CN103357072A

CN103357072A - 具有微流通道的水凝胶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103357072A
Application number: CN2012100864334A
Authority: CN
Inventors: 蒋兴宇; 慕轩; 肖乐; 张伟; 郑文富
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2012-03-28
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2032-03-28
Also published as: CN103357072B

Abstract

本发明提供一种具有微流通道的水凝胶及其制备方法和应用，所述水凝胶包括水凝胶基底层和与其键合的水凝胶结构层，所述水凝胶结构层与水凝胶基底层键合的表面上设有凹槽结构，所述凹槽结构与所述水凝胶基底层共同形成供流体流通的微流通道，所述水凝胶结构层或水凝胶基底层背离键合的另一个表面上在对应于所述微流通道的两个端口的位置处分别设有穿孔以形成所述微流通道的通道入口和通道出口，所述水凝胶基底层和水凝胶结构层均由含有藻酸钠和纤维状蛋白的水凝胶制成，所述水凝胶基底层和水凝胶结构层通过纤维状蛋白形成的蛋白纤维相键合。本发明的所述具有微流通道的水凝胶可在模拟生物体中脉管系统或在制备用于生物检测的试剂盒中应用。

Description

具有微流通道的水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种具有微流通道的水凝胶及其制备方法和应用，属于组织工程技术领域。

背景技术

具有微通道结构的水凝胶无论在制备功能性材料，还是在体外模拟和重建血管化组织中都可以起到非常重要的作用。通过在水凝胶中制作合适的微通道结构，从而可以模拟生物体中脉管系统(如血管、淋巴管、肾小管和植物导管)。这同时也是在体外模拟体内组织功能的基础。另外，水凝胶中的微通道也可以用来控制水凝胶局部的物理和化学性质。但是水凝胶是一类亲水性高分子材料，其独特的物理化学性质都决定了在水凝胶中构建所需的微通道结构异常困难。目前在水凝胶中构建微通道的方法主要有以下几种：

1)采用光聚合或光解聚的水凝胶，用双光子激光器引发水凝胶聚合或解聚，从而制备三维中空的微通道；但是这种方法所需技术门槛非常高，需要昂贵的仪器设备，其次采用的光化学方法不可避免的会对生物对象，如细胞活性产生影响，从而限制在生命科学领域的应用。

2)采用模具，待水凝胶在模具周围固化后，再移除模具，从而在水凝胶中制作出中空的微通道。目前使用的模具包括金属线、(糖)纤维和明胶等。但是金属线模具只能用来制作直线型通道结构，缺乏制作复杂结构的能力。(糖)纤维结构又过于复杂，缺乏可控性。而明胶等模具本身也是水凝胶，机械强度很差，操作起来很困难。

3)采用热键合，利用琼脂糖水凝胶预热融化的特性，将两块琼脂糖水凝胶加热融合(70℃)，加工出微通道结构。但是高于37℃的温度会伤害细胞，因此限制该方法在生命领域的应用。

4)采用离液剂键合，利用蛋白离液剂对蛋白的解离作用，将蛋白水凝胶键合在一起，同时保留通道结构。但是离液剂对细胞的损害也比较大，因此限制这种方法在生命领域的应用。

5)采用水凝胶微珠的组装，利用微珠与微珠之间的空隙起到通道的作用。但是这种模拟十分简陋，空隙的可控程度十分差。且对于含有细胞的水凝胶微珠，随着培养的进行，会形成整体的水凝胶块，而空隙则会消失。

发明内容

因此，本发明的目的是针对目前具有微流通道的水凝胶制备方法复杂、成本高、微流通道的结构不可控、对细胞有损害的不足，提供一种基于蛋白纤维生成的具有微流通道的水凝胶及其制备方法和应用，其基于蛋白纤维生成，并且微流通道的结构可控性强、可灌输、生物兼容性好、对细胞没有伤害。

针对上述目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种具有微流通道的水凝胶，包括水凝胶基底层和与其键合的水凝胶结构层，所述水凝胶结构层与水凝胶基底层键合的表面上设有微流凹槽，所述微流凹槽与所述水凝胶基底层共同形成供流体流通的微流通道，所述水凝胶结构层或水凝胶基底层背离键合的另一个表面上在对应于所述微流通道的两个端口的位置处分别设有穿孔以形成所述微流通道的通道入口和通道出口，所述水凝胶基底层和水凝胶结构层均由含有藻酸钠和纤维状蛋白的水凝胶制成，所述水凝胶中还含有碱土金属盐，所述水凝胶基底层和水凝胶结构层通过纤维状蛋白形成的蛋白纤维相键合。

优选地，所述纤维状蛋白为胶原蛋白、纤维蛋白原和蚕丝蛋白。

优选地，所述胶原蛋白为I型、II型、III型、V型、XI型、XXIV型和XXVI型胶原蛋白。

优选地，所述微流通道的宽为20～1000μm，高为20～1000μm，更为优选地，所述微流通道的宽为200～400μm，高为200～400μm。

优选地，所述水凝胶中还含有10％DMEM 10X，10％PBS 10X，5～15μL 1M NaOH和100～300μL去离子水。

另一方面，本发明提供一种具有微流通道的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

1)将含有藻酸钠和纤维状蛋白的水凝胶预聚物通入预先制备好的第一模具上，所述第一模具上设有凸起，使纤维状蛋白固化成水凝胶，再将碱土金属盐水溶液加入固化的水凝胶表面，使藻酸钠固化交联，生成藻酸钠水凝胶，形成设有与第一模具上的凸起相适配的微流凹槽的水凝胶结构层，再将所述水凝胶结构层从第一模具中取出，优选地，所述碱土金属盐水溶液为氯化钙水溶液、氯化锶水溶液或氯化钡水溶液，更优选地，所述微流凹槽的宽为20～1000μm，高为20～1000μm；最优选地，所述微流凹槽的宽为200～400μm，高为200～400μm；

2)水凝胶基底层的制备：在预先制备好的第二模具上加上围栏，通入含有藻酸钠和纤维状蛋白的水凝胶预聚物，形成水凝胶基底层预聚物；

3)将步骤1)制得的水凝胶结构层设有微流凹槽的表面置于步骤2)制得的水凝胶基底层预聚物上，使纤维状蛋白固化成水凝胶基底层，使水凝胶结构层和水凝胶基底层中的纤维状蛋白形成的蛋白纤维相键合；

4)再将碱土金属盐水溶液加入步骤3)制得的相键合的水凝胶结构层和水凝胶基底层中，使水凝胶基底层中的藻酸钠固化交联，形成具有微流凹槽的水凝胶，再将其从第二模具中取出，即得。

优选地，当形成通道入口或通道出口的穿孔设于水凝胶结构层上时，所述第一模具的预设计处设有两个圆柱体，以使通入水凝胶预聚物后形成通道入口和通道出口，或在在将所述水凝胶结构层从第一模具中取出前，还包括在步骤1)制得的设有微流凹槽的水凝胶结构层的预设计处用平头针或打孔器制作两个圆形穿孔，形成通道入口和通道出口，制得水凝胶结构层的步骤。

优选地，当形成通道入口或通道出口的穿孔设于水凝胶基底层上时，所述第二模具的预设计处设有两个圆柱体，以使通入水凝胶预聚物后形成通道入口和通道出口。

优选地，所述碱土金属盐水溶液为氯化钙水溶液、氯化锶水溶液或氯化钡水溶液，更优选地，所述微流通道的宽为20～1000μm，高为20～1000μm，更为优选地，所述微流通道的宽为200～400μm，高为200～400μm。

优选地，在步骤1)和2)中，所述藻酸钠在水凝胶预聚物中的重量百分比含量均为1～6％。

优选地，在步骤1)和2)中，所述纤维状蛋白的浓度均为1～6mg/mL，优选地，所述纤维状蛋白为胶原蛋白、纤维蛋白原或蚕丝蛋白，更优选地，所述胶原蛋白为I型、II型、III型、V型、XI型、XXIV型和XXVI型胶原蛋白。

优选地，在步骤1)和2)中，均于25～37℃下，放置15～40分钟固化成水凝胶，优选地，于37℃下，放置20分钟固化成水凝胶。

优选地，在步骤1)，将10-90mM的碱土金属盐水溶液加入固化后的水凝胶表面，放置15～35分钟，固化交联，优选地，所述碱土金属盐水溶液的浓度为60mM。

优选地，在步骤4)中，所述碱土金属盐水溶液的浓度为10～90mM，放置15～35分钟，使水凝胶基底层中的藻酸钠固化交联，优选地，所述碱土金属盐水溶液的浓度为60mM。

优选地，所述第一、第二模具均由包括以下步骤的方法制得：根据预设形状由CAD软件设计其尺寸，再由硅橡胶材料通过包括光刻和/或翻模的步骤制得，优选地，所述硅橡胶材料为聚二甲基硅氧烷。

还一方面，本发明提供一种具有微流通道的水凝胶在模拟生物体中脉管系统或在制备用于生物检测的试剂盒中应用，优选地，所述生物体中脉管系统包括血管、淋巴管、肾小管和导管。

又一方面，本发明提供一种用于生物检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明所述的具有微流通道的水凝胶，还包括检测试剂和缓冲液，优选地，所述检测试剂为细胞、抗体或活性小分子。

本发明的有益效果包括：

1)可以在水凝胶中构建微通道，其结构由CAD软件设计，具有较高的可控性。

2)该微通道具有较好的机械强度，可以灌输液体和细胞悬浮液。

3)整个加工方法不会对细胞造成损害，且支持细胞在微通道表面的粘附。

4)通过微通道中的对流扩散，可以增加水凝胶中细胞的密度和存活率。

5)。水凝胶可以包裹细胞。水凝胶中的微通道可以灌输液体和细胞悬浮液，并且支持内皮和上皮细胞的粘附和生长，可以生成内皮化和上皮化的微通道。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明实施方式1所述的具有微流通道的水凝胶的主视图；其中，1为具有微流通道的水凝胶，2为微流通道，3为凝胶部分，4为通道入口，5为通道出口；

图2为本发明实施方式1所述的具有微流通道的水凝胶的照片；

图3为本发明实施方式2所述的具有微流通道的水凝胶的主视图；其中，1为具有微流通道的水凝胶，2为微流通道，3为凝胶部分，4为通道入口，5为通道出口；

图4为本发明实施方式2所述的具有微流通道的水凝胶的照片；

图5为图1所述的具有微流通道的水凝胶的A-A面的剖视图；其中，1为具有微流通道的水凝胶，2为微流通道；

图6为图1所述的具有微流通道的水凝胶置于模具的围栏上的分解结构示意图；其中，6为水凝胶结构层，7为水凝胶基底层，8为围栏；

图7为图1所述的具有微流通道的水凝胶的纤维形成过程中的剖视图；其中，6为水凝胶结构层，7为水凝胶基底层，9为纤维状蛋白形成的蛋白纤维；

图8为从本发明所述的具有微流通道的水凝胶的微通道扩散进水凝胶的荧光强度随时间的变化；其中，黑色箭头表示通道的两侧；

图9为从本发明所述的具有微流通道的水凝胶中的水凝胶部分内部扩散至微通道的荧光强度随时间的变化；其中，黑色箭头表示通道的两侧；

图10为在本发明所述的具有微流通道的水凝胶的微通道中通入内皮细胞，生成内皮化的细胞单层膜和内皮化的微通道；其中，10为内皮化的微通道；

图11为内皮细胞单层膜的荧光图像；

图12为在本发明所述的具有微流通道的水凝胶的微通道中通入上皮细胞，生成上皮化的细胞单层和上皮化的微通道；其中，11为上皮化的微通道；

图13为上皮细胞单层膜的荧光图像；

图14为试验实施例2的试验结果图。

具体实施方式

实施方式1

如图1-2和图5-7所示，本发明所述的具有微流通道的水凝胶1，包括水凝胶基底层7和与其键合的水凝胶结构层6，所述水凝胶结构层6与水凝胶基底层6键合的表面上设有微流凹槽，所述微流凹槽与所述水凝胶基底层7共同形成供流体流通的微流通道2，所述水凝胶结构层6或水凝胶基底层7背离键合的另一个表面上在对应于所述微流通道2的两个端口的位置处分别设有穿孔以形成所述微流通道的通道入口4和通道出口5，所述水凝胶基底层7和水凝胶结构层6均由含有藻酸钠和纤维状蛋白的水凝胶制成，所述水凝胶中还含有碱土金属盐，所述水凝胶基底层7和水凝胶结构层6通过纤维状蛋白形成的蛋白纤维9相键合。

实施方式2

如图3-4所示，本发明所述的具有微流通道的水凝胶与实施方式1中的具有微流通道的水凝胶结构相同，所不同的为微流通道2的形状不同。

以下实施例中所用的试验材料：人类脐带静脉内皮细胞(HUVEC细胞)购自北京协和医院细胞库；MDCK肾上皮细胞购自北京协和医院细胞库。

实施例1

第一步：根据需要的微流凹槽的形状，由CAD软件设计设有具有与微流凹槽相适配的凸起的第一模具的具体尺寸，及第二模具的具体尺寸，所述微流凹槽的宽为200μm，高为200μm，再由硅橡胶材料通过包括光刻和翻模的方法制得硅橡胶第一、第二模具(参见微流控芯片实验室，科学出版社，2006年)；再于冰上，混合含有藻酸钠(3％w/w)和I型胶原蛋白(3mg/mL)，及10％DMEM 10X，10％PBS 10X，5μL 1M NaOH和100μL去离子水的水凝胶预聚物，浇于硅橡胶第一模具之上。

第二步：提高温度(至37℃)和加入氯化钙水溶液(60mM)先后使I型胶原蛋白和藻酸钠水凝胶固化，形成具有微流凹槽的水凝胶结构层(图6中的6)；再将设有微流凹槽的水凝胶结构层的预设计处用平头针制作两个圆形穿孔(直径1000微米)，形成通道入口4和通道出口5，最后将其从第一模具中取出。

第三步：在预先制备好的第二模具上，将与第一步中相同的液体的水凝胶预聚物放置于硅橡胶围栏(图6中的8)中，液面与围栏高度平齐，形成水凝胶基底层7预聚物(图6中)。把固化的具有微流凹槽的水凝胶结构层放置于水凝胶基底层预聚物之上，提高温度，使I型胶原蛋白固化，在水凝胶界面处产生I型胶原蛋白纤维(图7中的9)。水凝胶结构层和水凝胶基底层接触的地方键合成为一体，从而得到整块的水凝胶微流通道(图5和图1中的1)。没有接触的地方则形成微流通道(图1和图5中的2)，接触的地方形成凝胶部分(图1中的3)。其中，本发明所述的具有微流通道的水凝胶图片见图2。

第四步：加入氯化钙水溶液(60mM)使水凝胶基底层中的藻酸钠水凝胶也固化交联。此时，可以用镊子把具有微流通道的水凝胶从模具中取出。

第五步：在制作好的具有微流通道的水凝胶的微流通道中，从通道入口通入荧光素标记的葡聚糖(10kDa，100mM)，用荧光显微镜观察荧光分子向水凝胶内扩散的情况。微流通道横截面的荧光强度分布随时间的变化，见图8，说明荧光分子会从微通道向水凝胶内部扩散，从而可以利用微通道内的对流调控水凝胶内部的化学环境。

第六步：使用荧光素标记的葡聚糖溶液(10kDa，100mM)浸泡水凝胶。再从通道入口往具有微流通道的水凝胶的微流通道中通入去离子水。用荧光显微镜观察荧光分子向微流通道内扩散的情况。微流通道横截面的荧光强度分布随时间的变化，见图9，说明荧光分子会从水凝胶内部向微通道扩散，从而可以利用微通道内的对流调控水凝胶内部的化学环境。荧光分子由水凝胶部分的内部向微通道扩散，并且显微镜下观察，荧光颗粒制备限制在微流通道内，从而证明微流通道的密封性。

实施例2

第一步：根据需要的微流凹槽的形状，由CAD软件设计设有具有与微流凹槽相适配的凸起的第一模具的具体的尺寸，及第二模具的具体尺寸，所述微流凹槽的宽为300μm，高为300μm，再由橡胶材料通过包括翻模的方法制得硅橡胶第一、第二模具；再于冰上，混合含有藻酸钠(6％w/w)和II型胶原蛋白(6mg/mL)，及10％DMEM 10X，10％PBS 10X，10μL 1M NaOH和200μL去离子水的水凝胶预聚物，浇于硅橡胶第一模具之上。

第二步：提高温度(至37℃)和加入氯化钙水溶液(90mM)先后使II型胶原蛋白和藻酸钠水凝胶固化，形成具有微流凹槽的水凝胶结构层(图6中的6)；再将设有微流凹槽的水凝胶的预设计用打孔器制作两个圆形穿孔(直径2000微米)，形成通道入口4和通道出口5，最后将其从第一模具中取出。

第三步：在预先制备好的第二模具上，将与第一步中相同的液体的水凝胶预聚物放置于硅橡胶围栏(图6中的8)中，液面与围栏高度平齐，形成水凝胶基底层7预聚物(图6中)。具有微流凹槽的水凝胶结构层放置于水凝胶基底层预聚物之上，提高温度，使II型胶原蛋白固化，在水凝胶界面处产生II型胶原蛋白纤维(图7中的9)。水凝胶结构层和水凝胶基底层接触的地方键合成为一体，从而得到整块的具有微流通道的水凝胶(图1和图5中的1)。没有接触的地方则形成微流通道(图1和图5中的2)，接触的地方形成凝胶部分(图1中的3)。

第四步：加入氯化锶水溶液(90mM)使水凝胶基底层中的藻酸钠水凝胶也固化交联。此时，可以用镊子把具有微流通道的水凝胶从模具中取出。

第五步：在制作好的具有微流通道的水凝胶的微流通道中，从通道入口通入人类脐带静脉内皮细胞(HUVEC)的悬浮液(3×10⁶/mL)，静置半小时，待细胞贴壁。

第六步：在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养人类脐带静脉内皮细胞和具有微流通道的水凝胶5-8天，每天更换培养基(DMEM，10％FBS，1％P&S，1％Amphotericin)。人类脐带静脉内皮细胞可以在通道表面生长形成内皮化的细胞单层和内皮化的微通道10(图10)。荧光染色图见图11。HUVEC细胞呈不规则形状，排列较为松散，具有实现内皮管状组织功能的潜力。本发明的具有微流通道的水凝胶能够很好地模拟生物体中的脉管系统，能够体现内皮细胞的形态学特征，其与上皮细胞有显著不同。

实施例3

第一步：根据需要的微流凹槽的形状，由CAD软件设计设有具有与微流凹槽相适配的凸起的第一模具的具体的尺寸，及第二模具的具体尺寸，所述微流凹槽的宽为400μm，高为400μm，再由硅橡胶材料通过包括光刻的方法制得硅橡胶第一、第二模具，所述第二模具的预设计处设有两个圆柱体，以使通入水凝胶预聚物后形成通道入口和通道出口；再于冰上，混合含有藻酸钠(1％w/w)和III型胶原蛋白(1mg/mL)，及10％DMEM 10X，10％PBS 10X，15μL 1M NaOH和300μL去离子水的水凝胶预聚物，浇于硅橡胶第一模具之上。

第二步：在预先制备好的第二模具上，将与第一步中相同的液体的水凝胶预聚物放置于硅橡胶围栏(图6中的8)中，液面与围栏高度平齐，形成水凝胶基底层7预聚物(图6中)。具有凹槽结构的水凝胶结构层放置于水凝胶基底层预聚物之上，提高温度，使III型胶原蛋白固化，在水凝胶界面处产生III型胶原蛋白纤维(图7中的9)。水凝胶结构层和水凝胶基底层接触的地方键合成为一体，从而得到整块的具有微流通道的水凝胶(图1和图3中的1)，而没有接触的地方则形成微流通道(图1和图5中的2)，接触的地方形成凝胶部分(图1中的3)。

第三步：加入氯化钡水溶液(10mM)使水凝胶基底层中的藻酸钠水凝胶也固化交联。此时，可以用镊子把具有微流通道的水凝胶从模具中取出。

第四步：在制作好的具有微流通道的水凝胶的微流通道中，从通道入口通入是狗肾上皮细胞(MDCK细胞)的悬浮液(3×10⁶/mL)，静置半小时，待细胞贴壁。

第五步：在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养细胞和具有微流通道的水凝胶5-8天，每天更换培养基(DMEM，10％FBS，1％P&S，1％Amphotericin)。上皮细胞可以在微流通道表面生长形成单层膜(图12中的11)。荧光染色图见图13。MDCK细胞呈乱石型，排列比较紧密，具有实现上皮管状组织功能的潜力。本发明的具有微流通道的水凝胶能够很好地模拟生物体中的脉管系统，能够体现上皮细胞的形态学特征，其与内皮细胞有较大的差别。

具体试验实施例

试验实施例1

将实施例1制得的具有微流通道的水凝胶可用镊子捏起，水凝胶结构层和水凝胶基底层键合可靠，保持完整，说明水凝胶结构层和水凝胶基底层保持贴合状态，键合成功。另外在微流通道中通入具有荧光的微颗粒(1微米大小)，在显微镜下可见，荧光颗粒只被限制在微流通道内，从而证明微流通道的密封性。

试验实施例2

按与实施例2的相同的方法和操作步骤制备具有微流通道的水凝胶，不同的为将实施例2的水凝胶预聚物中的去离子水替换成细胞悬浮液(1-3×10⁶/mL)，可以在水凝胶中包裹细胞，实现细胞的三维培养。每天更换培养基。细胞的存活率也可以达到50％以上，说明本发明的具有微流通道的水凝胶能够除用于模拟生物体脉管系统外，还可以用于细胞培养，并且对细胞的伤害性小，存活率高。具体结果如图14所示，其中，分别用红绿荧光标记水凝胶中的死活细胞。白色虚线大致标出通道的边界。

Claims

1.一种具有微流通道的水凝胶，包括水凝胶基底层和与其键合的水凝胶结构层，所述水凝胶结构层与水凝胶基底层键合的表面上设有微流凹槽，所述微流凹槽与所述水凝胶基底层共同形成供流体流通的微流通道，所述水凝胶结构层或水凝胶基底层背离键合的另一个表面上在对应于所述微流通道的两个端口的位置处分别设有穿孔以形成所述微流通道的通道入口和通道出口，其特征在于，所述水凝胶基底层和水凝胶结构层均由含有藻酸钠和纤维状蛋白的水凝胶制成，所述水凝胶中还含有碱土金属盐，所述水凝胶基底层和水凝胶结构层通过纤维状蛋白形成的蛋白纤维相键合。

2.根据权利要求1所述的具有微流通道的水凝胶，其特征在于，所述纤维状蛋白为胶原蛋白、纤维蛋白原和蚕丝蛋白；优选地，所述胶原蛋白为I型、II型、III型、V型、XI型、XXIV型和XXVI型胶原蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的具有微流通道的水凝胶，其特征在于，所述微流通道的宽为20～1000μm，高为20～1000μm，更为优选地，所述微流通道的宽为200～400μm，高为200～400μm。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的具有微流通道的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

1)将含有藻酸钠和纤维状蛋白的水凝胶预聚物通入预先制备好的第一模具上，所述第一模具上设有凸起，使纤维状蛋白固化成水凝胶，再将碱土金属盐水溶液加入固化后的水凝胶表面，使藻酸钠固化交联，形成具有与第一模具上的凸起相适配的微流凹槽的水凝胶，优选地，所述碱土金属盐水溶液为氯化钙水溶液、氯化锶水溶液或氯化钡水溶液，优选地，所述藻酸钠在水凝胶预聚物中的重量百分比含量为1～6％，更优选地，所述微流凹槽的宽为20～1000μm，高为20～1000μm，再优选地，所述微流通道的宽为200～400μm，高为200～400μm；

2)在预先制备好的第二模具上加上围栏，所述第二模具为通入含有藻酸钠和纤维状蛋白的水凝胶预聚物，形成水凝胶基底层预聚物，优选地，所述藻酸钠在水凝胶预聚物中的重量百分比含量为1～6％；

3)将步骤1)制得的水凝胶结构层的设有微流凹槽的表面置于步骤2)制得的水凝胶基底层预聚物上，使纤维状蛋白固化成固化水凝胶基底层，使水凝胶结构层和水凝胶基底层中的纤维状蛋白形成的蛋白纤维相键合；

4)再将碱土金属盐水溶液加入步骤3)制得的相键合的水凝胶结构层和水凝胶基底层中，使水凝胶基底层中的藻酸钠固化交联，形成具有微流通道的水凝胶，再将其从模具中取出，即得；优选地，所述碱土金属盐水溶液为氯化钙水溶液、氯化锶水溶液或氯化钡水溶液，更优选地，所述微流凹槽的宽为20～1000μm，高为20～1000μm，更为优选地，所述微流通道的宽为200～400μm，高为200～400μm。

5.根据权利要求4所述的具有微流通道的水凝胶的制备方法，其特征在于，当形成通道入口或通道出口的穿孔设于水凝胶结构层上时，或在将所述水凝胶结构层从第一模具中取出前，还包括在步骤1)制得的设有微流凹槽的水凝胶结构层的预设计处用平头针或打孔器制作两个圆形穿孔，形成通道入口和通道出口，制得水凝胶结构层的步骤；或当形成通道入口或通道出口的穿孔设于水凝胶基底层上时，所述第二模具的预设计处设有两个圆柱体，以使通入水凝胶预聚物后形成通道入口和通道出口。

6.根据权利要求4或5所述的具有微流通道的水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤1)和2)中，所述纤维状蛋白的浓度均为1～6mg/mL；优选地，所述纤维蛋白为胶原蛋白、纤维蛋白原和蚕丝蛋白；更优选地，所述胶原蛋白为I型、II型、III型、V型、XI型、XXIV型和XXVI型胶原蛋白。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的具有微流通道的水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤1)和2)中，均于25～37℃下，放置15～40分钟固化成水凝胶，优选地，于37℃下，放置20分钟固化成水凝胶。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的具有微流通道的水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，将10～90mM的碱土金属盐溶液加入固化的水凝胶表面，放置15～35分钟，固化交联，优选地，所述碱土金属盐水溶液的浓度为60mM。

9.根据权利要求4至8中任一项所述的具有微流通道的水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤4)中，所述碱土金属盐水溶液的浓度为10～90mM，放置15～35分钟，使水凝胶基底层中的藻酸钠固化交联，优选地，所述碱土金属盐水溶液的浓度为60mM。

10.根据权利要求4至9中任一项所述的具有微流通道的水凝胶的制备方法，所述第一、第二模具均由包括以下步骤的方法制得：根据预设形状由CAD软件设计其尺寸，再由硅橡胶材料通过包括光刻和/或翻模的步骤制得，优选地，所述硅橡胶材料为聚二甲基硅氧烷。

11.根据权利要求1至3中任一项所述的具有微流通道的水凝胶在模拟生物体中脉管系统或在制备用于生物检测的试剂盒中应用，优选地，所述生物体中脉管系统包括血管、淋巴管、肾小管和导管。

12.一种用于生物检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至3中任一项所述的具有微流通道的水凝胶，还包括检测试剂和缓冲液，优选地，所述检测试剂为细胞、抗体或活性小分子。