CN101530634A - 一种仿生双相陶瓷样生物活性骨及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仿生双相陶瓷样生物活性骨及其制备方法。猪椎骨经低温煅烧后与焦磷酸钠溶液复合，再经二次低温煅烧后制得双相陶瓷样生物骨，再与骨形态发生蛋白溶液、碱性成纤维细胞生长因子溶液和I型胶原溶液复合，冻干后制得成品。该材料来源丰富，不仅保留了生物骨原有的天然网状孔隙，而且具有适中的生物降解性能和良好的骨传导能力。动物及临床实验表明，其成骨性能优异，且具备诱导成骨能力及再血管化能力，可望实现病变或缺损骨的永久功能性修复。具有良好的应用前景。

Description

一种仿生双相陶瓷样生物活性骨及其制备方法

技术领域

本发明属于骨移植替代材料技术领域，具体涉及一种仿生双相陶瓷样生物活性骨。同时，本发明还涉及该生物活性骨的制备方法。

背景技术

临床上因肿瘤切除、创伤和感染造成的骨缺损十分常见。虽然自体骨是理想的骨移植材料，但供骨来源有限，且易造成二次手术的痛苦和并发症。异体骨移植则存在免疫排异反应，并可能导致某些疾病(如乙肝、爱滋病等)的传播和肿瘤的生成。因此研制理想的骨移植替代材料用于骨缺损修复是医学界和生物材料界的迫切要求。

随着人们对骨组织工程的研究不断深入，对支架材料的研究重点逐渐转移到寻找类似人体骨组织天然结构和性能的材料上。研制这类材料时仿生尤为重要。目前，人工合成材料在生物相容性、生物活性、生物降解性及与宿主骨的力学匹配等方面还存在一些缺点，且在孔隙率及孔径大小等方面的仿生制作还存在一些难度。而天然生物骨来源广，采用适当的理化方法处理后可将其抗原性削弱或消除，从而解决移植后产生免疫排斥反应的问题。生物骨衍生材料能保留其天然的网状孔隙结构，其结构和组成符合生理要求，具有良好的生物相容性和生物降解性，其天然的孔隙结构能为细胞黏附、增殖、分化、成骨提供天然的三维空间结构，以此仿生制备的材料做支架，可望研制出与人自体骨相似的组织工程化骨。其中，猪骨来源广，取材方便，且猪的解剖生理与人类相似，有机成分和无机成分含量与人比较接近，猪是移植供体动物中较能接受的对象。

传统方法制作的煅烧骨主要由羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)组成，HA具有良好生物相容性，并且其力学性能较其他生物活性材料为优。但是HA生物降解性能差，有报道其年吸收率约5％～15％，从而影响了新生骨的后期重塑，并影响其生物力学的强度。理想的植骨材料体内吸收时间应是植入后6个月到1年。磷酸三钙(Tricalcium phosphate，TCP)是生物降解陶瓷材料的一种，钙磷比与天然骨比例接近。TCP属于快速吸收陶瓷，在水溶液和体液中溶解度较HA大。TCP表面丰富的层状结构能够刺激破骨细胞的吸收作用及成骨细胞的成骨作用，利于形成新骨。TCP能被有效地生物降解和吸收，并逐步为新生组织所置换。同时TCP有良好的表面骨引导作用，植入骨膜下皮质骨表面后有大量新骨长入。但TCP的降解速度太快而不利于新生骨的结合，同时TCP力学性能较HA差。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种仿生双相陶瓷样生物活性骨。

本发明的目的还在于提供一种制备所述生物活性骨的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

一种仿生双相陶瓷样生物活性骨，其特征在于：猪椎骨经低温煅烧后与焦磷酸钠溶液复合，再经二次低温煅烧后制得双相陶瓷样生物骨，再与骨形态发生蛋白溶液、碱性成纤维细胞生长因子溶液和I型胶原溶液复合，冻干后制得成品。

制备所述仿生双相陶瓷样生物活性骨的方法，包括以下步骤：

1、取新鲜市售猪椎骨制成一侧含皮质骨的松质骨条；

2、在500～800℃条件下煅烧30～45min，制得陶瓷化骨(True boneceramic，TBC)；

3、将TBC置于浓度为0.01～0.1mol/L的焦磷酸钠溶液中浸泡3～5min，然后在500～800℃条件下煅烧30～45min，制得双相陶瓷样生物骨(BiphasicCeramic Biologic Bone，BCBB)；

4、待BCBB冷却至室温后，用蒸馏水在超声波清洗机上洗净表面及孔隙中的碎屑，干燥后高压蒸汽灭菌备用；

5、将骨形态发生蛋白(BMP)与浓度为4mol/L的盐酸胍溶液混合均匀，BMP与盐酸胍的比为60g∶1L，得到BMP溶液；

6、将碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)与浓度为4mol/L的盐酸胍溶液混合均匀，BFGF与盐酸胍的比为60g∶1L，在4℃环境下放置24小时，得到BFGF溶液；

7、将BMP溶液和BFGF溶液混合后用磁力搅拌机匀浆30min，然后在4℃条件下透析48小时，每24小时更换透析液1次；透析产物再与I型胶原溶液按体积比1∶2混合，电磁震荡10分钟，得到混合溶液；

8、将BCBB切分成小块，然后按40∶1的重量比置于步骤(7)得到的混合溶液中，以45帕～55帕负压抽吸充分混匀，-20度冻干，制得所需的仿生双相陶瓷样生物活性骨。

步骤1所述的松质骨条，以1.0～2.0cm×0.4～0.6cm×0.4～0.6cm的大小为较佳。

步骤3中，所述的焦磷酸钠溶液浓度优选为0.1mol/L。

步骤8中，优选将所述的BCBB切分成0.4～0.6cm×0.4～0.6cm×0.4～0.6cm的骨块。

步骤8中，优选以50帕负压抽吸充分混匀。

本发明相对于现有技术具有以下优点：

1、该仿生双相陶瓷样生物活性骨的支架材料选自来源丰富的猪椎骨，经两次煅烧后，不仅保留了生物骨原有的天然网状孔隙，而且具有适中的生物降解性能和良好的骨传导能力。其成骨性能优异，诱导成骨能力及再血管化能力。

2、双相陶瓷样生物骨中复合BMP和BFGF后，提高了支架材料的骨诱导活性。BMP和BFGF赋予了材料诱导骨组织再生的功能，不仅能加速骨损伤愈合，而且可望实现病变或缺损骨的永久功能性修复。

3、由于BMP和BFGF单独植入骨缺损部位时，在体液冲刷及细胞吞噬作用下很快就会流走或消失，从而不能持续诱导成骨。本发明将胶原作为缓释载体，使BMP和BFGF能在局部缓慢释放，持续性地发挥诱导成骨，从而使其诱导能力大为提高。

附图说明

图1本发明仿生双相陶瓷样生物骨的电镜照片；

图2本发明仿生双相陶瓷样生物骨以软件计算的孔隙率；

图3本发明仿生双相陶瓷样生物活性骨异位成骨表现；

图4本发明对照组仿生双相陶瓷样生物骨异位成骨表现；

图5.6本发明仿生双相陶瓷样生物活性骨异位成骨12周后组织学表现；

图7本发明对照组仿生双相陶瓷样生物骨异位成骨12周后组织学表现；

图8本发明仿生双相陶瓷样生物活性骨修复兔修复节段性骨缺损x线表现；

图9本发明对照组仿生双相陶瓷样生物骨修复兔修复节段性骨缺损x线表现；

图10本发明对照组自体骨修复兔修复节段性骨缺损x线表现；

图11本发明仿生双相陶瓷样生物活性骨修复兔修复节段性骨缺损组织学表现；

图12本发明对照组仿生双相陶瓷样生物骨修复兔修复节段性骨缺损组织学线表现；

图13本发明对照组自体骨修复兔修复节段性骨缺损组织学表现；

图14本发明空白组修复兔修复节段性骨缺损组织学表现；

图15内生软骨瘤术前x片；

图16本发明仿生双相陶瓷样生物活性骨植入前照片；

图17本发明仿生双相陶瓷样生物活性骨植入后三个月x线照片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们不是对本发明的限定。

实施例1

制备仿生双相陶瓷样生物活性骨。取新鲜市售猪椎骨制成一侧含皮质骨的松质骨条，骨条大小1.0cm×0.4cm×0.4cm。置于箱式电阻炉中(湖北省恒丰医疗器械有限公司生产)，以500℃煅烧30min，以完全去除骨条中的有机成分，制得陶瓷化骨(True bone ceramic，TBC)。将TBC置于浓度为0.01mol/L的焦磷酸钠溶液中浸泡3min，然后再次以500℃煅烧30min，制得双相陶瓷样生物骨(BCBB)。待BCBB冷却至室温后，用蒸馏水在超声波清洗机上洗净表面及孔隙中的碎屑，干燥后高压蒸汽灭菌备用。将骨形态发生蛋白(BMP)与浓度为4mol/L的盐酸胍溶液混合均匀，BMP与盐酸胍的比为60g∶1L，得到BMP溶液。将碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)与浓度为4mol/L的盐酸胍溶液混合均匀，BFGF与盐酸胍的比为60g∶1L，在4℃环境下放置24小时，得到BFGF溶液。将BMP溶液和BFGF溶液混合后用磁力搅拌机匀浆30min，然后在4℃条件下透析48小时，每24小时更换透析液1次。透析产物与I型胶原溶液按体积比1∶2混合，电磁震荡器震荡10分钟，得到混合溶液备用。将备用的BCBB切分成0.4cm×0.4cm×0.4cm小块，然后按40∶1的重量比置于备用的混合溶液中，以45帕负压抽吸充分混匀，-20度冻干，即得到所需的仿生双相陶瓷样生物活性骨。

实施例2

重复实施例1，有以下不同点：猪椎骨制成2.0cm×0.6cm×0.6cm的松质骨条。煅烧温度800℃，煅烧时间45min。将TBC置于浓度为0.05mol/L的焦磷酸钠溶液中浸泡5min。以55帕负压抽吸充分混匀。备用的BCBB切分成0.6cm×0.6cm×0.6cm小块。

实施例3

重复实施例1，有以下不同点：猪椎骨制成1.5cm×0.5cm×0.5cm的松质骨条。煅烧温度650℃，煅烧时间40min。将TBC置于浓度为0.1mol/L的焦磷酸钠溶液中浸泡4min。以50帕负压抽吸充分混匀。备用的BCBB切分成0.6cm×0.6cm×0.6cm小块。

应用实施例1

以实施例3所得仿生双相陶瓷样生物活性骨进行骨移植实验和临床实验，并检测其技术效果。

实验设备：箱式电阻炉(湖北省恒丰医疗器械有限公司)、拉伸试验机(日本产岛津AG-IS型)、环境扫描电镜(荷兰产飞利浦XL30型ESEM)、X线衍射仪(日本产理学30152升级型)、电子探针(日本产岛津EPMA-1600)。

1.扫描电镜观察。

用扫描电镜(荷兰产飞利浦XL30型)观察BCBB的表面结构，测量孔径大小。随机取10幅照片，计算平均孔径大小和孔隙率。孔隙率通过AdobePhotoshop7.0软件的直方图(histogram)功能计算，以像素(pixel)代表孔隙面积，孔隙率＝孔隙所占的像素÷整个照片的像素。结果SEM观察BCBB呈天然的高密度网状孔隙结构，骨小梁、小梁间隙和骨内管腔系统同时存在，孔径范围462±123μm(图1)，孔隙率通过Adobe Photoshop 7.0软件计算(图2)，计算10幅扫描电镜图片的孔隙率结果(见表1)，孔隙率为：(59.5±2.5)％。SEM扫描放大5000倍见材料表面粗糙，HA晶体呈柱状排列，HA晶体表面的斑片状结构经能谱分析确定为TCP。

表1 扫描电镜图片的孔隙率计算结果(x±Sn＝10)

x＝59.5％，s＝2.5％

2.用X线衍射仪对BCBB材料进行物相分析和电子探针对材料中的元素成分进行分析。对BCBB材料进行物相分析发现BCBB主要由79.1％HA和17.4％TCP组成。随机选取5块材料，用电子探针对材料中的元素成分进行测定，计算钙磷比，BCBB钙磷原子数量比为1∶1.59±0.11，接近于人骨1∶1.8±0.16的钙磷比值。

3.用拉伸试验机对材料的抗压强度进行测试。

随机选取10个材料，制成规则的长方体，游标卡尺测量长、宽、高，然后对材料的抗压强度进行测试。检测结果见表2，计算后抗压强度应为(3.30±0.68)Mpa。

表2 抗压强度测试结果(x±Sn＝10)

x＝3.30MPa，s＝0.68MPa

4.用凯氏定氮法测定蛋白含量。

随机选取5个材料，将材料研磨成粉末，每个材料取1g样品放于凯氏烧瓶中。烧瓶中硫酸钾2g，10％硫酸铜2mL，浓硫酸20mL，然后加热。加蒸馏水把样品多次反复洗涤移入250mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。吸取样品消化液5mL，加50％氢氧化钠进行蒸馏，并用10mL硼酸吸收。用标定过的盐酸溶液滴定硼酸吸收液至粉红色为止，记录用量。吸取5mL试剂空白消化液，按上述样品操作步骤进行操作。结果作为空白对照凯氏定氮法测定5个标本的蛋白含量为0，另外电子探针检测也未发现材料中含有氮元素，结合两种检测结果，由此确定BCBB中蛋白含量为0，有机成分已完全被去除。

5.仿生双相陶瓷样生物活性骨和双相陶瓷样生物骨的异位成骨作用研究。

取成年健康日本大耳兔32只，雌雄不限，随机分为a、b两组，每组各16只，麻醉成功后固定，消毒手术区域，分层切开兔双侧股部皮肤、皮下，钝性分离肌肉，造成肌袋，将仿生双相陶瓷样生物活性骨和双相陶瓷样生物骨各1块分别植入a组、b组兔的双侧股部肌袋中。术后2、4、8、12周每组各处死4只兔，取材分别于术后2、4、8、12周每组各处死4只兔，拍双后肢X光片，标本用10％甲醛固定，冲洗、脱水、透明化处理后，使用硬组织包埋液进行包埋，硬组织切片机连续切片，切片厚度为5μm，60℃水浴锅中展片，载玻片捞片，塑料薄膜覆盖，50℃烤箱中风干，两天后进行HE染色、Masson染色，镜下观察。

①术后一般情况观察：术后第一天动物开始进食，活动、进食状态良好，术后切口愈合良好。

②异位成骨标本大体观察

a组：2w时，材料表面形成薄层结缔组织包膜，包膜内形成新生的血管网；植入后4w、8w包膜内形成的血管网明显增多，纤维组织添塞孔隙；植入后12w材料外周呈现白色骨样组织，表面血管量增多。部分标本表面为白色，部分表面为红色(图3)。

b组：b组与a组相比第2周时无明显差别，在其余时间点血管网及白色骨样组织生成均较a组少(图4)。

③X线摄片观察：未发现明显的肉眼可见的材料密度变化及材料周围的变化。

④组织学观察：

a组：2周、4周时，在材料表面及孔隙内大量纤维结缔组织及毛细血管，血管周围可见核浅、多突起的间充质细胞和胞体较大，着色较深的成骨细胞，胶原纤维走向紊乱，材料间隙可见少量成排排列的成骨细胞，偶见炎性细胞浸润，未见骨形成；8周时，可见散在分布的不成熟新生骨组织，炎性细胞少见，胶原纤维走向紊乱；12周时，材料边缘可见成熟的新生骨组织，新形成的骨质胶原纤维排列稍紊乱，骨细胞及骨陷窝明显可见。材料边缘可见排列成行的不连续的成骨细胞附着，细胞体积大，着色较深(图5.图6)。

b组：未见骨形成，12周时材料边缘可见网状分布的骨性胶原纤维(图7)。

6.两种仿生双相陶瓷生物修复节段性骨缺损的研究。

取成年健康日本大耳兔64只，雌雄不限，随机分为a、b、c、d三组，每组各16只。麻醉后，取前肢桡侧中段2cm长纵切口，用骨锯将桡骨连同骨膜截除1.5cm，仔细止血后，将仿生双相陶瓷样生物活性骨植于a组兔双侧桡骨缺损处，将仿生双相陶瓷样生物骨植于b组兔双侧桡骨缺损处，将自体骨植于c组兔双侧桡骨缺损处，将d组兔双侧桡骨造成1.5cm缺损不做移植修复，作为空白对照。手术中尽量使植入材料与宿主骨紧密结合，术毕常规缝合切口，肌注青霉素40万单位，预防切口感染。术后各组动物于相同条件下分笼饲养。分别于术后2、4、8、12周每组各处死4只兔，然后取材。

①一般观察：术后各组动物的活动、进食、伤口愈合情况。动物处死后植入材料的大体观察及其与周围骨组织的关系。

②X线摄片观察及评分：分别于术后2、4、8、12周时将a、b、c、d组各处死4只兔。双前肢尺桡骨拍X光片，记录X线片特征。参照Lane等^[44]关于骨移植X线片评分标准进行评分(表4)，结果使用SPSS10.0软件进行统计学分析。

③组织形态观察和新生骨组织计量分析

摄片后在离两断端5mm处截断桡骨，取出标本，组织标本的制备、切片及染色，然后行镜下观察。每个标本随机选取一张切片，每张切片分别在骨缺损的两端和中部各取2个视野，共6个视野，40倍视野下使用显微数码像机进行显微摄影，所得数码照片使用Adobe Photoshop 7.0软件的直方图(histogram)功能进行面积计算。

表4 Lane等关于骨移植的X线片评分

①术后一般情况观察：术后第一天动物开始进食，饮食、活动正常。术后第一周内双前臂肿胀，切口两周后完全愈合。

②修复节段骨缺损的大体观察：

a组：2周时可见材料与宿主骨之间的缝隙为纤维组织填充，无感染征象，4周及8周时可见材料表面保持完整，与宿主骨组织紧密结合，植入材料周围新生骨痂将材料包绕，12周时可见材料部分吸收，新生骨长入，修复段塑型较好，接近宿主骨外形。

b组：2周时与a组无明显差别，4周及8周可见植入材料周围新生骨痂较a组少，部分将材料包绕，12周时可见材料与宿主骨形成牢固愈合，修复段塑型基本接近宿主骨。

c组：2周时可见材料与宿主骨之间的缝隙为纤维组织填充，4周时植骨完整，与挠骨缺损两端结合紧密，8周时植骨与宿主骨形成骨性愈合，12周外形接近挠骨

d组：骨折不愈合，各阶段均可见缺损为纤维组织填充，随时间变化骨折端吸收、硬化。

③X线摄片观察及评分结果：

I、X线摄片观察：

a组：2周时，材料与断端对合良好，无移位，材料形态完整，材料与宿主骨断端的间隙清晰可见，未见骨痂生长；4周时，材料与宿主骨断端分界模糊，植入材料外形完整；8周时，材料密度升高，表现为密度增高影像，材料边缘部分密度接近挠骨，材料为新生骨所围绕；12周时，材料部分被吸收，长度变短，骨缺损修复区密度接近挠骨(图8)。

b组：第2周时b组与a组比较无明显差别，其余各时间点较a组外生骨痂少，材料密度高，材料降解较a组差(图9)。

c组：第2周时c组与a组比较无明显差别，4周时自体骨与断端分界模糊，8周可见形成髓腔结构，12周时完成髓腔改建(图10)。

d组：骨缺损部位X线摄片始终为透亮区，随时间增加，骨折端吸收、硬化、封闭。

II、X线摄片评分结果：

根据Lane等X线评分标准进行X线片评分，通过材料与宿主骨的愈合、髓腔形成和髓腔改建程度对两种材料的效果进行评估，使用方差分析对结果进行分析、比较(表5)。

表5 各实验组相同时间点之间X线评分方差分析比较结果(x±s，n＝6)

a组、b组与c组比较，*P<0.05，**P<0.01

a组与b组比较，#P<0.05，##P<0.01

④组织学观察及新骨形成面积计算结果

I、组织学观察

a组：2周时，可见纤维组织和血管伸人材料，血管周围可见核浅、多突起的间充质细胞，材料边缘有成排排列的成骨细胞，成骨细胞胞体大着色较深，呈活跃状态，偶见淋巴细胞，材料与宿主骨断端间为纤维组织连接；4周时，有更多的血管和纤维组织长人材料，材料与宿主骨断端间少部分为纤维组织连接，大部分为骨性连接。材料被新生的纤维组织和部分新生骨包绕，新生骨幼稚，骨基质中可见到内含有骨细胞的骨陷窝结构，胶原排列紊乱；8周时，新生骨增多，新生骨组织从缺损两端贴附材料向缺损内部长入，材料与宿主骨骨床大部分为骨性结合；12周时，材料部分吸收，新生骨骨小梁排列较整齐，钙化良好，材料与新生骨为骨性结合(图11)。

b组：2周时，新生血管和纤维组织长入材料，血管较a组少，材料边缘可见少量成骨细胞，材料与宿主骨断端间为纤维组织连接；4周时，有更多的血管和纤维组织长人材料，并有骨形成，材料与宿主骨断端间部分为纤维组织连接，部分为骨性连接；8周时，材料内纤维组织减少，骨形成量明显增加，并逐渐与宿主骨融合，材料与骨床为骨性结合；12周时，材料占位缩小，新生骨组织区域血管分布充分，有骨髓样结构形成，新生骨组织与两端宿主骨断端融合成一体，移植物与新生骨为骨性结合(图12)。

c组：2周时自体骨与宿主骨断端间为纤维组织连接；4周时自体骨与宿主骨断端间形成骨性连接；8周时自体骨组髓腔再通，骨小梁未被完全吸收；12周时自体骨组髓腔再通，并且完成髓腔的改建，形成皮质骨结构。(图13)

d组：骨折端始终为纤维结缔组织填充，2周时骨折端较整齐，12周时骨折端吸收，硬化，封闭(图14)。

II、新骨形成面积计算结果

组织形态计量分析以像素表示新生骨量，方差分析结果显示仿生双相陶瓷样生物活性骨在4周和、8周、12周时的成骨量明显多于仿生双相陶瓷样生物骨，结果有显著差异(P<0.05)，但二者的成骨量又少于自体骨(表6)。

表6 各实验组相同时间点之间新生骨面积方差分析比较结果(x±s，n＝6)

a组，b组与自体骨比较，*P<0.05，**P<0.01

a组与b组比较，#P<0.05，##P<0.01

结论：仿生双相陶瓷样生物活性骨有较好的骨传导性和骨诱导性，又有一定的可吸收性，植入动物体内后未见明显免疫反应，修复节段骨缺损作用明显。仿生双相陶瓷样生物活性骨对兔桡骨节段骨缺损的修复能力优于双相陶瓷样生物骨，应用仿生双相陶瓷样生物活性骨修复骨缺损具有较好的前景。

7、临床实验

选取5例良性骨肿瘤患者，均为男性，年龄33～52岁，平均41岁。均为内生软骨瘤(图15)，肿瘤大小为0.5cm×0.5cm×0.8cm～3.0cm×4.0cm×3.0cm；肿瘤均位于患指指骨。行肿瘤刮除术，瘤腔用仿生双相陶瓷样生物活性骨(图16)填充，伤口常规缝合；术后观察伤口愈合情况，局部炎性反应，排斥反应，全身毒性，瘤腔愈合和患肢功能的恢复情况。结果：术后无伤口感染，伤口均I/甲愈合。局部炎性反应轻微，无排斥反应和全身毒性反应。术后全部获随访6～12个月，术后3个月可见新骨长入仿生双相陶瓷样生物活性骨填充区(图17)。手指在术后1个月可完成日常活动。结论：仿生双相陶瓷样生物活性骨具有良好成骨性、生物安全性和相容性，可用于骨缺损的修复。

Claims (6)

1、一种仿生双相陶瓷样生物活性骨，其特征在于：猪椎骨经低温煅烧后与焦磷酸钠溶液复合，再经二次低温煅烧后制得双相陶瓷样生物骨，再与骨形态发生蛋白溶液、碱性成纤维细胞生长因子溶液和I型胶原溶液复合，冻干后制得成品。

2、制备权利要求1所述仿生双相陶瓷样生物活性骨的方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜市售猪椎骨制成一侧含皮质骨的松质骨条；

(2)在500～800℃条件下煅烧30～45min，制得陶瓷化骨TBC；

(3)将TBC置于浓度为0.01～0.1mol/L的焦磷酸钠溶液中浸泡3～5min，然后在500～800℃条件下煅烧30～45min，制得双相陶瓷样生物骨BCBB；

(4)待BCBB冷却至室温后，用蒸馏水在超声波清洗机上洗净表面及孔隙中的碎屑，干燥后高压蒸汽灭菌备用；

(5)将骨形态发生蛋白BMP与浓度为4mol/L的盐酸胍溶液混合均匀，BMP与盐酸胍的比为60g:1L，得到BMP溶液；

(6)将碱性成纤维细胞生长因子BFGF与浓度为4mol/L的盐酸胍溶液混合均匀，BFGF与盐酸胍的比为60g:1L，在4℃环境下放置24小时，得到BFGF溶液；

(7)将BMP溶液和BFGF溶液混合后用磁力搅拌机匀浆30min，然后在4℃条件下透析48小时，每24小时更换透析液1次；透析产物再与I型胶原溶液按体积比1:2混合，电磁震荡10分钟，得到混合溶液；

(8)将BCBB切分成小块，然后按40:1的重量比置于步骤(7)得到的混合溶液中，以45帕～55帕负压抽吸充分混匀，-20度冻干，制得所需的仿生双相陶瓷样生物活性骨。

3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述松质骨条的规格为1.0～2.0cm×0.4～0.6cm×0.4～0.6cm。

4、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的焦磷酸钠溶液浓度为0.1mol/L。

5、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(8)中，将所述的BCBB切分成0.4～0.6cm×0.4～0.6cm×0.4～0.6cm的骨块。

6、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(8)中，以50帕负压抽吸充分混匀。

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