CN109187118A - 一种硬组织病理切片展片的方法及装置 - Google Patents

一种硬组织病理切片展片的方法及装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种硬组织病理切片展片的方法及装置，包括如下步骤：1）取材固定，脱水、透明、渗透包埋，砂轮机修块；2）硬切块表面均匀涂抹OCT包埋剂并切片；3）将切好的硬组织切片置于45‑52℃热水中，组织切片展开；4）用铬矾明胶包被的载玻片捞起硬组织切片；5）玻璃盖玻片均匀涂抹凡士林，并置于粘附组织切片的载玻片上；6）将玻片置于压片装置中，均匀施加压力，将放有玻片的压片装置放入60℃烘箱中烘烤2小时；7）从烘箱中取出玻片，移去盖玻片，置于二甲苯中脱去凡士林，自然晾干后待用。本发明展片方法及压片装置操作方便，可重复性强，同时有效避免了硬组织切片皱缩、脱片等问题，显著提高了展片效果，适合不同组织工程骨研究。

Description

一种硬组织病理切片展片的方法及装置
技术领域
本发明涉及生物学或者医学中病理组织切片制备技术领域，具体涉及一种用于硬组织病理切片展片的新方法。
背景技术
骨组织是由细胞、基质和纤维构成的一种质地坚硬的结缔组织，骨组织中沉积的无机盐以羟基磷灰石形式存在，其主要成分为磷酸钙和碳酸钙。由于骨组织硬脆致密、难切易碎，因此在临床、教学和科研中，对骨组织直接进行切片较为困难。常规骨组织采用脱钙后石蜡包埋切片，处理过程中常导致酶活性降低，骨组织形态结构改变，无法进行组织学观察，且不能对组织钙分布、矿化程度等进行研究。近年来硬组织的研究发展迅速，大多研究指标必须通过非脱钙硬组织切片进行检测，硬组织切片不破坏骨组织的结构和成分，在观察中不失真，对研究骨组织内成分、骨形成有重要作用。
然而，当前实验室普遍采用的硬组织切片展片的方法是将切片粘附于普通玻璃载玻片，同时使用塑料盖玻片盖片，后置于60℃烘箱中烘烤。该操作对于硬组织贴片效果一般，组织切片易起褶皱，展片效果不理想，组织切片也经常出现破裂，且后续实验操作中极易脱片，直接影响病理专家对硬组织切片的组织学评价。
综上所述，硬组织切片不能高质量切片、展片是临床及科研中亟待解决的难题。传统方法均存在展片不佳和脱片两方面的弊端，严重限制了临床和科研检测的进程，影响了实验检测结果的真实性。因此如何突破目前硬组织切片展片技术的困境，同时探索更为合适的切片展片方法是非常迫切的科学问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种硬组织病理切片展片的新方法及装置。该方法解决了硬组织切片中贴片效果差、切片不完整、切片皱缩和粘片导致的组织破裂等技术问题，而且本发明操作简单方便，展片效果明显，重复性好。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述硬组织病理切片展片的方法包括如下步骤：
1)取组织病理材料并固定，脱水透明后进行渗透和包埋处理，再用砂轮机修块，得硬切块；
2)将硬切块表面均匀涂抹OCT包埋剂后切片，得切好的硬组织切片；优选地，切片时的切片机型号为LEICA RM2255型，配钨钢刀；
3)将硬组织切片置于45—52℃，优选为48℃热水中，使硬组织切片展开，优选地，将硬组织切片置于热水中的时间为3—5s；
4)用明胶和硫酸铬钾包被的载玻片捞起展开的硬组织切片；
5)在玻璃盖玻片均匀涂抹凡士林后，将盖玻片置于粘附有硬组织切片的载玻片上；
6)将玻片置于压片装置中，均匀施加压力，于55—65℃，优选为60℃烘箱中烘烤1.5—2.5h，优选为2h；
7)从烘箱中取出玻片，移去盖玻片，将载玻片于二甲苯中脱去凡士林，自然晾干后待用。
其中，所述硬组织包括骨组织、牙齿等含钙量较多的组织。步骤(4)所述明胶和硫酸铬包被的载玻片中所用的明胶密度为0.005g/ml，所用的硫酸铬钾密度为0.002g/ml。所述压片装置包括压片装置本体(1)，；所述压片装置本体(1)内腔底部设有压力传感器 (2)，所述压力传感器(2)与设置于压片装置本体(1)上的压力显示器(3)连通；所述压片装置本体(1)内腔设有活动板(4)，所述活动板(4)上设有活动手柄(5)；活动板由活动手柄控制，施加压力可控，玻片置于压片装置中被均匀施压。步骤(7)中，所述载玻片置于二甲苯中的时间为20min。所述步骤6)中，烘烤箱中的温度为60℃，烘烤时间为2h。
与当前现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明采用玻璃盖玻片代替塑料盖玻片，玻璃盖玻片硬度大，便于均匀施压，克服了现有技术中制备切片出现破裂和脱片的现象。盖玻片上均匀涂抹油状物质——凡士林，避免了切片和盖玻片粘附现象，保证了组织形态学完整性，且染色效果优于常规方法，特别是在免疫组织化学染色过程中，避免了组织脱片、破碎等导致的定位不准确或假阴性的出现。用二甲苯去除凡士林，防止凡士林影响后续实验结果。同时采用本发明建立的压片装置结构简单、使用方便、施加压力均匀可控，能够有效提高压片效率，保证组织切片展片质量。
总之，本发明通过一定温度热水展片、明胶包被玻片、凡士林处理盖玻片、新型压片装置等创新操作，直接解决了传统硬组织切片处理中展片效果差、切片皱缩、极易脱片、后续染色实验失败等常见问题。本发明所述组织病理切片展片方法操作简便、处理时间短、效果明显，可广泛应用于临床和基础科研中硬组织观察研究。
附图说明
图1为常规塑料盖玻片压片效果与本发明方法处理玻璃盖玻片压片效果对比图，A为常规塑料盖玻片压片效果代表图，B为本发明方法处理玻璃盖玻片压片代表图；
图2为压片装置示意图；
图3为压片展片后染色图，A列为常规切片展片方法小鼠膝关节硬切片HE染色代表图，B 列为本发明切片展片方法小鼠膝关节硬切片HE染色代表图。
图4为压片展片后染色图，A列为常规切片展片方法小鼠膝关节硬切片Von Kossa染色代表图，B列为本发明切片展片方法小鼠膝关节硬切片Von Kossa染色代表图。
图中：1、压片装置本体；2、压力传感器；3、压力显示器；4、活动板；5、活动手柄。
具体实施方式
实施例1
1)取材固定：取小鼠膝关节，小心剔去周围附着组织，置于适量4％多聚甲醛中固定24h (股骨、胫骨呈90-120°角)；
2)冲水：将固定后的关节组织置于流水中冲洗10分钟，PBS浸泡10分钟，洗去固定液后，用吸水纸吸去膝关节组织周围多余液体；
3)脱水透明：将冲水后的膝关节组织依次置于30％、50％、70％、80％、95％Ⅰ、95％Ⅱ、100％Ⅰ、100％Ⅱ酒精中进行梯度脱水，每道酒精24小时；依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中进行组织透明，每道二甲苯12小时；
4)渗透：将透明后的膝关节组织依次置于渗透液Ⅰ(甲基丙烯酸甲酯/邻苯二甲酸二丁酯体积比为2:1)、渗透液Ⅱ(甲基丙烯酸甲酯/邻苯二甲酸二丁酯体积比为2:1，内含2％过氧化苯甲酰)、渗透液III(甲基丙烯酸甲酯/邻苯二甲酸二丁酯体积比为2:1，内含4％过氧化苯甲酰)中进行渗透包埋，每道渗透液24小时，同时置于真空干燥器内抽真空；
5)包埋聚合：将渗透后的膝关节组织置于玻璃包埋瓶中，加入适量新鲜渗透液III，抽真空2小时后置于37℃水浴锅中聚合2-3天；
6)切片：敲碎玻璃瓶，取出组织，砂轮机修块后，置于切片机(LEICA RM2255型，配钨钢刀)切片，每次切片前，硬切块表面小心均匀涂抹OCT包埋剂，以保证组织切片的完整性和连续性，切片厚度为4μm；
7)包被载玻片：将洁净载玻片置于铬矾明胶溶液中(明胶密度为0.005g/ml，硫酸铬钾密度为0.002g/ml)30分钟-1小时后移至60℃烘箱中烘干备用；
8)贴片：将切好的硬组织切片置于洁净的热水中(优选48℃)3-5秒，组织切片展开后，用铬矾明胶包被载玻片捞起硬组织切片；
9)压片展片：将玻璃盖玻片均匀涂抹凡士林，并置于粘附硬组织切片的载玻片上，将粘附组织的载玻片和盖玻片放置于压片装置中，均匀施加压力，连同压片装置放入60℃烘箱中烘烤2小时；
10)脱凡士林：取出压片烘烤后的玻片，移去涂抹凡士林的盖玻片，将粘附硬组织切片的载玻片依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中进行脱凡士林，每道二甲苯5分钟，晾干后进行后待用。
所述压片装置包括压片装置本体1，；所述压片装置本体1内腔底部设有压力传感器2，所述压力传感器2与设置于压片装置本体1上的压力显示器3连通；所述压片装置本体1内腔设有活动板4，所述活动板4上设有活动手柄5。
实施例2
1)脱塑：将脱凡士林后的硬组织载玻片依次置于2-甲氧基乙基乙酸酯Ⅰ、2-甲氧基乙基乙酸酯Ⅱ、2-甲氧基乙基乙酸酯III中进行组织脱塑，每道2-甲氧基乙基乙酸酯20分钟；
2)复水：将脱塑的硬组织载玻片依次置于丙酮Ⅰ、丙酮Ⅱ、去离子水Ⅰ、去离子水Ⅱ中进行组织复水，每道溶液5分钟；
3)染色：将晾干后的硬组织切片根据试剂盒操作流程进行HE、Von Kossa染色；
4)以附图4为例，a为经过新型压片展片方法处理的小鼠关节组织石蜡切片后进行HE染色，结果显示切片无任何褶皱，形态较为完整，各组织层次排列规律，色泽鲜明，细胞内部细微结构清晰，细胞核着色明显，骨纤维形态结构保留，软骨细胞排列有序，形态完整；
b为经过新型压片展片方法处理的小鼠关节组织石蜡切片后进行Von Koosa染色，结果显示切片无任何褶皱，形态较为完整，软骨下骨皮质和骨小梁均呈清晰可见的黑色，软骨及软组织呈淡粉色，细胞核呈红色，颜色鲜艳，且染色均匀，背景色较浅，软骨与软骨下骨界限明显。
所述压片装置包括压片装置本体1，；所述压片装置本体1内腔底部设有压力传感器2，所述压力传感器2与设置于压片装置本体1上的压力显示器3连通；所述压片装置本体1内腔设有活动板4，所述活动板4上设有活动手柄5。
对比实例
采用传统方法和新型方法对小鼠膝关节硬切片组织进行压片展片处理，通过对比分析，新型压片展片方法效果明显，后续染色显示组织形态完整、结构清晰；尤其是在玻璃盖玻片上均匀涂抹凡士林，有效避免了盖玻片粘片问题。同时设计和使用了新型压片装置，保证了硬组织切片压片的同时进行烤片，该新型压片装置结构简单，操作便捷，施加压力均匀，进一步保证了硬组织切片的平整性和完整性，避免了切片皱缩引起的染色不均，为后续染色观察分析奠定了基础。

Claims (8)

1.一种硬组织病理切片展片的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）取组织病理材料并固定，脱水透明后进行渗透和包埋处理，再用砂轮机修块，得硬切块；
2）将硬切块表面均匀涂抹OCT包埋剂后切片，得切好的硬组织切片；
3）将硬组织切片置于45—52℃热水中，使硬组织切片展开；
4）用明胶和硫酸铬钾包被的载玻片捞起展开的硬组织切片；
5）在玻璃盖玻片均匀涂抹凡士林后，将盖玻片置于粘附有硬组织切片的载玻片上；
6）将玻片置于压片装置中，均匀施加压力，于55—65℃烘箱中烘烤1.5—2.5h；
7）从烘箱中取出玻片，移去盖玻片，将载玻片于二甲苯中脱去凡士林，自然晾干后待用。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述硬组织包括骨组织、牙齿。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的热水温度为48℃，将硬组织切片置于热水中的时间为3—5s。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）所述明胶和硫酸铬包被的载玻片
中所用的明胶密度为0.005g/ml，所用的硫酸铬钾密度为0.002g/ml。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于： 所述压片装置包括压片装置本体（1），；所述压片装置本体（1）内腔底部设有压力传感器（2），所述压力传感器（2）与设置于压片装置本体（1）上的压力显示器（3）连通；所述压片装置本体（1）内腔设有活动板（4），所述活动板（4）上设有活动手柄（5）。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（7）中，所述载玻片置于二甲苯中的时间为20min。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤6）中，烘烤箱中的温度为60℃，烘烤时间为2h。
8.一种用于权利要求1至7任一项所述方法的压片装置，其特征在于，所述压片装置包括压片装置本体（1），；所述压片装置本体（1）内腔底部设有压力传感器（2），所述压力传感器（2）与设置于压片装置本体（1）上的压力显示器（3）连通；所述压片装置本体（1）内腔设有活动板（4），所述活动板（4）上设有活动旋柄（5）。
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