CN110227184A - 差异性组织工程化神经及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种差异性组织工程化神经，包括类运动神经和类感觉神经，所述类运动和类感觉神经分别包括类运动神经外管和外管内的类运动神经纤维以及类感觉神经外管和外管内的类感觉神经纤维，类运动和类感觉神经外管表面或孔隙内分别包含有运动神经来源和感觉神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞，类运动和类感觉神经纤维表面或孔隙内分别包含有跨突触信号分子Neuroligin‑1和Neuroligin‑2。本发明选择性地使用Neuroligin‑1特异性地促运动神经元突触重塑，Neuroligin‑2特异性地促感觉神经元突触重塑，提高了运动神经细胞和感觉神经细胞的修复效率。

Description

差异性组织工程化神经及应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种差异性组织工程化神经，可差异性调控运动神经和感觉神经的修复。
背景技术
周围神经损伤是临床常见病，随着社会经济发展以及人口结构老龄化，意外事故造成的急性创伤与慢性退行性疾病导致周围神经病变呈大幅上升趋势。周围神经损伤导致患者相应部位运动与感觉功能受损，受损后功能的恢复情况主要取决于再生神经轴突对特定运动和感觉通路的精准选择性导向生长。临床上，神经修复以断端无张力直接缝合、自体或异体神经移植、以及通过组织工程化神经移植物等方式为主。由于断端直接缝合只适用于不太严重的局部创伤，自体或异体神经移植实际操作中的诸多不便与弊病，目前，周围神经修复的主要研究方向是探索构建合适的组织工程化神经。
正常生理状态下，周围神经系统的运动、感觉神经纤维在相应的神经束膜内呈一定方向性的有序生长。而神经损伤后，若在损伤局部桥接单纯材料制成的导管，运动和感觉神经纤维的再生方式是无序和混乱的，存在神经纤维错接率。并且，即使后期神经纤维最终找到支配的靶器官，也已严重影响了神经再生的速度。更为严重的是，远端神经纤维末梢的效应器官由于长期失去神经支配，功能已无法完全恢复，例如靶肌肉的萎缩过程就是不可逆的。因此，在再生的早期阶段即予以适当干预，促使运动与感觉神经纤维的精准有序生长，能提高周围神经再生的速度和效率。
中国专利文献CN102908207A公开了一种基于生物打印技术制备的组织工程神经移植物，包括外管和管内纳米纤维支架，所述外管直径1-9mm，壁厚为0.5-1mm，所述管内纳米纤维支架的直径为0.1mm，支架的根数为5-30根，支架在管内均匀分布，支架内部或者表面和外管内外表面还包覆有营养因子和/或细胞。中国专利文献CN104623738A公开了一种带有悬丝纤维支架的组织工程神经移植物，包括导管和管内纤维支架，其特征在于每根纤维支架的沿纤维长度方向上设有若干根悬丝与导管内壁相连，纤维支架通过悬丝悬挂于导管内。这些研究利用生物打印技术，使用纳米纤维作为神经细胞生长“桥梁”，保证神经细胞能够沿着纤维支架定向生长。但是在实际周围神经修复过程中，并不能很好地区分运动和感觉神经，仍然存在神经纤维错接的问题。
发明内容
本发明根据周围神经独特的解剖结构进行设计，构建一种差异性组织工程化神经，可差异性调控运动神经和感觉神经的修复。
本发明具体技术方案如下：
一种差异性组织工程化神经，包括类运动神经和类感觉神经，
所述类运动神经包括类运动神经外管和外管内的类运动神经纤维，所述类运动神经外管表面或孔隙内包含有运动神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞，所述类运动神经纤维表面或孔隙内包含有跨突触信号分子Neuroligin-1；
所述类感觉神经包括类感觉神经外管和外管内的类感觉神经纤维，所述类感觉神经外管表面或孔隙内包含有感觉神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞，所述类感觉神经纤维表面或孔隙内包含有跨突触信号分子Neuroligin-2。
本发明研究发现表明Neuroligin-1能特异性地促运动神经元突触重塑，Neuroligin-2能特异性地促感觉神经元突触重塑，将两者分别应用于运动和感觉神经再生能够获得非常好的神经修复效果。
优选的，所述运动神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞与感觉神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞的数量比为1：1～5。为了保证本发明中类运动神经纤维和类感觉神经纤维上神经细胞的再生速度一致，更优选运动神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞与感觉神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞的数量比为1：3。
一个优选的方案，Neuroligin-1与Neuroligin-2的质量比为1：1。
优选的，本发明所述所述类运动神经纤维和/或类感觉神经纤维上还进一步包含有跨突触信号分子Neurexin-1β，优选类运动神经纤维上Neuroligin-1与Neurexin-1β的质量比为1：0.01-10，更优选1：5；所述类感觉神经纤维上Neuroligin-2与Neurexin-1β的质量比为1：0.01-10，更优选1：5。
本发明所述的差异性组织工程化神经可采用现有技术公开的技术进行制备，如铸模、冷冻干燥成型、静电纺丝技术、三维生物打印技术等，优选三维生物打印技术。
本发明可以采用生物打印技术，以运动、感觉神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞、跨突触信号分子Neuroligin-1、Neuroligin-2、Neurexin-1β(或制成含有跨突触信号分子的微球)与运动神经纤维和感觉神经纤维材料作为原材料进行打印，也可以将运动、感觉神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞、跨突触信号分子Neuroligin-1、Neuroligin-2、Neurexin-1β(或制成含有跨突触信号分子的微球)分别打印、涂覆或被动吸附在神经纤维上相应的位置。
本发明一个优选的方案，可以将跨突触信号分子Neuroligin-1和Neuroligin-2和Neurexin-1β包埋于微球(优选缓释微球)中，提高其稳定性、保证生物活性以及在组织工程化神经中的粘附性。
一个优选的方案为采用PLGA微球，制备方法如下：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，乳酸：乙醇的摩尔比为53:47，分子量[MW]25kDa)。PLGA微球通过水/油/水复乳法制备。将100mg的PLGA溶于1mL的二氯甲烷中，然后乳化成3mL7％(w/v)多聚聚乙烯醇(PVA)水溶液，超声1min制成第一步的乳液。然后，将上述溶液加入50mL的1％(w/v)多聚聚乙烯醇(PVA)水溶液中(含2％异丙醇)，再次超声3min，形成第二步的乳液。室温下，将上述第二步的乳液缓慢搅拌过夜，让残余的二氯甲烷挥发干净。通过13,000rpm,5min,4℃离心沉淀得到PLGA微球。用ddH2O清洗两遍，加入0.4mLddH2O重悬以备用。
本发明所述的类运动神经和类感觉神经为神经导管结构，包括外管和管内类运动神经纤维和类感觉神经纤维，优选外管直径1-9mm，壁厚为0.5-1mm，所述类运动神经纤维和类感觉神经纤维的直径为0.01-0.1mm，数量为5-30根。
本发明所述的差异性组织工程化神经，由可降解聚合物材料制成，选自聚乳酸、聚乙醇酸、胶原、明胶、壳聚糖、丝素蛋白中的一种或者其中几种。
本发明一个优选的方案，所述类运动神经和类感觉神经呈平行、Y型，树枝型，齿梳型中的一种或几种形状多分支样排布。可以更好地在空间上保证运动神经和感觉神经相对分离，提高桥接的准确性。可进一步使用外套管、悬丝、支架等方式设计排布类运动神经和类感觉神经的相对位置，使其具有固定成型的形状。
本发明另一目的在于提供本发明所述的组织工程化神经在周围神经缺损修复中的应用。
本发明优点：
本发明首次发现不同的Neuroligin对运动神经细胞和感觉神经细胞的不同作用，选择性地使用Neuroligin-1特异性地促运动神经元突触重塑，Neuroligin-2特异性地促感觉神经元突触重塑，提高了运动神经细胞和感觉神经细胞的修复效率。
本发明进一步探究了Neuroligin-1与Neuroligin-2促进运动神经细胞和感觉神经细胞的修复速度，使本发明所述的组织工程化神经中的运动神经和感觉神经再生速度一致，提高周围神经再生的速度。
本发明运用组织工程学的研究方法，于周围神经损伤局部模拟缓释适合运动感觉神经元轴突特异生长的突触相关蛋白，结合施万细胞与成纤维细胞组成的3D运动感觉微环境，构建解剖结构/局部微环境双重仿生的组织工程化神经，有利于提高周围神经再生的速度和效率。
附图说明
图1免疫细胞化学染色显示Neuroligin-1与Neuroligin-2分别作用运动和感觉神经元对突触形成的影响，图1A为Neuroligin-1和Neuroligin-2分别作用于运动神经元和感觉神经元，免疫细胞化学染色观察突触相关蛋白Synaptophysin和PSD-95的分布和表达情况，图1B为Neuroligin-1和Neuroligin-2分别作用于运动神经元和感觉神经元，突触前膜蛋白Synaptophysin与突触后膜蛋白PSD-95的突触面积占整个神经突起面积百分比的柱形统计图(**vs.Neuroligin-1in sensory neuron；##vs.Neuroligin-2in motor neuron,P<0.01)。
图2免疫细胞化学染色显示Neurexin-1β与Neuroligins具有与剂量相关的协同作用，图2A为Neurexin-1β以及Neurexin-1β分别与Neuroligin-1和Neuroligin-2联合作用于运动神经元和感觉神经元，免疫细胞化学染色观察突触相关蛋白Synaptophysin和PSD-95的分布和表达情况，图2B为Neurexin-1β以及Neurexin-1β分别与Neuroligin-1和Neuroligin-2联合作用于运动神经元和感觉神经元，突触前膜蛋白Synaptophysin与突触后膜蛋白PSD-95的突触面积占整个神经突起面积百分比的柱形统计图(**vs.Neuroligin-1 200ng/mL+Neurexin-1β1μg/mLinmotor neuron；##vs.Neuroligin-2 200ng/mL+Neurexin-1β1μg/mLin sensory neuron,P<0.01)。
图3本发明所述差异性组织工程化神经示意图。
图4本发明实施例4坐骨神经缺损模型术后12周，各实验组电生理学检测运动功能恢复情况，图4A为各实验组CMAP代表图，图4B为各实验组CMAP占自体神经组(Autograft)百分比统计结果。(n＝6,*vs.optimized TENG,P<0.05；**vs.optimized TENG,P<0.01)。
图5本发明实施例4坐骨神经缺损模型术后12周，各实验组痛觉检测感觉功能恢复情况，图5A为各实验组机械性疼痛检测结果，(n＝6,*vs.optimized TENG,P<0.05)；图5B为各实验组热敏性疼痛检测(n＝6,*vs.optimized TENG,P<0.05；**vs.optimized TENG,P<0.01)。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1考察Neuroligin-1与Neuroligin-2运动和感觉神经元突触的促进作用
(1)运动神经元的培养：将孕15d-16d的SD大鼠，解剖镜下去除脊髓腹侧被膜、背根神经节和血管，小心分离出胎鼠腹侧脊髓，置于盛有冰冷解剖液的培养皿中。用显微剪剪成0.5cm3大小的组织块后转移至15mL离心管中。加入0.25％胰酶及200U/ml DNA酶，37℃消化30min后，加入DMEM+10％FBS终止消化，1 000r/min离心5min，弃上清。加入5mL的Optiprep分离液，3000r/min密度梯度离心15min后，离心管中的液体分为3层，其中中间层含有脊髓运动神经元。小心将中间层吸出至一15mL离心管，加入3mL培养基1000r/min离心5min，弃上清以去除细胞碎片。加入DMEM+10％FBS重悬细胞，将细胞悬液加入到未经包被的6孔板，差速贴壁1h，将未贴壁细胞收集离心，加入neurobasal完全培养基(97％Neurobasal+2％B27+1％GluMAX)重悬细胞。将细胞悬液按1×105/mL种植到预先包被有多聚赖氨酸的24孔板中。12h换液1次，之后每3d半量换液。
(2)感觉神经元的培养：将孕17d-18d的SD大鼠，取出胎鼠置于冰上，解剖镜下打开椎管，移除脊髓，小心取出L4-6背根神经节，尽量去除背根神经节的外膜，修剪神经根。将背根神经节移入0.25％胰酶和0.5g/L胶原酶中，37℃消化30min。加入DMEM+10％FBS终止消化，1 000r/min离心5min，弃上清。加入Neurobasal完全培养基(97％Neurobasal+2％B27+1％GluMAX)重悬细胞。将细胞悬液按1×105/mL种植到预先包被有多聚赖氨酸的24孔板中。培养的第3天，加入20mg/L5-氟尿嘧啶抑制增殖类非神经元细胞，维持48h后更换成Neurobasal完全培养基，之后每3d半量换液。
在运动神经元和感觉神经元分别在体外培养10d之后，各分为两组，分别加入Neuroligin-1(终浓度200ng/mL)与Neuroligin-2(终浓度200ng/mL)继续培养24h。用0.01MPBS(pH7.2)清洗两遍。4％多聚甲醛室温固定10min，封闭液室温封闭1h，一抗mouse anti-Synaptophysin polyclonal antibody(浓度为1:600)，rabbit anti-PSD-95polyclonalantibody(浓度为1:800)，4℃放置过夜(实验中设不加一抗的阴性对照)。0.01M PBS(pH7.2)清洗三遍。TRITC donkey anti rabbit IgG(浓度为1:200)，FITC donkey-anti-mouseIgG(浓度为1:200)室温2h。0.01M PBS(pH 7.2)清洗两遍。Hoechst(5μg/ml)染细胞核。荧光封片液封片后激光共聚焦显微镜(LEICA-SP2,Germany)下观察。
免疫细胞化学染色结果如图1所示，图1A为Neuroligin-1(终浓度200ng/mL)和Neuroligin-2(终浓度200ng/mL)分别作用于运动神经元和感觉神经元，免疫细胞化学染色观察突触相关蛋白Synaptophysin和PSD-95的分布和表达情况，图1B为Neuroligin-1和Neuroligin-2分别作用于运动神经元和感觉神经元，突触前膜蛋白Synaptophysin与突触后膜蛋白PSD-95的突触面积占整个神经突起面积百分比的柱形统计图。结果显示，Neuroligin-1作用运动神经元后，突触前膜蛋白Synaptophysin(绿色)与突触后膜蛋白PSD-95(红色)的突触面积占整个神经突起面积的75％以上，而Neuroligin-1作用于感觉神经元后，突触前膜蛋白Synaptophysin(绿色)与突触后膜蛋白PSD-95(红色)的突触面积占整个神经突起面积的33％，提示Neuroligin-1仅对运动神经元的突触形成起到特异性的促进作用。
Neuroligin-2作用感觉神经元后，突触前膜蛋白Synaptophysin(绿色)与突触后膜蛋白PSD-95(红色)的突触面积占整个神经突起面积的68％以上，而Neuroligin-2作用于运动神经元后，突触前膜蛋白Synaptophysin(绿色)与突触后膜蛋白PSD-95(红色)的突触面积占整个神经突起面积的25％，提示Neuroligin-2仅对感觉神经元的突触形成起到特异性的促进作用。
实施例2考察联合使用Neurexin-1β与Neuroligin-1，Neuroligin-2对突触形成的促进作用
运动神经元和感觉神经元分别在体外培养10d之后，按照如下分组，分别向运动和感觉神经元培养基中加入Neurexin-1β与Neuroligin-1，Neuroligin-2：
运动神经元组：
(1)Neurexin-1β(终浓度200ng/mL)+Neuroligin-1(终浓度200ng/mL)；
(2)Neurexin-1β(终浓度1μg/mL)+Neuroligin-1(终浓度200ng/mL)；
(3)Neurexin-1β(终浓度1μg/mL)。
感觉神经元组：
(4)Neurexin-1β(终浓度200ng/mL)+Neuroligin-2(终浓度200ng/mL)；
(5)Neurexin-1β(终浓度1μg/mL)+Neuroligin-2(终浓度200ng/mL)；
(6)Neurexin-1β(终浓度1μg/mL)。
继续培养24h。免疫细胞化学染色结果如图2所示，图2A为分别将不同浓度的Neurexin-1β(终浓度1μg/mL)单独作用，或Neurexin-1β(终浓度1μg/mL或200ng/mL)分别与Neuroligin-1(终浓度200ng/mL)和Neuroligin-2(终浓度200ng/mL)联合作用于运动神经元和感觉神经元，免疫细胞化学染色观察突触相关蛋白Synaptophysin和PSD-95的分布和表达情况，图2B为将不同浓度的Neurexin-1β单独作用，或分别与Neuroligin-1和Neuroligin-2联合作用于运动神经元和感觉神经元，突触前膜蛋白Synaptophysin与突触后膜蛋白PSD-95的突触面积占整个神经突起面积百分比的柱形统计图。结果显示，(Neuroligin-1与Neurexin-1β质量比为1：1时对运动神经元，突触前膜蛋白Synaptophysin(绿色)与突触后膜蛋白PSD-95(红色)的突触面积占整个神经突起面积的33％，Neuroligin-1与Neurexin-1β质量比为1：5时对运动神经元，突触前膜蛋白Synaptophysin(绿色)与突触后膜蛋白PSD-95(红色)的突触面积占整个神经突起面积的90％。终浓度1μg/mL的Neurexin-1β对运动神经元突触前膜蛋白Synaptophysin(绿色)与突触后膜蛋白PSD-95(红色)的突触面积占整个神经突起面积的26％。
Neuroligin-2与Neurexin-1β质量比为1：1时对感觉神经元，突触前膜蛋白Synaptophysin(绿色)与突触后膜蛋白PSD-95(红色)的突触面积占整个神经突起面积的38％，Neuroligin-2与Neurexin-1β质量比为1：5时对感觉神经元，突触前膜蛋白Synaptophysin(绿色)与突触后膜蛋白PSD-95(红色)的突触面积占整个神经突起面积的85％。终浓度1μg/mL的Neurexin-1β对感觉神经元突触前膜蛋白Synaptophysin(绿色)与突触后膜蛋白PSD-95(红色)的突触面积占整个神经突起面积的23％。
结果表明联合使用Neurexin-1β与Neuroligin-1，Neuroligin-2对突触形成具有促进作用，特别是Neuroligin-1/Neuroligin-2与Neurexin-1β质量比为1:5时能发挥最佳的促进突触形成的协同作用。
实施例3本发明所述差异性组织工程化神经的构建
1.含Neuroligin-1，Neuroligin-2和Neurexin-1β重组蛋白缓释微球制备
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，乳酸：乙醇的摩尔比为53:47，分子量[MW]25kDa)。PLGA微球通过水/油/水复乳法制备。将100mg的PLGA溶于1mL的二氯甲烷中，然后乳化成3mL7％(w/v)多聚聚乙烯醇(PVA)水溶液，超声1min制成第一步的乳液。然后，将上述溶液加入50mL的1％(w/v)多聚聚乙烯醇(PVA)水溶液中(含2％异丙醇)，再次超声3min，形成第二步的乳液。室温下，将上述第二步的乳液缓慢搅拌过夜，让残余的二氯甲烷挥发干净。通过13,000rpm,5min,4℃离心沉淀得到PLGA微球。用ddH2O清洗两遍，加入0.4mLddH2O重悬以备用。
将制备好的0.4mL PLGA微球水溶液(10mg/mL)与聚醚酰亚胺(PEI,Mw1/4分子量25kDa)共溶于ddH2O，得到的溶液以不同的氮/磷比加入到PLGA微球溶液中，稍加涡旋。制得PEI修饰的PLGA微球溶液，室温孵育20min。通过13,000rpm,5min,4℃离心，沉淀得到用ddH2O清洗两遍，加入0.4mL ddH2O重悬。将1mLPEI修饰的PLGA微球水溶液(10mg/mL)分别与10μL 200ng/mL-1μg/mL的Neuroligin-1(Recombinant Rat NLGN1Protein，CreativeBiomart,Catalog#NLGN1-3995R)，200ng/mL-1μg/mL Neuroligin-2(Recombinant RatNLGN2Protein，Creative Biomart,Catalog#NLGN2-3996R)和200ng/mL-5μg/mL Neurexin-1β(Recombinant Rat Neurexin-1-beta,Cusabio,Catalog#Q63373)重组蛋白溶液混合，室温下孵育90min，分别形成Neuroligin-1，Neuroligin-2和Neurexin-1β重组蛋白PEI修饰的PLGA缓释微球。
2.参考《Comparative transcriptomic profiling of peripheral efferentand afferent nerve fibres at different developmental stages in mice》(Scientific Reports，2018,10；8(1):11990.doi:10.1038)、《Differential GeneExpression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts》(Frontiersin Neuroscience,2019，Jan 9；12:1016.doi:10.3389)、《Comparison in the biologicalcharacteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells》(Neuroscie Lett.,2012,521(1):57-61)制得大鼠运动神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞和感觉神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞。
3.3D生物打印构建差异性组织工程化神经
3.1.含缓释微球的丝素蛋白纤维制备
将Bombyx mori蚕丝常规经0.05M Na2CO3水溶液煮沸2次，每次30min以充分脱去蚕丝中的丝胶，经去离子水充分洗涤，室温晾干后得到丝素纤维SF，丝素纤维直径10-30μm，高温高压灭菌后备用。
应用天然、无毒、相容性良好的京尼平(genipin)作为生物交联剂，将含Neuroligin-1，Neuroligin-2和Neurexin-1β重组蛋白缓释微球固定到丝素蛋白纤维上，得到含Neuroligin-1，Neuroligin-2和Neurexin-1β重组蛋白缓释微球的丝素蛋白纤维。(可制备各跨突触信号分子含量相同的微球，通过调整缓释微球的使用量来控制神经纤维上Neuroligin-1，Neuroligin-2和Neurexin-1β的比例)其中，交联剂京尼平通过双官能团，分别与丝素蛋白和PLGA侧链氨基作用，将PEI修饰的PLGA缓释微球固定到丝素蛋白纤维上。
3.2以丝素蛋白/明胶溶液为载体，复合运动神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞和感觉神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞，制备出可供3D打印的功能性生物墨水。将大鼠坐骨神经支架数字化打印指令输出到喷墨式3D生物打印机，用功能性生物墨水打印出结构/微环境双重仿生的组织工程化神经移植物。
(1)制备丝素蛋白溶液。将蚕丝80℃水浴磁力搅拌至完全溶解于摩尔比CaCl2:H2O:C2H5OH＝1:8:2的三元溶液中。丝素溶液在40℃的LiBr水溶液中溶解2h，置于透析袋中通过去离子水连续透析3d，直至透析袋外去离子水的电导率基本不变，即得质量分数为4％的丝素蛋白溶液。
(2)制备明胶溶液。称取15g明胶材料，边搅拌边缓慢加入100g H2O中，充分溶胀后加热至80℃左右加速溶解，保温3h制得均质的高分子溶液，高压蒸汽灭菌后备用。
(3)制备丝素/明胶溶液与细胞培养液的混合液。将培养至第3代的施万细胞和成纤维细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后收集在15mL离心管，1000r/min离心5min，弃上清液，按体积比1:100将细胞浓度为5×105-5×106cells/mL细胞培养液移至丝素/明胶溶液，将运动神经来源的细胞搅拌均匀形成第一混合液A，感觉来源的细胞均匀形成第二混合液B。
(4)分别将第一混合液A和第二混合液B装入打印机两套不同的注射器中，设置打印机运行程序。微量泵控制功能性生物墨水稳定流量180μl/min，打印机喷嘴针头直径为200μm，细胞能自由通过不会发生堵塞；增压器脉冲频率15v，对细胞活力不会产生影响。打印机喷头在XY轴方向上的移动速度为1-50mm/s。打印机喷头在Z轴方向上的移动高度为100-500μm。打印机喷头在XY轴方向上打印完成后与在Z轴方向上开始打印前的时间间隔控制在2min内。
(5)在培养皿表面逐层打印细胞与丝素/明胶溶液的混合液。环境温度20℃，相对湿度65％；交联定型时间5-10min；管径1-9mm，壁厚为0.5-1mm。
(6)分别将含Neuroligin-1和Neurexin-1β重组蛋白缓释微球的丝素蛋白悬丝固定于3D打印的类运动神经外管内，将含Neuroligin-2和Neurexin-1β重组蛋白缓释微球的丝素蛋白悬丝固定于3D打印的类感觉神经外管内，形成Y型导管，如图3所示，组合构建得到差异性组织工程化神经。
实施例4本发明所述差异性组织工程化神经在修复神经缺损中的应用
1.制备坐骨神经缺损模型。
SPF级雄性SD大鼠随机分为5组(n＝6)：
(1)运动感觉混合组(Mixed)，将类运动和类感觉神经纤维混合于一传统的圆柱形生物材料为支架的神经导管内，不特别区分类运动和类感觉神经。其中，类运动和类感觉神经上的施万细胞和/或成纤维细胞数量比1:3，类运动神经纤维Neuroligin-1与Neurexin-1β质量比为1：5，类感觉神经纤维Neuroligin-2与Neurexin-1β质量比为1：5。细胞数量与因子比例均与优化的运动感觉特异组织工程化神经组(optimized TENG)相同，只是不特别区分类运动和类感觉神经，混合在于一传统导管内。
(2)运动感觉特异组织工程化神经组(TENG)，实施例3方法制得的Y型的支架将类运动和类感觉神经区分开，且类运动和类感觉神经上的施万细胞和/或成纤维细胞数量比1:1，类运动神经纤维Neuroligin-1与Neurexin-1β质量比为1：5，类感觉神经纤维Neuroligin-2与Neurexin-1β质量比为1：5。
(3)优化的运动感觉特异组织工程化神经组(optimized TENG)，实施例3方法制得的Y型的支架将类运动和类感觉神经区分开，且类运动和类感觉神经上的施万细胞和/或成纤维细胞数量比1:3，类运动神经纤维Neuroligin-1与Neurexin-1β质量比为1：5，类感觉神经纤维Neuroligin-2与Neurexin-1β质量比为1：5。
(4)单纯材料组(Scaffold)，为阴性对照组。即仅使用支架材料丝素/明胶构建而成的神经外导管，并无相应的支持细胞混合于材料，且其内部为中空，并无缓释微球或细胞因子。
(5)自体神经组(Autograft)，为阳性对照组。即将取下的10mm坐骨神经，原位沿长轴水平翻转后断端缝合。
常规手术制备大鼠坐骨神经10mm缺损模型。
2.术后运动功能恢复评价
电生理功能检测复合肌动作电位(compound muscle action potentials,CMAPs)
术后12w，室温下对大鼠进行电生理学检测。大鼠称重，腹腔注射复合麻醉剂(大鼠每100克体重0.2-0.3mL)，麻醉成功后，暴露坐骨神经，用玻璃分针小心分离坐骨神经，将记录电极刺入腓肠肌肌腹，干扰电极置于大鼠膝部皮肤表面，依次将刺激电极置于夹伤处近、远侧坐骨神经干，刺激神经，记录复合肌动作电位(compound muscle action potentials,CMAPs)。测量CMAPs振幅、潜伏期。同样的方法，记录正常侧CMAPs的振幅和潜伏期。CMAPs的与神经纤维支配靶肌的神经纤维成正比。
电生理学检测复合肌动作电位，结果如图4所示，图4A为各组修复大鼠坐骨神经10mm缺损术后12周，记录大鼠腓肠肌复合肌动作电位(CMAP)的代表图，图4B为复合肌动作电位振幅，各组占阳性对照自体神经组(Autograft)所占百分比的柱形统计图。结果表明优化的运动感觉特异组织工程化神经组(optimized TENG)与阳性对照的自体神经组(Autograft)没有显著差异，显著优于单纯材料组(Scaffold)和运动感觉混合组(Mixed)，P<0.01，并且亦显著优于运动感觉特异组织工程化神经组(TENG)组。
结果提示，由于在通常生理情况下，运动神经纤维恢复的速度要明显的快于感觉神经纤维，因此临床上常见运动功能得到了恢复和改善，而感觉功能恢复滞后的现象。而在优化的运动感觉特异组织工程化神经组(optimized TENG)中，通过提高了感觉神经纤维中施万细胞和成纤维细胞作为支持细胞的比例，证实了类感觉神经与类运动神经细胞中支持细胞的比例为3:1时效果最优。
3.术后感觉功能恢复评价
术后第12周进行疼痛行为学检测：所有动物行为学实验采取“双盲”的实验设计方案。
(1)机械痛觉异常实验用Electric Von Frey电子测痛仪(美国Stoelting公司)以up-down法推算50％缩足阈值：将一有机透明玻璃箱置于金属筛网上，待小鼠在有机玻璃箱中适应30min后，用von Frey纤维丝垂直刺激小鼠后肢足底中部，持续时间1-2s，小鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则视为阴性反应。
机械性疼痛检测结果如图5A所示，结果显示术后12周，机械性痛觉检测结果，自体神经组(Autograft)已经恢复至接近基线(base line，正常值设定为1.0)附近，优化的运动感觉特异组织工程化神经组(optimized TENG)与阳性对照的自体神经组(Autograft)没有显著差异，显著优于单纯材料组(Scaffold)和运动感觉混合组(Mixed)，以及运动感觉特异组织工程化神经组(TENG)。结果提示，优化的运动感觉特异组织工程化神经组(optimizedTENG)的机械性疼痛的恢复，显著优于感觉运动特异组织工程化神经组(TENG)，证实了类感觉神经与类运动神经细胞中支持细胞的比例为3:1时效果最优。
(2)热痛觉过敏实验将小鼠置于底为3mm厚玻璃板的不透明有机玻璃箱(13cm×14cm×9cm)中，使其适应30min，待小鼠的梳理和探究活动基本消失后，按Hargreaves法用热辐射刺激以照射小鼠足底紧贴玻璃板部位。记录照射开始至小鼠出现抬足时间，截止时间为20s。计算平均值，即为缩爪潜伏期(paw withdrawal latency)。
热敏性疼痛检测结果如图5B所示，结果显示术后12周，热敏性痛觉检测结果，自体神经组(Autograft)已经恢复至接近基线(base line，正常值设定为1.0)数值为0.85，而优化的运动感觉特异组织工程化神经组(optimized TENG)数值为0.87，与阳性对照的自体神经组(Autograft)没有显著差异，均显著优于单纯材料组(Scaffold)和运动感觉混合组(Mixed)，以及运动感觉特异组织工程化神经组(TENG)。结果提示，优化的运动感觉特异组织工程化神经组(optimized TENG)的热敏性疼痛恢复，显著优于运动感觉特异组织工程化神经组(TENG)，进一步证实了类感觉神经与类运动神经细胞中支持细胞的比例为3:1时效果最优。

Claims (10)

1.一种差异性组织工程化神经，其特征在于包括类运动神经和类感觉神经，
所述类运动神经包括类运动神经外管和外管内的类运动神经纤维，所述类运动神经外管表面或孔隙内包含有运动神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞，所述类运动神经纤维表面或孔隙内包含有跨突触信号分子Neuroligin-1；
所述类感觉神经包括类感觉神经外管和外管内的类感觉神经纤维，所述类感觉神经外管表面或孔隙内包含有感觉神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞，所述类感觉神经纤维表面或孔隙内包含有跨突触信号分子Neuroligin-2。
2.如权利要求1所述的差异性组织工程化神经，其特征在于所述运动神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞与感觉神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞的数量比为1：1～5。
3.如权利要求2所述的差异性组织工程化神经，其特征在于所述运动神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞与感觉神经来源的施万细胞和/或成纤维细胞的数量比为1：3。
4.如权利要求1所述的差异性组织工程化神经，其特征在于Neuroligin-1与Neuroligin-2的质量比为1：1。
5.如权利要求1所述的差异性组织工程化神经，其特征在于所述类运动神经纤维和/或类感觉神经纤维表面或孔隙内还包含有跨突触信号分子Neurexin-1β。
6.如权利要求5所述的差异性组织工程化神经，其特征在于所述类运动神经纤维上Neuroligin-1与Neurexin-1β的质量比为1：0.01-10，所述类感觉神经纤维上Neuroligin-2与Neurexin-1β的质量比为1：0.01-10。
7.如权利要求6所述的差异性组织工程化神经，其特征在于所述类运动神经纤维上Neuroligin-1与Neurexin-1β的质量比为1：5，所述类感觉神经纤维上Neuroligin-2与Neurexin-1β的质量比为1：5。
8.如权利要求5所述的差异性组织工程化神经，其特征在于所述跨突触信号分子Neuroligin-1，Neuroligin-2和Neurexin-1β包埋于微球中。
9.如权利要求1-8任一项所述的差异性组织工程化神经，其特征在于所述类运动神经和类感觉神经呈平行、Y型，树枝型，齿梳型中的一种或几种形状多分支样排布。
10.如权利要求1-9任一项所述的组织工程化神经在周围神经缺损修复中的应用。
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