CN110694115A - 体外构建肌腱组织的方法及其生物材料和应用 - Google Patents

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Abstract

一种体外构建肌腱组织的方法，对细胞施以电刺激，使细胞发生迁移、排列、增殖和成肌腱分化，提高所构建肌腱组织的力学强度。本发明提供的方法，可具有电活性，受外力的牵拉能产生电信号的生物材料制成支架，将细胞接种其上，体外培养，使得支架上的细胞形成肌腱组织，再植入动物体内成熟，最后成熟的肌腱用于修复肌腱组织缺损。

Description

体外构建肌腱组织的方法及其生物材料和应用
技术领域
本发明涉及一种制取用于组织修复的材料，尤其涉及一种体外构建肌腱组织的方法，以及利于构建肌腱的生物材料，及其在肌腱修复中的应用。
背景技术
肌腱是高度分化的纤维组织，其主要作用是传递肌肉与骨骼之间的机械应力。传统的肌腱缺损修复方法主要采用自体肌腱移植、同种异体肌腱或人工肌腱替代等方法，这些方法存在诸多弊端，例如：引起供区功能障碍、机体排异反应和降解后生物力学下降等。
肌腱是一种富含胶原的致密结缔组织，具有较好的生物力学性能。这种特性与胶原纤维的分层组合结构密切相关(Proc Inst Mech Eng H.2004，218(2)：109)。胶原纤维聚集成束被腱内膜包绕形成初级结构，再逐步聚合形成二级和三级结构，最终形成肌腱组织(J Cell Biol，2000，151(4)：779)。模拟胶原成熟的组织微环境在构建组织工程化肌腱过程中至关重要。以往研究(包括我们的研究)表明特定的生长因子，如：BMP、GDF和TGF-β，单向牵张力刺激以及狭长细胞形态维持等，是模拟肌腱再生微环境的重要因素。Shen等人发现BMP-12可以激活ASCs中的Smad信号通路诱导脂肪干细胞向肌腱细胞分化，有效增强肌腱标志物SCX和TNMD的基因和蛋白表达水平(PLoS One.2013，8(10)：e77613)。Park等发现GDF-5可以促进ASCs的增殖(Tissue Eng Part A.2010，16(9)：2941)，提高细胞外基质(COLLI、decorin、ACAN)和肌腱细胞标志物(SCX、Tnmd、tenascin-C)的表达。Hurle等人证实肌腱细胞体外培养过程中添加TGF-β可以促进细胞增殖和胶原合成(J Biol Chem，2009，284(43)：29988)，TGF-β也可以通过Smad通路来上调Scleraxis和Tenomodulin的表达。Oakes等发现周期性张力促进肌腱愈合的机制(Med J Aust，2004，180(5Suppl)：S35)，主要是通过提高各类生长因子的含量从而促进细胞增殖、分化，基质形成。Tong等利用牛跟腱冰冻切片作为模板观察其对人MSC成肌腱诱导的作用(Biomaterials，2012，33(31)：7686)，结果显示只有在纵向切片上MSC因为表面胶原纤维纵向排列的拓扑结构而转化为狭长形态并向肌腱细胞分化。同时发现静态力学刺激较无力学刺激能更有助于细胞胶原分泌、纵向排列以及增增强胶原的重塑和成熟，而动态单向力学刺激较静态力学刺激能更有效促进胶原纤维形成与重塑和肌腱结构的形成(Tissue Eng Part A.2008，14(10)：1615)。
中国发明专利201510005188.3公开了一种三维平行胶原纤维-蚕丝支架，由编织蚕丝基架和包覆在编织蚕丝基架上、下方表面的平行胶原纤维层构成，编织蚕丝基架是由蚕丝编织成网孔大小为0.25～25mm2的网片结构，平行胶原纤维的孔隙直径大小为10～300μm，编织蚕丝是去除了丝胶蛋白的编织蚕丝；支架生物相容性好，力学性能佳，支架的拓扑结构与肌腱/韧带相似，能够促进其表面生长的干细胞向肌腱/韧带分化，促进肌腱/韧带再生。
中国发明专利申请201910073913.9公开了一种利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，由种子细胞的培养、肌腱支架的制备和细胞的种植等步骤制得。通过结合熔融静电纺丝三维打印和同轴纺丝技术，使得熔融静电纺丝三维打印技术可以极大地提高打印精度，易于控制纤维直径与打印路径，而同轴纺丝技术则可使我们获得内层含有细胞因子的双层纤维，通过不同的路径参数，直接获得肌腱-软骨-骨三相支架，该制作方法简单方便，同时携带大量细胞因子进行缓释，可促进细胞增殖修复，利于腱骨联合修复及正常功能恢复。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种体外构建肌腱组织的方法，对用于形成肌腱的细胞施以电信号，促进细胞发生迁移、排列和增殖，提高所构建肌腱组织的强度，实现对肌腱的修复。
本发明的另一个目的在于提供一种体外构建肌腱组织的方法，采用将细胞接种于具有电活性，产生电信号的生物材料上，使得受到外力作用的生物材料产生的电信号作用于细胞，促进细胞发生迁移、排列和增殖，提高所成肌腱组织的强度，适用于肌腱的修复。
本发明的再一个目的在于提供一种生物材料，具有拓扑结构，并具有电活性，能产生电信号，适用于肌腱的体外构建。
本发明的又一个目的在于提供一种支架材料，将其植入肌腱的缺损处，支架材料受到外力作用产生的电信号作用于细胞，并促进细胞发生迁移、排列和增殖，使得借由支架所形成的肌腱组织的强度得到提高。
一种体外构建肌腱组织的方法，对细胞(如：干细胞，成纤维细胞等)施以电场(如：直流电场)，使细胞发生迁移、排列和增殖，提高所制成肌腱组织的强度。
另一种体外构建肌腱组织的方法，将细胞接种于具有电活性，能产生电信号的生物材料上，对生物材料施以作用力而产生作用于细胞的电场，促进细胞发生迁移、排列和增殖，提高细胞所成肌腱组织的强度。
另一种体外构建肌腱组织的方法，将细胞接种于平行排列形成的束状拓扑结构，具有电活性，能产生电信号的生物材料上，对生物材料施以作用力而产生作用于细胞的电场，促进细胞发生迁移、排列和增殖，提高细胞所成肌腱组织的强度。
PLLA是一种以α螺旋结构为主的半结晶生物材料，具有生物相容性和生物可降解性，其降解产物是L-乳酸。经广泛的研究证实，L-乳酸对人体无毒。本发明优先选择聚左旋乳酸(PLLA)为产生电活性的纤维材料。
一种制取本发明生物材料的方法，包括如下步骤：
将PLLA溶解于六氟异丙醇溶液中，搅拌至均匀，将PLLA溶液(浓度如：8w/v％)进行静电纺丝，纺丝条件为：15千伏，电场距离150毫米，纺丝液注射速率1.0毫升/小时。纺丝时，纺丝液在电场力的作用下，形成纳米纤维。纳米纤维落入水中后，在涡旋的作用下，抱合成一束纱，即为纤维材料。
从转轴上取下纤维材料，滴加少许双蒸水，放入-80℃冰箱里预冻2小时。预冻之后，纳米纱冰冻成一整块平板，再置于冷冻干燥机，过夜冷冻干燥，即可得到最终成型的纳米纱三维支架。纳米纱三维支架保存在真空干燥箱中。
用于本发明的生物材料采用静电纺丝技术制备成具有拓扑结构的PLLA纤维材料。
将细胞接种于制取的纤维材料或者支架材料中植入肌腱缺失处，支架受到外力的作用而拉伸，经拉伸产生电信号，能促进其中的细胞发生迁移、排列和增殖，实现对肌腱的修复。
本发明技术方案实现的有益效果：
本发明提供的体外构建肌腱组织的方法，对细胞施以电场，促进了细胞发生迁移、排列和增殖，并提高了新生成的肌腱组织的力学强度。
本发明提供的体外构建肌腱组织的方法，采用具有电活性，受外力的牵拉能产生电信号的生物材料，并在体外将细胞接种于生物材料上，使得生物材料因受作用力而产生的电场施加于细胞，促进了细胞发生迁移、排列和增殖，并能提高新生成的肌腱组织的强度，利于肌腱的修复。
本发明提供的支架，在体外将细胞接种于具有电活性，受外力的牵拉能产生电信号的生物材料上，将支架材料植入组织缺损处，使得于支架上的细胞形成肌腱样组织，并对缺损处组织实现修复。
附图说明
图1a为细胞在电场下发生迁移、排列和增殖的示意图；
图1b为细胞在电场下发生迁移、排列和增殖的图像；
图2为本发明制得的平行排列拓扑结构的纤维支架材料力学性能结果图；
图3为本发明制得平行排列拓扑结构的纤维支架材料对肌腱再生作用结果图；
图4为本发明的支架材料应用于肌腱植入大鼠肌腱缺损构建的结果图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
实施例1制备PLLA纤维
将0.8克PLLA溶解于10毫升六氟异丙醇溶液中，搅拌至均匀，得到浓度为8％(克/毫升)的PLLA溶液。将溶液进行静电纺丝，纺丝条件：电压，15千伏；电场距离150毫米；注射速率，1.0毫升/小时。纺丝时，纺丝液在电场力的作用下，形成纳米纤维。纳米纤维落入水中后，在涡旋的作用下，抱合成一束纱，称之为纳米纱。纳米纱随着水流缠绕到转轴上后，通过转轴成型制成PLLA支架。
从转轴上取下纳米纱，滴加少许水，放入-80℃冰箱里预冻2小时。预冻之后，纳米纱冰冻成一整块平板，再置于冷冻干燥机，过夜冷冻干燥，即可得到最终成型的纳米纱三维支架。纳米纱三维支架保存于真空干燥箱中。
通过在PLLA支架两面涂敷银电极，然后通电保温极化，得到压电PLLA支架。
实施例2电刺激验证
取小鼠腹股沟内脂肪组织，分离出血管基质部分(SVF)，用胶原酶消化，分离细胞并置入DMEM+10％FBS培养液中进行细胞培养和扩增，以制取脂肪干细胞(ASCs)
采用电刺激生物反应器，细胞培养24小时后，更换培养基，通过图像分析系统采用连续视野摄像，记录电场刺激前的细胞图像，将细胞分别暴露于不同场强的直流电场，未接受电场刺激的细胞作为对照。研究发现，细胞在电场下有迁移、排列、增殖等现象(参见图1a和图1b)。
实施例3制备肌腱修复支架
采用脂肪干细胞与PLLA支架体外培养的模式，总培养时间为12周。接种细胞的材料分为非极化PLLA支架(包括力学刺激组、无力学刺激组)，极化压电PLLA支架(包括力学刺激组、无力学刺激组)。4组支架材料提前用细胞培养基在4孔板中润湿浸润处理过夜，吸干培养基后固定于牵拉生物反应器中，取1mL 5×105/mL ASCs溶液分别接种在实验组和对照组支架材料上，37℃培养箱培养2小时后，待细胞粘附后，缓慢加入2mL细胞培养基浸没支架，继续培养，给予PLLA支架上的细胞牵拉力学刺激，每天两次，每次30分钟，幅度为4％间断力学刺激或者每天24小时幅度为4％连续力学刺激或者不刺激，总共处理4周。4周后通过生物力学测定仪(Instron)检测肌腱组织力学性能指标，包括弹性模量(Young′smodulus)、最大负荷(maximal load)、拉力强度(tensile strength)，采用高效液相色谱法(HPLC)分析吡哆醇/湿重(PYR/WW)，吡哆醇/胶原(PYR/Co1)的表达情况和采用RT-qPCR检测LOX基因水平表达，证实电刺激可加强肌腱力学性能并可诱导LOX产生。同时使用RT-qPCR和WB检测I型、III型、VI型和V型胶原，Tenascin-C、Decorin、BGN和FMOD，LOX，PYR的表达情况，使用Elisa和免疫荧光检测I型、III型和VI型胶原表达量，同时使用羟脯胺酸试剂盒检测胶原含量以及通过透射电镜观察胶原超微结构的差异。用SPM测试压电PLLA支架的压电性能，通过displacement(nm)-voltage(V)蝶形曲线得到d33-voltage曲线。
实施例3拓扑结构验证
用螺旋测微器测量PLLA三维支架的厚度，并剪成50毫米×10毫米大小样品，用夹子夹住样品尾端10毫米×10毫米，在万能材料试验机上测试支架的力学性能。每种支架力学测试的重复样为5个。
将极化压电PLLA支架(力学刺激组)构建的组织工程肌腱植入裸鼠背部，以非极化PLLA支架(力学刺激组)为对照组织工程肌腱。将构建肌腱两头分别缝合于背部颈部和尾部筋膜上，利用裸鼠背部活动实施动态牵拉。具体分为两组：对照组为普通方法构建肌腱；实验组为时空模拟构建肌腱；植入后12周获取组织，分别观察形成组织的大体观并进行力学分析，包括弹性模量，最大负荷，拉力强度；通过HE，Masson和天狼星红染色，偏振光观察构建组织的组织结构，采用透射电镜观察胶原原纤维的超微结构；利用免疫组化分析I型、III型和VI型胶原的表达情况，羟脯胺酸试剂盒检测胶原含量。
经验证，三维平行排列的纤维支架材料比杂乱无章的纤维支架材料对成纤维细胞分化为肌腱细胞的效果更好(图2)，同时三维平行排列纤维材料有助于肌腱再生(图3)
实施例4肌腱缺损修复的评价
将极化压电PLLA支架(力学刺激组)构建的组织工程肌腱植入大鼠肌腱缺损处，以非极化PLLA支架(力学刺激组)为对照，此时细胞为大鼠ASCs，利用大鼠牵拉模型对植入细胞材料复合物在肌腱修复原为实施动态牵拉力学刺激，植入12周后获取组织。
观察形成组织的大体观并进行力学分析，包括弹性模量，最大负荷，拉力强度；通过HE，Masson和天狼星红染色，偏振光观察构建组织的组织结构，采用透射电镜观察胶原原纤维的超微结构；利用免疫组化分析I型、III型和VI型胶原的表达情况，羟脯胺酸试剂盒检测胶原含量(参见图4)。
与通常的肌腱修复相比，使用本实施例构建的肌腱，其在12周时实验组构建的肌腱的弹性模量和最大负荷均高于正常修复的肌腱，拉力强度与正常修复的肌腱接近。

Claims (10)

1.一种体外构建肌腱组织的方法，其特征在于对细胞施以电刺激，使细胞发生迁移、排列、增殖和成肌腱分化，提高所制成肌腱组织的力学强度。
2.根据权利要求1所述的体外构建肌腱组织的方法，其特征在于所述的电场由生物材料在受到外力作用而产生。
3.根据权利要求2所述的体外构建肌腱组织的方法，其特征在于所述的生物材料，系由纤维材料经平行排列形成的束状拓扑结构，牵拉力作用下具有电活性。
4.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于所述的生物材料为聚左旋乳酸。
5.一种生物材料在体外构建肌腱组织中的应用，其特征在于所述的生物材料具有电活性，能产生电信号，对接种于其上的细胞施以电场，促进细胞发生迁移、排列、增殖和成肌腱分化，提高所形成肌腱组织的力学强度。
6.一种支架，其特征在于包括生物材料，所述的生物材料具有平行排列形成的束状拓扑结构，具有电活性，能产生电信号。
7.根据权利要求6所述的支架，其特征在于还包括细胞，所述的细胞接种于所述的生物材料上。
8.一种制取权利要求1～4之一所述生物材料的方法，其特征在于：
将PLLA溶解于六氟异丙醇溶液中，搅拌至均匀，将PLLA溶液进行静电纺丝，纺丝时，纺丝液在电场力的作用下，形成纳米纤维。纳米纤维落入水中后，在涡旋的作用下，抱合成一束纱，即为纤维材料；
从转轴上取下纤维材料，滴加少许双蒸水，放入-80℃冰箱里预冻2小时。预冻之后，纳米纱冰冻成一整块平板，再置于冷冻干燥机，过夜冷冻干燥，即可得到最终成型的纳米纱三维支架。纳米纱三维支架保存在真空干燥箱中。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述PLLA溶液的浓度为8w/v％。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述纺丝电压为15千伏，电场距离150毫米，纺丝液注射速率1.0毫升/小时。
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