CN108295310A - 一种导电型组织工程支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种导电型组织工程支架,支架由生物相容性材料制成,其内部取向性设有导电纤维或由导电纤维构成的网络,所述导电纤维由聚吡咯导电外壳和丝素蛋白内芯组成。本发明所述支架稳定性好,力学性能优越,电活性维持长久,能够实现定向导电,电刺激能促进神经细胞的生长与分化,定向的纤维排列结构能够定向引导神经轴突生长,促进神经再生。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料领域,具体涉及一种导电型组织工程支架及其制备方法和应用。
背景技术
周围神经损伤是临床上常见的一个问题,常导致永久性残疾。周围神经损伤典型的症状是感觉和运动功能缺陷,可能会导致患者完全瘫痪或顽固性神经性疼痛。与中枢神经系统中的神经不同的是,周围神经能够在一定程度上自发再生。目前,自体神经移植仍然是“金标准”,但是由于二次手术、有限的可用性、尺寸不匹配等缺点限制了自体神经移植的广泛应用。因此神经组织工程是一个很有前途的方法,制备一种能够代替自体神经移植的生物神经导管移植物的研究十分有价值,仍然是一项具有挑战性的任务。理想生物材料支架应具备以下条件:良好生物相容性、高孔隙率、较高的机械强度、可塑性和生物可降解性等优良特性。
为了提高神经组织工程材料和人工神经修复材料的医学应用价值,人们对使用导电高分子材料制备组织工程神经移植物进行了研究。导电高分子材料的表面特性,电荷浓度和可浸润性,可在电势存在下发生可逆变化这些特性赋予导电高分子材料在生物应用领域独特的优势。最近研究表明,生物材料不仅为组织和器官再生提供机械和三维结构的支撑,而且其自身的一些性能和因素还可以调控组织和器官的再生,尤其是材料的表面性能。生物材料的表面性能可以调控细胞的生长分化,所以制备具有精细三维结构的生物支架是目前治疗神经缺损最有希望的方法之一。
目前导电型组织工程材料及支架主要有三种类型:
(1)将生物相容性材料与导电高分子材料复合后制备组织工程材料。例如CN201610549724.0公开了一种丝胶导电水凝胶,其由丝胶蛋白交联而成,所述丝胶导电水凝胶中包含0.0125-0.0833g/mL的丝胶蛋白和0.01-0.1mg/mL的碳纳米微管。CN200810071141.7公开了具生物活性水凝胶-导电聚合物纳米复合材料,为乙二醇-羟基酸嵌段共聚物与聚吡咯或聚苯胺的复合材料。CN201510532212.9公开了一种导电高分子纳米神经导管材料的制备方法,将PLA的氯仿溶液与Ppy与十二烷基硫酸钠、甲醇与水的混合溶液混合,再加入氧化铁溶液,氧化聚合后得到氧化聚合物;将所述的氧化聚合物漂洗后沉淀,溶解并静电纺丝,得到导电高分子纳米神经导管材料。《取向性生物导电型材料的制备及对神经再生的影响》(交通医学2017年第31卷第1期)将再生丝素蛋白溶液与石墨烯混合制成石墨烯复合膜将丝素膜置于两层石墨烯膜之间,各膜之间的空隙用生物胶水进行粘贴可得两层的取向性石墨烯复合膜。以石墨烯取向性材料作为基质,表面用静电纺纯丝素处理,可形成在衬底纳米纤维表面下具有取向性的结构。还可以以再生丝素蛋白溶液加入明胶和胶原以增强其黏度和韧性,再加入石墨烯粉末,混合后采用3D打印技术制得取向性复合材料。上述方法,生物相容性材料与导电高分子材料混合后存在取向性以及尺寸大小难以控制,所制得的导电复合材料,稳定性差,导电率低问题。
(2)将生物相容性材料制备组织工程支架后,使用导电高分子材料在其表面形成导电层。CN201520609687.9公开了一种周围神经修复用组织工程诱导支架,包括诱导支架本体,诱导支架设有力学性能层以及设置在力学性能层表层的导电层。CN201110054237.4公开了一种聚吡咯包覆胶原-丝素蛋白平行丝导电复合膜的制备方法,配制吡咯和聚谷氨酸混合溶液,在位聚合吡咯包覆胶原-丝素平行电纺丝膜,得到聚谷氨酸掺杂聚吡咯包覆胶原-丝素蛋白平行丝导电复合膜。CN201610260848.7公开了一种可促进外周神经组织修复的连接有细胞外基质的导电平行复合纤维膜及其制备方法,采用静电纺制丝平行纤维、电化学氧化包覆导电聚吡咯、人皮肤纤维细胞培养及曲通X-100/氨水混合液裂解细胞三步法制备连接有细胞外基质的芯-壳结构的导电平行复合纤维膜。CN201610806967.8公开了了一种基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架的制备方法,制备得到柞蚕丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯复合纳米纤维后浸渍在氧化石墨烯分散液中,得到基于石墨烯导电型复合纳米纤维神经组织工程支架。上述具有导电层和生物相容性材料内核结构的组织工程材料,存在被吸附的导电材料易于分离,结构完整难以维持,使材料失去活性的问题。
(3)以导电高分子聚合物作为内核,其表面具有生物相容性材料的外壳。CN201210280734.0公开了一种以可降解聚合物为壳,导电聚合物为核的具有核-壳结构的电活性复合纤维及其组织工程支架的制备方法,以可降解聚合物纺丝液为壳,导电聚合物喷射液为核,用同轴共纺装置把静电纺丝技术和静电喷射技术结合起来制备具有核-壳结构的电活性导电高聚物/可降解聚合物复合纤维及其复合纤维支架。上述组织工程材料及方法存在导电复合材料力学性能较差,稳定性差,导电率低问题。
因此,现有技术下尚未有理想的导电型组织工程支架满足实际临床需要。
发明内容
本发明针对现有技术不足,提供了一种导电型组织工程支架。本发明所述支架将聚吡咯单体溶胀扩散到天然生物材料基体丝素蛋白中,再让吡咯原位聚合,可以得稳定性好,力学性能优越,电活性维持长久的复合材料。本发明所述组织工程支架生物相容性好、能够实现定向导电,电刺激能促进神经细胞的生长与分化,定向的纤维排列结构能能够定向引导神经轴突生长,促进神经再生。
本发明具体技术方案如下:
一种导电型组织工程支架,支架由生物相容性材料制成,其内部取向性设有导电纤维或导电纤维构成的网络,所述导电纤维由聚吡咯导电外壳和丝素蛋白内芯组成。
本发明所述生物相容性材料选自聚乳酸、聚乙醇酸、胶原、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、丝素蛋白、角蛋白中的一种或者其中几种混合物。
本发明所述的支架,优选丝素蛋白内芯直径为50μm-500μm。
本发明的一个优选方案,所述支架内部导电纤维沿支架径向平行排列,或交错排列形成导电纤维网络。
本发明所述支架进一步可以包覆有营养因子和/或细胞。所述细胞包括来源于自体或异体,为雪旺细胞、成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞、皮肤干细胞中的一种或几种组合。包覆在支架表面的细胞密度为1×106-1×108/ml。所述营养因子为神经生长因子(NGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3(NT-3)、胶质细胞源神经营养因子(GDNF)中的一种或几种。所述营养因子在支架材料上的量为1μg/g-10mg/g。
本发明的另一目的在于提供本发明所述导电型组织工程支架的制备方法,包括如下步骤:
(1)制备丝状丝素蛋白内芯;
(2)将吡咯与盐酸的混合溶液与三氯化铁溶液混匀,与步骤(1)制备的丝素蛋白内芯反应,聚吡咯沉积在丝素蛋白内芯上,形成聚吡咯导电外壳;
(3)将步骤(2)制得的导电纤维或导电纤维网络外层包覆生物相容性材料,并使其具有合适的支架结构和形状。
本发明所述的制备方法,步骤(1)可使用静电纺丝技术、三维打印技术或基于静电纺丝技术的三维打印技术制备丝状丝素蛋白内芯。优选使用三维打印技术。优先参数为:气压0.1MPa,速度15mm/s,间距1.4-1.6mm。
优选的,步骤(2)将摩尔比为1:1的吡咯与盐酸在4℃孵育,之后按体积比1:1加入氯化铁溶液,孵育2-24小时。
一个具体的实施方案,将吡咯在129-131℃下真空蒸馏,直到变成无色液体。分别制备14mM吡咯,14mM盐酸和38mM氯化铁溶液。首先将14mM吡咯溶液与14mM盐酸溶液按照1:1的比例混匀,超声波处理30s,放入4℃孵育1小时,将混合溶液与38mM氯化铁溶液按照体积1:1的比例混匀,在取向性排列的丝素蛋白支架上聚合和沉积,聚吡咯沉积在丝状丝素蛋白内芯后具有导电性。
本发明所述的制备方法,步骤(3)可采用筑模法、涂层法、静电纺丝技术、三维打印技术中的一种或几种方法在制得的导电纤维或导电纤维网络外层包覆生物相容性材料,并使其具有合适的支架结构和形状。优选的,生物相容性材料选择丝素蛋白,采用静电纺丝技术制备。
当本发明所述支架生物相容性材料及丝素蛋白内芯,优选丝素蛋白溶液是脱丝胶后的家蚕丝(20%)溶解在CaCl2/H2O/C2H5OH(摩尔比1:8:2)的三元溶剂体系中所得。
用于静电纺的丝素蛋白是家蚕丝脱丝胶经过透析后得到的再生家蚕丝素溶液,经过完全风干后制备所得。家蚕脱丝胶的方法是通过0.05%的无水碳酸钠溶液脱胶三次,每次30min,最后洗脱至中性后风干。将脱丝胶后的丝素(20%)溶解在CaCl2/H2O/C2H5OH的三元溶剂体系中,在透析袋透析三天后抽滤,在硅胶板中风干成膜。用甲酸溶解制备16%的溶液进行静电纺。
本发明所述的制备方法,所述步骤(3)可将步骤(2)制得的导电纤维或导电纤维网络外层包覆生物相容性材料后形成膜状,用卷曲法将膜卷成导管,干燥成型。
本发明一个优选的制备方法:将脱丝胶后的丝素溶于三元溶液中,在平板上3D打印取向性排列的丝素线,用无水乙醇处理后,与吡咯进行聚合反应,聚吡咯沉积在丝素内芯上具有导电性,形成导电纤维或导电纤维网络。在有取向性的导电纤维或导电纤维网络模板基础上,进行静电纺丝(丝素蛋白的甲酸溶液,纺出包覆导电纤维或导电纤维网络的丝素蛋白膜,经无水乙醇处理后,用卷曲法将丝素蛋白膜卷成导管,(可再静电纺一层丝素蛋白,提高其力学性能)。无水乙醇处理后,干燥成型。
本发明的另一目的在于提供本发明所述导电型组织工程支架在制备人工神经移植物中的应用。
有益效果:
1、本发明采用“壳-芯”结构的导电纤维,具有优越的力学性能,能够满足组织工程神经移植物的力学性能要求。
2、本发明聚吡咯壳层的形成采用原位聚合的方法,将聚吡咯单体溶胀扩散到天然生物材料基体中,再让吡咯原位聚合,所得复合材料生物稳定性高,电活性维持长久。
3、本发明技术方案导电纤维的取向性结构能引导神经细胞生长,加快神经再生。
4、静电纺丝制得的支架材料具有高孔隙率、比表面积大、纳米级的纤维、均一性好等优点,模拟天然细胞外基质,促进细胞迁移和增殖。
5、本发明制备流程简单有效,能快速有效的得到生物相容性好、定向导电的丝素纳米纤维导管,为组织工程神经移植物提供有效的参考。
附图说明
图1为导电纤维稳定性考察结果。
图2为导电纤维力学性能考察结果。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤,但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语,除非另有说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解,该实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1材料的选择和制备方法
一、导电纤维结构的设计
1.本发明所述“壳-芯”结构的导电纤维的制备
(1)家蚕丝素的制备,脱丝胶:
称取家蚕丝(含丝胶)50g,在电磁炉中煮沸2L的三蒸水,在水沸后加入1g无水碳酸钠,将称好的家蚕丝放入沸水之中,从水沸时开始计时30min,煮的过程中保持水沸的状态,但是注意沸水溢出,过程中可用玻璃棒不时地搅拌。第一遍煮好之后,将蚕丝从水中取出,放入三蒸水中洗涤3-4次后重复上述操作共三次。最后一次脱丝胶后,用三蒸水反复洗脱至中性,确保蚕丝表面没有残留碱性物质。最后将脱丝胶的蚕丝放入通风橱中风干,以备用。
(2)家蚕丝素膜的制备:
称取脱完丝胶的丝素蛋白20g溶于CaCl2/H2O/C2H5OH的三元溶剂体系中,其中无水CaCl2是38.54g,三蒸水48ml,无水乙醇38.8ml。盖上保鲜膜(防止乙醇蒸发)之后在75±2℃的恒温浴中搅拌溶解,完全溶解后加入丝素蛋白,直至丝素蛋白完全溶解(30min左右)。丝素溶液室温静置,后置于透析袋中于室温下透析3天。将透析好的丝素水溶液过滤后倒入含有硅胶的玻璃皿中,在室温下风干成膜。
(3)3D打印制备丝素蛋白内芯
气压0.1MPa,速度15mm/s,间距1.4-1.6mm,打印取向性排列,如径向平行排列,或交错排列形成网络的丝素蛋白内芯,在无水乙醇里处理后待用。
(4)导电纤维的制备
吡咯在129-131℃下真空蒸馏,直到它变成无色液体。分别制备14mM吡咯、14mM盐酸和38mM氯化铁溶液。首先将14mM吡咯溶液与14mM盐酸溶液按照1:1的比例混匀放入4℃孵育1小时,将吡咯与盐酸的混合溶液与38mM三氯化铁溶液按照1:1的比例混匀,与3D打印的丝素蛋白内芯室温反应2-24h,聚吡咯沉积在丝素蛋白内芯上,形成黑色特征的聚吡咯外壳,具有导电性。
2.对照组:无丝素蛋白内芯的聚吡咯导电纤维的制备
吡咯在129-131℃下真空蒸馏,直到它变成无色液体。分别制备14mM吡咯、14mM盐酸和38mM氯化铁溶液。首先将14mM吡咯溶液与14mM盐酸溶液按照1:1的比例混匀放入4℃孵育1小时,将吡咯与盐酸的混合溶液与38mM三氯化铁溶液按照1:1的比例混匀,直接进行3D打印,形成无丝素蛋白内芯的聚吡咯导电纤维。
3.稳定性测试
稳定性评价:将“壳-芯”结构的导电纤维以及无丝素蛋白内芯的聚吡咯导电纤维浸泡在水或DMEM中1到30天后,分别在不同时间点取样,将样品干燥后采用光镜或电镜的方法对样品的表面形貌进行观察,统计结构得以维持的样品数量,对样品的个数进行测量,计算获得样品的稳定度。结果如图1所示。结果显示无丝素蛋白内芯的聚吡咯导电纤维表面有小的碎片和分层,稳定性较差;“壳-芯”结构的导电纤维结构相对保持完整,而且在两种溶剂中能更好的保持稳定。
4.体外力学试验
本实验采用拉伸试验对“壳-芯”结构的导电纤维以及无丝素蛋白内芯的聚吡咯导电纤维进行力学性能测试。为了方便试验进行,样品制备成膜状测试,将样品裁剪为20mm×20mm×1mm(长×宽×高)的大小。另外为了体外模拟体内的环境,因此实验在样品保持湿润的状态下进行。将其浸泡在纯水中4h,之后将不同的复合导电纤维膜取出,用千分尺精确量取样品厚度,然后使用电子万能试验机(TFW-58)进行样品的拉伸试验,试验在室温条件下以5mm/min的速度进行。
结果如图2所示,结果显示,无丝素蛋白内芯的聚吡咯导电纤维抗拉力强度很低,所承受的拉力只有0.58N,而“壳-芯”结构的导电纤维膜的抗拉力能增强,抗拉力能约为无丝素蛋白内芯的聚吡咯导电纤维膜的2倍,结果表明“壳-芯”结构能够增强复合支架的力学拉伸性。
二、导电纤维材料的筛选
参照上述“壳-芯”结构的导电纤维的制备方法,选择不同的导电材料作为外壳,不同的天然材料作为内芯,制备不同的导电纤维,考察所得导电纤维材料稳定性和力学性能。结果如表1所示。结果表明聚吡咯外壳,丝素蛋白内芯的导电纤维结构相较于其他材料组合,生物稳定性高,电活性维持长久。
表1导电纤维材料的筛选
。
三、导电纤维尺寸的筛选
调节3D打印参数制备内芯直径为40μm、80μm、120μm、180μm的丝素蛋白内芯,参照上述导电纤维的制备方法,使聚吡咯沉积在丝素蛋白内芯上(反应时间12小时)。测定其电导率,结果如表2所示。
表2
直径(μm) | 40 | 80 | 120 | 180 |
导电性(s.cm-1) | 0.45±0.01 | 0.83±0.01 | 1.25±0.02 | 1.56±0.02 |
结果表明导电性随丝素蛋白内芯直径的增大而增大。
参照上述导电纤维的制备方法,考察反应时间1、6、12、18、24、30小时,导电纤维的导电性。结果如表3所示。结果表明,虽然在一定范围内反应时间延长会增加导电性,但是反应时间延长会导致非特异性区域的聚吡咯外层的形成,优选聚合时间为12h。
表3
。
四、导电型组织工程支架的制备
将3D打印并反应好的可定向导电的材料放于静电纺丝机上,将风干后的丝素膜溶于甲酸配制成16%(w/w)的静电纺丝溶液,电压18-20KV,挤压速度1ml/h,接收装置距离喷头16-18cm,接收滚轴20cm,转速4500r,然后进行静电纺取向排列的丝素蛋白纳米纤维,纳米纤维的排列方向与导电线的方向一致。放入无水乙醇中处理后用卷曲法制成导管,导管晾干之后在外层再进行一层静电纺,处理之后进行冷冻干燥使导管成型,导管可长期保存。
Claims (10)
1.一种导电型组织工程支架,其特征在于支架由生物相容性材料制成,其内部取向性设有导电纤维或由导电纤维构成的网络,所述导电纤维由聚吡咯导电外壳和丝素蛋白内芯组成。
2.如权利要求1所述的支架,其特征在于丝素蛋白内芯直径为50 μm-500μm。
3.如权利要求1所述的支架,其特征在于所述导电纤维沿支架内部径向平行排列,或交错排列形成导电纤维网络。
4.如权利要求1所述的支架,其特征在于所述支架表面还包覆有营养因子和/或细胞。
5.如权利要求1-4任一项所述导电型组织工程支架的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)制备丝状丝素蛋白内芯,并取向性排列;
(2)将吡咯与盐酸的混合溶液与三氯化铁溶液混匀,与步骤(1)制备的丝素蛋白内芯反应,聚吡咯沉积在丝素蛋白内芯上,形成聚吡咯导电外壳;
(3)将步骤(2)制得的导电纤维或导电纤维网络外层包覆生物相容性材料,并使其具有合适的支架结构和形状。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于步骤(1)使用静电纺丝技术、三维打印技术或基于静电纺丝技术的三维打印技术制备丝状丝素蛋白内芯。
7.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于步骤(2)摩尔比为1:1的吡咯与盐酸在4℃反应,之后按体积比1:1加入氯化铁溶液,孵育2-24小时。
8.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于步骤(3)采用筑模法、涂层法、静电纺丝技术、三维打印技术中的一种或几种制备而成。
9.如权利要求5所述的制备方法其特征在于所述步骤(3)将步骤(2)制得的导电纤维或导电纤维网络外层包覆生物相容性材料成膜状,用卷曲法将膜卷成导管,干燥成型。
10.如权利要求1-4任一项所述导电型组织工程在制备人工神经移植物中的应用。
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