的特征：由依次叠加的微针阵列层、集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞的平行排列的碳纳米管层及水凝胶支架层组成。
本发明还提供上述集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，具有这样的特征：包括以下步骤：步骤一、导电微针补片的制备：将水凝胶前聚体溶液，滴加在微针阵列模板上，通过真空或超声处理使水凝胶前聚体溶液渗透到所有的孔隙中，之后移除多余的水凝胶前聚体溶液并固化针尖结构，获得微针阵列层；随后在所得的含有微针阵列层的模板上覆盖若干层平行排列的碳纳米管，形成碳纳米管层；然后滴加水凝胶前聚体溶液二次聚合固化形成水凝胶支架层；最后移除微针阵列模板并通过洗涤得到导电微针补片；步骤二、基于导电微针补片的诱导多能干细胞分化培养：将已开始分化的诱导多能干细胞种植在步骤一所得的导电微针补片的微针阵列层的一侧，提供继续分化的条件，将诱导多能干细胞培养成具有自主搏动能力的心肌细胞，在碳纳米管层的诱导下心肌细胞进行取向排列，最终获得集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片。
进一步，本发明提供一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，水凝胶前聚体溶液为含有甲基丙烯酰化明胶和/或甲基丙烯酰化透明质酸的溶液、含有海藻酸盐的溶液或含有丝素蛋白的溶液。
进一步，本发明提供一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，水凝胶前聚体溶液为含有甲基丙烯酰化明胶和/或甲基丙烯酰化透明质酸的溶液时，针尖的固化方式为紫外光固化；水凝胶前聚体溶液为含有海藻酸盐的溶液时，针尖的固化方式为离子交联固化；水凝胶前聚体溶液为含有丝素蛋白的溶液，针尖的固化方式为热固化或利用有机溶剂进行交联固化。
进一步，本发明提供一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，形成微针阵列层和水凝胶支架层的水凝胶前聚体溶液可以为相同或不同的水凝胶前聚体溶液。
进一步，本发明提供一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，水凝胶前聚体溶液溶解有治疗性药物。
进一步，本发明提供一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二的具体过程为：将已经分化至第六天的诱导多能干细胞复苏并利用含有B27的RPMI-1640培养基进行重悬，将细胞悬液滴加到导电微针补片表面，置于37℃，5％CO2的培养箱中继续分化培养6～14天，得到集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片。
进一步，本发明提供一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，微针阵列层中，相邻微针针尖的距离为500-900μm，微针长度为300-800μm。
进一步，本发明提供一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，碳纳米管层中，碳纳米管的层数为2-4层。
本发明还提供上述集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片在制备治疗心肌梗塞微针补片中的应用。
本发明的有益效果在于：
一、本发明采用的细胞是通过体细胞重编程获得的诱导多能干细胞，来源广泛、具有全能性并且能够避免伦理问题。
二、本发明是将诱导多能干细胞分化成心肌细胞后再用于动物实验，从而确保了干细胞分化的方向性。
三、本发明设计的集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞的导电微针补片由于其微针微米级的锥形结构可以很好地附着在心脏上，并且可以缓慢释放出封装在微针阵列针尖的药物进行辅助治疗，功能性强。
四、本发明通过平行排列碳纳米管层的引入，诱导了心肌细胞在表面的定向生长，模拟了心脏本身的各向异性结构。碳纳米管出色的导电性还为细胞间的电信号传导提供了良好的平台，使分布在补片上的心肌细胞能够实现同步收缩。当集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞的导电微针补片用于心肌梗塞模型治疗时，碳纳米管的存在使得这些细胞能与体内心脏的收缩也能够保持一致。
附图说明
图1是导电微针补片的制备过程示意图；
图2是诱导多能干细胞在导电微针补片上被诱导成取向排列的心肌细胞的过程示意图；
图3a是实施例2针尖载有BSA-FITC的导电微针补片的荧光图；
图3b是实施例2导电微针补片的药物缓释曲线图；
图4是实施例2诱导多能干细胞在导电微针补片上被诱导成取向排列的心肌细胞的实物图；
图5是实施例2诱导多能干细胞在导电微针补片上被诱导成取向排列的心肌细胞收缩视频截图；
图6是实施例3心肌梗塞模型治疗效果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片，由依次叠加的微针阵列层、集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞的平行排列的碳纳米管层及水凝胶支架层组成。
该集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法包括以下步骤：
步骤一、甲基丙烯酰化透明质酸导电微针补片的制备。
配制含有1％(v/v)光引发剂(2-羟基-2-甲基苯丙酮)的甲基丙烯酰化透明质酸(5％，w/v)前聚体溶液，即水凝胶前聚体溶液，将该溶液滴加在PDMS的微针模板中，超声处理10min，去除所有的气泡使水凝胶前聚体溶液完全渗透所有的孔隙。移除模板中多余的溶液，在紫外光下照射1min固化针尖，获得微针阵列层。
将4层平行排列的碳纳米管层沉积到模板上，形成碳纳米管层。
然后再次滴加水凝胶前聚体溶液，在紫外光下照射1min二次固化，形成水凝胶支架层。
最后通过自然干燥或者酒精浸泡将所得的导电微针补片从模板上剥离，并用去离子水进行清洗。导电微针补片的制备过程如图1所示，其中a为水凝胶前聚体溶液填充模板1、形成针尖(即微针阵列层)2的示意图，b为在固化的微针针尖2上沉积碳纳米管层3的示意图，c为二次灌注水凝胶前聚体溶液、形成水凝胶支架层4的示意图，d为最终得到的集成有碳纳米管的导电微针补片。
步骤二、基于甲基丙烯酰化透明质酸导电微针补片的诱导多能干细胞分化培养。
将步骤一制备所得的导电微针补片进行紫外灭菌，将分化至第六天的诱导多能干细胞复苏并种植在补片的微针阵列层的一侧，放入37℃细胞培养箱(5％CO2)继续进行分化培养，隔天换液，利用倒置体式显微镜观察细胞的分化情况。培养6-14天后，诱导多能干细胞可以成功转化为心肌细胞并恢复自主搏动的能力。在平行排列碳纳米管的诱导下，分化得到的心肌细胞会沿着碳纳米管方向取向排列，并产生同步的收缩。诱导多能干细胞在导电微针补片上被诱导成取向排列的心肌细胞的过程如图2所示，其中a为集成有碳纳米管的导电微针补片的俯视示意图，b为诱导多能干细胞播种的集成有碳纳米管的导电微针补片的俯视示意图，c为诱导多能干细胞分化的心肌细胞在导电微针补片表面取向排列的示意图。
实施例2
本实施例提供一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片，由依次叠加的微针阵列层、集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞的平行排列的碳纳米管层及水凝胶支架层组成。
该集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法包括以下步骤：
步骤一、甲基丙烯酰化明胶导电微针补片的制备。
配制含有1％(v/v)光引发剂(2-羟基-2-甲基苯丙酮)的甲基丙烯酰化明胶(15％，w/v)前聚体溶液，并分别掺杂BSA-FITC至其终浓度为0.5mg/mL和1mg/mL，即制成溶解有治疗性药物的水凝胶前聚体溶液。在PDMS的微针模板中分别滴入配制的两个不同BSA-FITC浓度的水凝胶前聚体溶液，真空处理10min，去除所有的气泡使水凝胶前聚体溶液完全渗透所有的孔隙。移除模板中多余的溶液，在紫外光下照射30s固化针尖，获得微针阵列层。
将4层平行排列的碳纳米管层沉积到模板上，形成碳纳米管层。
然后滴加不含BSA-FITC的甲基丙烯酰化明胶水凝胶前聚体溶液，在紫外光下照射30s二次固化，形成水凝胶支架层。
最后通过自然干燥或者酒精浸泡将所得的导电微针补片从模板上剥离，并用去离子水进行清洗。如图3a所示，荧光显微镜照片表明，BSA-FITC被成功载入导电微针补片的针尖中。
导电微针补片药物缓释的表征：
将步骤一制备的混合有BSA-FITC(0.5mg/mL和1mg/mL)的导电微针补片分别浸泡在2ml PBS中孵育，并在恒温震荡仪中以300rpm的速度在37℃下摇动以模拟体内环境。在预先确定的时间间隔下每次取出100μl的释放介质置于96孔板中,然后补充100μl新鲜PBS溶液继续晃动。用酶标仪测定96孔板中释放介质在不同时间点的BSA-FITC累计释放量，并利用修正公式进行修正并绘制相关曲线，如图3b所示，结果表明导电微针补片对不同浓度的BSA-FITC都具有良好的缓释性能,。
步骤二、基于甲基丙烯酰化明胶导电微针补片的诱导多能干细胞分化培养。
将步骤一制备所得的导电微针补片放入75％酒精浸泡20min进行灭菌，将分化至第六天的诱导多能干细胞复苏并种植在补片的微针阵列层的一侧，放入37℃细胞培养箱(5％CO2)继续进行分化培养，隔天换液，利用倒置体式显微镜观察细胞的分化情况。培养6-14天后，诱导多能干细胞可以成功转化为心肌细胞并恢复自主搏动的能力。在平行排列碳管的诱导下，分化得到的心肌细胞会沿着碳管方向取向排列并产生同步的收缩。
心肌细胞结构及收缩性能的表征：
将培养有取向心肌细胞的导电微针补片分别在4％的多聚甲醛PBS溶液固定30min,0.25％的TritonX-100水溶液通透30min,AF488标记的鬼笔环肽溶液(细胞骨架染料)中浸泡30min,以及细胞核染料DAPI溶液中浸泡30s,对心肌细胞进行特异性荧光染色。图4为共聚焦扫描显微镜拍摄的诱导多能干细胞在导电微针补片上被诱导成取向排列的心肌细胞的实物图，其中a为定向排列心肌细胞的细胞核染色图，b为定向排列心肌细胞的细胞质染色图，c为心肌细胞在平行碳管上排列的明场图，d为图a、b和c的叠加图。如图所示，心肌细胞的细胞核以及细胞质都沿着碳管的方向平行排列。
由于碳管良好的导电性，心肌细胞会在导电微针补片上产生同步的收缩，利用倒置体式显微镜拍摄心肌细胞的收缩视频，图5为细胞收缩前后的视频截图，如图所示，可以很好地模拟真实心脏组织的情况，为心肌梗塞模型的治疗奠定了基础。
实施例3
本实施例提供一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片，由依次叠加的微针阵列层、集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞的平行排列的碳纳米管层及水凝胶支架层组成。
该集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法包括以下步骤：
步骤一、甲基丙烯酰化明胶导电微针补片的制备。
配制含有1％(v/v)光引发剂(2-羟基-2-甲基苯丙酮)的甲基丙烯酰化明胶(15％，w/v)前聚体溶液，并掺杂血管内皮生成因子VEGF(1μg/mL)以及抗炎因子IL-10(1μg/mL)，即制成溶解有治疗性药物的水凝胶前聚体溶液。在PDMS的微针模板中滴入配制的水凝胶前聚体溶液，真空处理10min，去除所有的气泡使水凝胶前聚体溶液完全渗透所有的孔隙。移除模板中多余的溶液，在紫外光下照射30s固化针尖，获得微针阵列层。
将3层平行排列的碳纳米管层沉积到模板上，形成碳纳米管层。
然后再次滴加不含药物的水凝胶前聚体溶液，在紫外光下照射30s二次固化，形成水凝胶支架层。
最后通过自然干燥或者酒精浸泡将所得的导电微针补片从模板上剥离，并用去离子水进行清洗。
步骤二、基于甲基丙烯酰化明胶导电微针补片的诱导多能干细胞分化培养。
将步骤一制备所得的导电微针补片进行紫外灭菌，将分化至第六天的诱导多能干细胞复苏并种植在补片的微针阵列层的一侧，放入37℃细胞培养箱(5％CO2)继续进行分化培养，隔天换液，利用倒置体式显微镜观察细胞的分化情况。培养6-14天后，诱导多能干细胞可以成功转化为心肌细胞并恢复自主搏动的能力。在平行排列碳管的诱导下，分化得到的心肌细胞会沿着碳管方向取向排列。
集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片在治疗心肌梗塞的应用：
将C57BL/6小鼠(12周，雄性)经5％水合氯醛麻醉后，固定于无菌手术台上。通过气管插管，将小鼠连接到呼吸机以保持其手术过程中的正常呼吸，开胸并结扎小鼠的左前降支冠状动脉建立急性心肌梗死模型。小鼠共分为两组，不经过任何治疗的对照组和利用导电微针补片进行治疗的实验组。其中，对照组小鼠在建立心肌梗死模型后直接缝合，并置于温暖环境中培养。而实验组小鼠在成功建立心肌梗死模型后，用镊子分离心包膜，将载有血管内皮生长因子和抗炎因子的集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞的导电微针补片放置在心脏损伤部位，可以观察到导电微针补片可以很好地黏附在心脏上，之后将小鼠胸口创面缝合并置于温暖环境中培养。术后3周同时处死对照组与实验组小鼠进行心肌梗塞相关指标的测试，包括苏木精-伊红(H&E)染色和Masson染色来反映心肌纤维化的程度，以及CD31和α-smooth免疫荧光染色来表征血管再生的程度。如图6所示，a为未接受治疗的对照组，b为载有药物的集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞的导电微针补片治疗的实验组，i是Masson染色图，ii是苏木精-伊红(H&E)染色图，iii是CD31和α-smooth免疫荧光共染色图。由a(i)和b(i)可看出，本补片治疗的小鼠心脏疤痕面积明显减少，由a(iii)和b(iii)可看出，本补片治疗的小鼠心脏具有新生血管，本补片能够促进血管再生，基于该在心肌梗塞模型治疗中表现可知，本补片对于心肌梗塞具有一定的治疗效果。

Claims (10)

1.一种集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片，其特征在于：
由依次叠加的微针阵列层、集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞的平行排列的碳纳米管层及水凝胶支架层组成。
2.如权利要求1所述的集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一、导电微针补片的制备：
将水凝胶前聚体溶液，滴加在微针阵列模板上，通过真空或超声处理使水凝胶前聚体溶液渗透到所有的孔隙中，之后移除多余的水凝胶前聚体溶液并固化针尖结构，获得所述微针阵列层；
随后在所得的含有微针阵列层的模板上覆盖若干层平行排列的碳纳米管，形成碳纳米管层；
然后滴加水凝胶前聚体溶液二次聚合固化形成所述水凝胶支架层；
最后移除微针阵列模板并通过洗涤得到所述导电微针补片；
步骤二、基于导电微针补片的诱导多能干细胞分化培养：
将已开始分化的诱导多能干细胞种植在步骤一所得的导电微针补片的微针阵列层的一侧，提供继续分化的条件，将诱导多能干细胞培养成具有自主搏动能力的心肌细胞，在碳纳米管层的诱导下心肌细胞进行取向排列，最终获得所述集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片。
3.根据权利要求2所述的集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，其特征在于：
其中，步骤一中，所述水凝胶前聚体溶液为含有甲基丙烯酰化明胶和/或甲基丙烯酰化透明质酸的溶液、含有海藻酸盐的溶液或含有丝素蛋白的溶液。
4.根据权利要求2所述的集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，其特征在于：
其中，步骤一中，所述水凝胶前聚体溶液为含有甲基丙烯酰化明胶和/或甲基丙烯酰化透明质酸的溶液时，针尖的固化方式为紫外光固化；
所述水凝胶前聚体溶液为含有海藻酸盐的溶液时，针尖的固化方式为离子交联固化；
所述水凝胶前聚体溶液为含有丝素蛋白的溶液，针尖的固化方式为热固化或利用有机溶剂进行交联固化。
5.根据权利要求2所述的集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，其特征在于：
其中，步骤一中，形成所述微针阵列层和水凝胶支架层的水凝胶前聚体溶液为相同或不同的水凝胶前聚体溶液。
6.根据权利要求2所述的集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，其特征在于：
其中，步骤一中，所述水凝胶前聚体溶液溶解有治疗性药物。
7.根据权利要求2所述的集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，其特征在于：
其中，步骤二的具体过程为：将已经分化至第六天的诱导多能干细胞复苏并利用含有B27的RPMI-1640培养基进行重悬，将细胞悬液滴加到所述导电微针补片表面，置于37℃，5％CO2的培养箱中继续分化培养6～14天，得到所述集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片。
8.根据权利要求2所述的集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，其特征在于：
其中，步骤一中，所述微针阵列层中，相邻微针针尖的距离为500-900μm，微针长度为300-800μm。
9.根据权利要求2所述的集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片的制备方法，其特征在于：
其中，所述碳纳米管层中，碳纳米管的层数为2-4层。
10.如权利要求1-9任意一项所述的集成有诱导多能干细胞来源的心肌细胞导电微针补片在制备治疗心肌梗塞微针补片中的应用。
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