CN1853584A - 含有神经支配的组织工程骨及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学工程中用组织工程方法构建人工器官技术领域，涉及一种含有神经支配的组织工程骨及其构建方法。本发明所述的含有神经支配的组织工程骨，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生物活性的复合体，所述的载体支架为含有神经支配的生物可降解材料，所述的神经支配是在载体支架内植入感觉神经束；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞，所述的骨髓基质于细胞取于自体骨髓，经分离、扩增至细胞密度为106－107个/ml。本发明所述的含有神经支配的组织工程骨可促使神经化，增加组织工程骨的成骨作用，对于骨缺损修复具有操作简单、修复速度快、修复效果好的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程中用组织工程方法构建人工器官技术领域，涉及一种含有神经支配的组织工程骨及其构建方法。
背景技术
近年来，随着组织工程技术的发展，研究开发具有修复、维持或改善损伤组织功能的生物替代物的报道逐年增多，有关组织工程骨的研究报道为数不少。目前对组织工程骨的的研制与开发利用已成为大段骨缺损修复治疗的热点。
目前研究与开发的组织工程骨，多是利用种子细胞和生物可降解材料复合物植入体内骨缺损处以修复重建缺失的骨组织，也有一些人研究和构建了血管化的组织工程骨，修复骨缺损的效果优于前者没有血管化的组织工程骨。但是血管化的组织工程骨还远未达到理想的修复骨缺损的效果。
只有带有充分的血液供应和完善的神经支配的组织工程骨才是与正常骨组织最相近的，也是最符合仿生学原理、能保证组织工程化骨组织在体内存活并可获得最佳的修复骨缺损的效果，是比较理想的解决方案。目前在促进组织工程骨血管化研究方面已有很多成果，但在神经化构建方面，目前国内外还没有人进行探索。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有神经支配的组织工程骨，可促使神经化，增加组织工程骨的成骨作用，对于骨缺损修复具有操作简单、修复速度快、修复效果好的优点。
本发明所述的含有神经支配的组织工程骨，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生物活性的复合体，所述的载体支架为含有神经支配的生物可降解材料，所述的神经支配是在载体支架内植入感觉神经束；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞，所述的骨髓基质干细胞取于自体骨髓，经分离、扩增至细胞密度为106-107个/ml。
进一步地，所述的神经支配是在载体支架内联合植入运动神经束。
进一步地，还植入血管束。
上述方案中，所述的生物可降解材料为天然无机盐类，优选为β磷酸三钙，即β-TCP。
本发明的另一目的是提供一种含有神经结构的组织工程骨的构建方法。
本发明所述的含有神经支配的组织工程骨的构建方法，以骨髓基质干细胞作为种子细胞，以生物可降解材料为载体支架，植入感觉神经束，通过组织工程方法构建成组织工程骨组织；所述的骨髓基质干细胞取于自体骨髓，经分离、扩增至细胞密度为106-107个/ml。
进一步地，所述的神经支配是在载体支架内联合植入运动神经束。
进一步地，还植入血管束。
所述的生物可降解材料为天然无机盐类，优选为β磷酸三钙，即β-TCP。
进一步地，在植入神经束的同时植入血管束。
本发明的另一目的是提供了所述的含有神经支配的组织工程骨的用途。
本发明所述的含有神经支配的组织工程骨可用于制备修复大段骨缺损的功能性组织工程化骨移植物。
本发明通过评估组织工程骨体内不同神经化重建方法的成骨效果，确立了一种成骨效果较好的含有神经支配的组织工程骨，并提供了如何构建大体积组织工程骨在体内存活并迅速发挥作用的可行方案。神经对骨组织发育、形成及代谢的影响是广泛而决定性的，充分的血液供应和完善的神经支配是保证组织工程化骨体内存活的决定性因素。带有神经支配和血管系统的复合组织工程骨符合仿生学观点，是理想的解决方案。本发明具有操作简单、修复速度快、修复效果好的优点。
附图说明
图1为本发明所述的含有感觉神经支配的组织工程骨的结构示意图；
图2为本发明所述的含有感觉和运动神经支配的组织工程骨的结构示意图；
图3为图1所述的组织工程骨中同时植入血管的结构示意图；
图4为图2所述的组织工程骨中同时植入血管的结构示意图；
图5为单纯组织工程骨组(A组)在术后12周对实验动物的放射学检查图；
图6为感觉神经束植入组(B组)在术后12周对实验动物的放射学检查图；
图7为血管束植入组(C组)在术后12周对实验动物的放射学检查图；
图8为运动神经束植入组(D组)在术后12周对实验动物的放射学检查图；
图9为感觉、运动神经束联合植入组(E组)在术后12周对实验动物的放射学检查图。
具体实施方式
本发明所述的含有神经支配的组织工程骨，如图1所示，包括载体支架1和种子细胞2，种子细胞2附着于载体支架1上，形成具有骨组织三维结构和生物活性的复合体，所述的载体支架1为含有神经支配的生物可降解材料，所述的神经支配是在载体支架内植入感觉神经束3；所述的种子细胞2为骨髓基质干细胞(BMSc)，所述的骨髓基质干细胞取于自体骨髓，经分离、扩增至细胞密度为106-107个/ml。
如图2所示，所述神经支配是在载体支架1内联合植入感觉神经束3和运动神经束4。
如图3和图4所示，所述的组织工程骨复合体内还植入血管束5。
所述的生物可降解材料为天然无机盐类，优选为β磷酸三钙，即β-TCP。
图1至图4为本发明的微观示意图，其尺寸大小不代表实际大小。
本实用新型所述的含有神经支配的组织工程骨移植物的构建方法，以骨髓基质干细胞作为种子细胞，以生物可降解材料为载体支架，植入感觉神经束，通过组织工程方法构建成组织工程骨移植物；所述的骨髓基质干细胞取于自体骨髓，经分离、扩增至细胞密度为106-107个/ml。
进一步地，所述的神经支配是在载体支架内联合植入运动神经束。
进一步地，还植入血管束。
所述的生物可降解材料为天然无机盐类，优选为β磷酸三钙，即β-TCP。
进一步地，在植入神经束的同时植入血管束。
本发明的实验设计利用显微外科的方法，分别将感觉神经束、运动神经束、动脉血管束和感觉、运动神经束联合植入经体外扩增培养并诱导分化的骨髓基质干细胞(植入的细胞密度是106-107/ml)和可吸收降解的生物材料(β-TCP)的复合物中，植入动物体内骨缺损处，促使组织工程骨组织发生神经化，观察不同方法促神经化发生后的成骨效果。
实验动物：健康新西兰大白兔30只，购自南方医科大学(原第一军医大学)动物中心，6个月龄，体重2-3kg。
实验分组：A组：组织工程骨对照组(BMSc+β-TCP)；B组：单纯感觉神经束植入组(BMSc+β-TCP+感觉神经束植入)C组：单纯血管束植入组(BMSc+β-TCP+血管束植入)；D组：单纯运动神经束植入组(BMSc+β-TCP+运动神经束植入)；E组：感觉、运动神经束同时植入组(BMSc+β-TCP+感觉、运动神经束植入)。植入的感觉神经是隐神经，运动神经是股神经肌支，植入的血管束是股动脉。另取2只兔做空白组。
具体构建分三个步骤：
1、细胞培养
成年新西兰大白兔，采用速眠新、氯胺酮和阿托品混合液肌肉注射麻醉。双侧髂骨处备皮后用16号骨穿针穿刺，抽取红骨髓5ml，混入DMEM完全培养基，500u/ml肝素溶液抗凝，混匀后1000r/min离心15min弃上清，过100目滤网，加培养基记数后接种。37℃，5％CO2孵箱培养，3天后半量换液，以后2～3天全量换液1次，待细胞汇合成单层后以0.25％胰蛋白酶消化，记数，用DMEM条件培养基(含10％胎牛血清，50ug/ml抗坏血酸，10-8mol/L地塞米松，10-3mol/Lβ-甘油磷酸钠)传代培养。常规3天换液1次。培养2周以106-107个/ml的密度将BMSc接种组织工程骨组、单纯感觉神经束植入组和单纯运动神经束植入组的β-TCP上(材料规格为ф12mm×15mm)，37℃，5％CO2孵箱培养4-6小时，条件培养基沿培养皿边缘加入完全覆盖材料，继续培养72小时后植入骨缺损处。
2、动物模型的制备
左侧后肢前内侧弧形长切口，切开皮肤、皮下组织和深筋膜，沿股直肌与股内侧肌间隙锐性分开进入。于股骨前外侧放置已塑形好的4孔普通钢板，螺纹钉固定。环行剥离股骨中段骨膜，于钢板第2、3孔之间，以线锯锯断股骨，切除该段对应的骨膜，造成1.5cm的段缺性骨与骨膜缺损。组织工程骨组于骨缺损处只嵌入β-TCP+经诱导的BMSc复合体。单纯感觉神经束植入组骨缺损模型制备方法同上，在股三角内解剖出由股神经发出的隐神经，游离足够的长度，锐性切断隐神经，将隐神经束植入β-TCP+经诱导分化的BMSc复合物的侧槽内；单纯运动神经束植入组解剖出由股神经发出的支配股内侧肌的肌支，游离一段长度，切断，将此神经束植入细胞材料复合物的侧槽内。感觉、运动神经束同时植入组解剖出隐神经和股神经发出的支配股内侧肌的肌支一起植入细胞材料复合物的侧槽内。感觉神经束和血管束同时植入组是将隐神经和股动脉一起植入细胞材料复合物的侧槽内。
3、检测方法
(1)大体观察：严密观察新西兰大白兔术后的一般情况。术后4、8、12周各处死2只动物取材，观察组织工程骨的表面变化、内痂形成、骨缺损修复情况及周围组织反应。
(2)放射学检查：A、B、C、D、E各组动物于术后4、8、12周均摄左侧股骨正位X光片(投照距离1m，投照条件46KV，50Ma，曝光时间0.14s)，空白组于术后12、18周摄片，观察骨缺损愈合情况。所有照片依据Yang等[Yang CY，Simmons DJ，Lozano R.Thehealing of grafts combining freeze-dried and demineralized allogeneic bone in rabbits.ClinOrthop.1994，298：289]的评分标准进行放射学评分。骨缺损部位x线阻射密度通过计算机图像分析测定。阻射密度以同一照片相同面积皮质骨的阻射密度为100，相同面积照片底色为0来测量相对值，同一照片的阻射密度取所有可见阻射块影密度的均值。
4、结果
(1)大体观察有2只兔发生伤口感染，其余兔伤口均一期愈合。4周取材时见感染的伤口有脓性分泌物，量不多，材料周围为炎性肉芽组织，一例脓液充填不多，另一例脓液充填较多，无明显骨痂形成。A组术后4周材料表面和缺损区有少量骨痂形成；8周时材料表面及骨缺损区骨痂增多，其中1只兔桥接部与截骨端愈合；术后12周材料大部分为骨痂所包裹。B组术后4周材料表面和缺损区可见较多量骨痂形成；8周时材料表面和缺损区骨痂明显增多，其中4只兔桥接部与截骨端愈合；术后12周骨缺损区为骨痂包裹。C组术后4周材料表面和骨缺损区见骨痂形成较多；8周时骨痂形成明显增多，其中有3只桥接部与截骨端愈合；术后12周材料见骨缺损区为骨痂连接。D组术后4周时材料表面和骨缺损区见有少量骨痂形成；术后8周材料表面及骨缺损区骨痂增多，其中1只兔桥接部与截骨端愈合；术后12周材料大部分为骨痂包裹。E组术后4周材料表面和骨缺损区见有较多骨痂形成，质硬；术后8周材料表面和缺损区骨痂明显增多，其中3只兔桥接部与截骨端愈合；术后12周骨缺损处为骨痂所充填。空白组术后12周和24周处死时观察骨缺损大小基本同前，两骨端硬化，骨髓腔封闭，纤维组织充填髓腔，无明显骨痂生长。
(2)X线片观察
A组术后4周骨缺损区及材料周围开始模糊，呈点絮状阻射影；术后8周时材料周围及骨缺损区呈斑片状阻射影，材料可见吸收，组织工程化骨成骨量增多，与两截骨部间隙变模糊，其中一只与宿主骨连接愈合；12周时如图5所示，植入组织工程化骨和桥接部连成大片状阻射影，可见材料降解吸收后形状变得很不规则，并且材料的阻射影减低，其内密度不均匀。
B组术后4周骨缺损区及材料周围出现模糊，有点状及絮状阻射影；术后8周见材料周围及骨缺损区呈较大的片状阻射影，材料可见吸收，有4只桥接部与两截骨端连接愈合；术后12周时如图6所示，骨缺损区见大片状阻射影，密度增高，材料明显吸收后显示不清楚。
C组术后4周骨缺损区及材料周围变模糊，有絮状阻射影；术后8周见材料周围及骨缺损区呈较大的斑片状阻射影，材料可见吸收后形状变得不规则，有3只桥接部与两截骨端连接愈合；术后12周时如图7所示，骨缺损区见大片状高密度阻射影，材料吸收后已显影不清。
D组术后4周骨缺损区及材料周围开始变模糊，呈点絮状及微小片状阻射影；术后8周时材料周围及骨缺损区呈斑片状阻射影，可见材料吸收，组织工程化骨与两截骨部间隙变模糊，其中一只桥接部与宿主骨连接愈合；12周时如图8所示，植入组织工程化骨和桥接部连成大片状阻射影，骨缺损区大部模糊，可见材料明显吸收后阻射影减低，密度变得不均匀。
E组术后4周时见材料周围及骨缺损区变模糊，有絮状阻射影；8周时骨缺损区呈大斑片状阻射影，材料可见吸收，形状已不规则，有3只兔见组织工程骨与两截骨端已有骨性连接；术后12周如图9所示，骨缺损区呈大片状阻射影，边缘比较光滑整齐，材料吸收很多。
空白组术后12周和24周骨缺损区仍呈透亮影，骨端硬化、模糊。
(3)X线片影像学评分结果
表1 骨缺损区影像学评分值(
x±s，n＝6，评分)Roentgenographic scores at bone defects(
x±s，n＝6，scores)
| 分组groups | 时间(周)time(w) | ||
| 4 | 8 | 12 | |
| ABCDE | 5.333±0.5178.333±0.8165.500±0.8368.767±0.08110.166±0.753 | 7.166±0.40811.333±0.5168.167±0.30711.964±0.34413.167±0.752 | 9.083±0.37612.500±0.89410.083±0.80112.333±0.51614.167±0.752 |
表2 骨缺损区骨密度值(
x±s，n＝6，相对值)Values of callus density at bone defects(
x±s，n＝6，relative values)
| 分组groups | 时间(周)time(w) | ||
| 4 | 8 | 12 | |
| ABCDE | 43.501±2.72558.663±2.54144.578±2.94857.572±2.16460.783±1.509 | 54.638±1.26562.375±0.99254.203±1.55663.071±0.86665.406±0.783 | 71.683±2.10184.582±1.01773.585±1.97583.127±1.74486.738±1.144 |
X线片影像学评分结果：
从表1可看出，B、D、E组正位照片骨缺损修复评分在4、8、12周均较A、C组的放射影像学评分为优(P＜0.05)，C组和A组相比较也无明显差异(P均＞0.05)，但B组、D组和E组间相相互比较，D组与B组、E组间无明显差异，而E组优于B组。
正位片骨缺损部位阻射密度测量值：
从表2可看出，B、D、E组在4，8，12周的骨缺损阻射密度相对值均优于比A、C组(P均＜0.05)，C组和A组相比也无明显差异(P均＞0.05)，但B、D、E组间相互比较，D组与B组、E组间无明显差异，而E组优于B组。
5、结论
(1)在组织工程骨中植入感觉神经束后，其修复骨缺损效果比单纯组织工程骨和在组织工程骨中植入运动神经束的修复效果均有明显提高；
(2)感觉、运动神经束联合植入组的成骨效果优于感觉神经束植入组；
(3)血管束植入组的成骨效果优于单纯组织工程骨。
本实验说明：利用感觉神经束植入的方法可以提高组织工程骨的成骨作用，而植入运动神经束组却未观察到这种作用。如果同时植入感觉、运动神经束，可以有效地提高组织工程骨的成骨作用。如果再采取血管束植入的方法，可以更有效地提高组织工程骨的成骨作用。
Claims (10)
1、含有神经支配的组织工程骨，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生物活性的复合体，其特征在于：所述的载体支架为含有神经支配的生物可降解材料，所述的神经支配是在载体支架内植入感觉神经束；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞，所述的骨髓基质干细胞取于自体骨髓，经分离、扩增至细胞密度为106-107个/ml。
2、根据权利要求1所述的含有神经支配的组织工程骨，其特征在于：所述的神经支配是在载体支架内联合植入运动神经束。
3、根据权利要求1或2所述的含有神经支配的组织工程骨，其特征在于：还植入血管束。
4、根据权利要求1所述的含有神经支配的组织工程骨，其特征在于：所述的生物可降解材料为天然无机盐类。
5、根据权利要求4所述的含有神经支配的组织工程骨，其特征在于：所述的天然无机盐类为β磷酸三钙，即β-TCP。
6、如权利要求1所述的含有神经支配的组织工程骨的构建方法，其特征在于：以骨髓基质干细胞作为种子细胞，以生物可降解材料为载体支架，植入感觉神经束，通过组织工程方法构建成组织工程骨组织；所述的骨髓基质干细胞取于自体骨髓，经分离、扩增至细胞密度为106-107个/ml。
7、根据权利要求6所述的含有神经支配的组织工程骨的构建方法，其特征在于：联合植入感觉神经束与运动神经束。
8、根据权利要求6或7所述的含有神经支配的组织工程骨的构建方法，其特征在于：还植入血管束。
9、根据权利要求6所述的含有神经支配的组织工程骨的构建方法，其特征在于：所述的生物可降解材料为天然无机盐类。
10、根据权利要求9所述的含有神经支配的组织工程骨的构建方法，其特征在于：所述的天然无机盐类为β磷酸三钙，即β-TCP。
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2005
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