CN114942169B

CN114942169B - 一种小鼠完整骨关节病理切片的制作方法

Info

Publication number: CN114942169B
Application number: CN202210622488.6A
Authority: CN
Inventors: 王竹; 陈洁; 田昆; 韩佳杞; 李稳; 吴蕾; 胡靖睿; 杨陈果; 杨陈实; 陈琳瑶
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-06-02
Filing date: 2022-06-02
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-06-02
Also published as: CN114942169A

Abstract

本发明涉及一种动物完整骨关节病理切片的制作方法，包括以下步骤：完整切取动物关节，放入中性甲醛溶液固定48小时，流水冲洗，仔细剔除修剪多余皮肤及肌肉组织，暴露完整关节结构。放入甲酸脱钙液中脱钙3天，完成后流水冲洗10分钟；用手术缝合线顺应膝关节、踝关节和指关节的弯曲面捆扎固定暴露关节面，制作塑料隔压板将骨关节面侧放置于隔压板下面，放入塑料盒中乙醇梯度脱水；用二甲苯透明；进行三次浸蜡处理，然后进行石蜡包埋；切片得到连续的骨关节病理切片。本发明方法采用甲酸溶液脱钙处理，捆扎及隔压板使骨关节组织，切片得到完整清晰关节面显微结构，可以与小动物microMT仪结合充分展示骨关节三维立体结构，科研教学价值重大。

Description

一种小鼠完整骨关节病理切片的制作方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，特别是一种病理切片的制作方法，具体而言本发明是关于动物完整骨关节病理切片的制作方法。

背景技术

动物组织病理切片是指动物组织经过加工预处理后，进行切片制成的用于科研或教学演示的组织切片。不同的动物组织结构成分不同，制作得到切片展示动物组织不同结构特性。如骨关节，是由相邻骨和其间的结缔组织构成的囊相连而成的，骨关节相对骨面之间有腔隙，腔隙是骨关节的活动空间，某些骨关节还有韧带、关节盘和半月板等辅助结构。在制作骨关节病理切片的时候，由于骨关节各个组件结构强度差异，导致骨关节切片稳定性控制较为困难。

现有技术制备骨关节病理切片的时候，通常会根据骨关节各个组件的结构强度差异进行拆分，分别进行切片制作。如此获得的骨关节病理切片虽然能够较好的保证骨关节切片稳定性，实现稳定的病理切片制作，但是骨关节的各个部位相互连接关系表现受到极大限制。如果是用于科研/教学，则这些骨关节病理切片的直观性大幅度降低，学习者需要花费更多时间来理解骨关节的空间立体构造。

此外，骨关节分块切片制作得到病理切片往往会剔除关节囊、软骨组织、多余的皮下组织等附件结构，进一步限制了科研/教学过程中，学习人员对于真实的组织结构的充分理解。骨关节医学院教学工作中，学生能否充分理解骨关节真实空间立体结构，对于学生后续开展临床工作至关重要。

在骨关节疾病的诊断中，大多是依靠CT、磁共振等影像学检查，如能结合完整的病理切片技术，便能从宏观及微观不同方面进行更好的统一，更好的用于临床诊断中。

综上所述，骨关节组织病理切片制作过程中，如何获得高质量病理切片是临床医学教学/科研中难题。现有分体式切片制作方法，难以实现完整骨关节组织立体展示，严重限制了教学和科研的技术发展。

发明内容

本发明目的在于：针对现有技术存在的骨关节病理切片制作过程难以实现真实还原的问题，提供一种动物完整骨关节病理切片制作方法，此外，可以与小动物microMT仪结合充分展示骨关节三维立体结构，科研教学价值重大。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种动物完整骨关节病理切片的制作方法，包括以下步骤：

S1取材：完整切取动物关节，取材时保留动物关节的皮肤及肌肉组织。

S2固定及选材：将动物关节放入10％中性甲醛溶液中固定48小时，流水冲洗10分钟，剔除修剪包裹骨关节的大量皮肤及肌肉组织，暴露完整关节面。

S3脱钙、脱水、透明：

301.脱钙：采用9-12v％甲酸作为脱钙液，将动物关节放入脱钙液中，脱钙3-4天，每20-26小时更换一次脱钙液；优选脱钙3天，每24小时更换一次脱钙液；更换脱钙液以后，以手持大头针能够刺入骨组织为脱钙完成，脱钙完成后，取出动物关节，冲洗干净；优选地，采用流水冲洗至少10分钟，以确保冲洗干净；

302.脱水：用手术缝合线顺应膝关节、踝关节和指关节的弯曲面捆扎固定暴露关节面，制作塑料隔压板，将确定的骨关节面侧放卡位于隔压板下面；

然后，放入取材塑料盒中，将动物关节进行梯度乙醇脱水处理；

303.透明：采用二甲苯进行透明处理；

S4浸蜡与包埋：进行三次浸蜡处理，蜡温62-65℃，然后进行石蜡包埋，包埋过程中控制蜡温65℃；

S5切片与贴片，采用轮转式石蜡切片机进行切片，得到连续的骨关节病理切片。

本发明动物完整骨关节病理切片的制作方法，直接将动物关节保留皮肤和肌肉组织进行整体取材处理，并将动物关节完整进行固定，保留动物关节完整皮肤及肌肉组织进行固定可以最大程度的包裹并保护关节组织的完整性。通过甲酸脱钙处理软化高硬度的骨头部分，结合大头针测试确保骨关节完全脱钙，使用特殊捆扎方法能够最大程度上暴露关节结构，配合塑料隔压板固定可以防止关节组织的错位移动以及挤压变形，脱水后可以更好的显示骨关节的完整结构，便于后续切片连续性和稳定性。

进一步，步骤S5中，在得到连续的骨关节完整而清晰的切片后，结合小动物microMT仪结合充分展示骨关节三维立体结构。通过本发明方法得到完整清晰的所有关节面显微结构，可以与小动物microMT仪结合充分展示骨关节三维立体结构，科研教学价值重大。

在步骤302中通过，骨关节面侧放卡位于隔压板下面，防止关节组织错位移动，同时也避免关节面挤压变形破裂

本发明病理切片制作方法可以将骨关节的关节面、关节囊、软骨、韧带及部分软组织结构等完整的保存下来，不同于传统制作病理切片时仅保留骨骼组织的做法，能够获得清晰的完整地展示组织结构的切片。特别是脱钙处理速度较快，甲酸对于骨关节组织破坏较小，脱钙处理过程不会损坏或改变关节面、软骨组织及结缔组织结构，能够更真实的反映骨关节病理切片的完整形貌，切片得到完整清晰的所有关节面的显微结构，可以与小动物microMT仪结合充分展示骨关节三维立体结构，提升教学及科研的效果。

进一步，步骤S1中，切取动物关节以后，用冲洗干净。动物关节切下来以后，无需去除皮肤、神经、血管及肌肉组织，用生理盐水充分冲洗干净，目的是为了包裹并保护骨关节结构的完整性。

优选地，完整切取动物关节，保留动物关节的皮肤及肌肉组织，目的是为了包裹骨关节，最大程度保证骨关节的完整性。优选地，切取动物关节的时候，保留皮肤、皮下组织、软骨、骨头和关节囊。骨关节组织完整保存，能够更好的包裹关节结构，使其在后续的流程中更好的得到关节的完整组织结构。如采用老鼠作为实验动物，把老鼠的踝关节、膝关节做一个完整的关节结构的病理切片。

进一步，步骤S2中，将组织使用甲醛固定后，修剪去除除骨关节之外的多余皮肤及肌肉组织。优选地，步骤S2中，将老鼠的踝关节、膝关节放入10v％中性甲醛溶液中固定48小时，流水冲洗30分钟，仔细剔除修剪骨关节之外的多余皮肤及肌肉组织，暴露完整关节面。

进一步，步骤S3中，更换脱钙液的同时用大头针测试，以手持大头针能够刺入骨组织为脱钙完成。优选地，当单手持大头针能够刺入骨组织的时候，脱钙完成。更具体的来说，当大头针能刺入骨组织无较大阻力时，脱钙完成。

进一步，步骤S3中，脱钙液优选为9-11v％甲酸，需使用超纯水临用前配制；更换脱钙液的同时用大头针测试，以手持大头针能够刺入骨组织为脱钙完成。

优选地，脱钙液选用10v％甲酸溶液。通过选择适宜浓度甲酸进行脱钙处理，可以很好地将骨关节中硬度较高的骨头进行脱钙，使之能够合并骨关节其他部分一起进行切片加工，进而获得完整骨关节切片。

优选地，脱钙3-4天，每20-26小时更换一次脱钙液。

优选地，根据动物关节(即骨关节组织)具体脱钙情况，调整脱钙时间，由于不同大小的组织脱钙时间不同，利用大头针进行检测，可以更加精确地控制脱钙处理时间和脱钙效果。相比于传统脱钙液，使用约10v％甲酸脱钙处理，时间可以短一些，并且不损害组织，不会改变组织结构，组织结构清晰，切片完整。

另外，甲酸脱钙处理可以克服现有脱钙试剂脱钙能力有限，必须破坏骨关节才能将骨头进行充分脱钙的限制。

优选地，步骤S3中，流水冲洗1-2h，确保冲洗干净。脱钙完成后，冲洗充分除去甲酸，利用流水将残留在组织及肌肉中的甲酸去除。同时，冲洗也可以将脱钙转移至组织中的钙离子充分去除，避免甲酸游离钙离子在组织或肌肉中不当沉积影响切片整体形貌表现。

优选地，步骤S3中，脱水前将动物关节用手术缝合线顺应膝关节、踝关节和指关节的弯曲面捆扎固定暴露关节面，制作塑料隔压板，将确定的骨关节面侧放置于隔压板下面，防止关节组织错位移动，同时也避免关节面挤压变形破裂，然后将动物关节进行后续的梯度脱水处理。

进一步，步骤301中，固定2-3h，优选地，固定2.5h。

进一步，步骤302中，采用65-100v％乙醇进行梯度脱水处理。优选地，采用体积浓度70-100v％乙醇进行梯度乙醇脱水。更优选地，梯度乙醇脱水程序如下：65％乙醇2h，75％乙醇2h，85％乙醇脱水2h，95％乙醇I脱水2h、95％乙醇Ⅱ脱水16h、无水乙醇I脱水1h、无水乙醇Ⅱ脱水2h、无水乙醇III脱水2h。

优选地，步骤302中，用手术缝合线顺应膝关节和踝关节，指关节弯曲面捆扎固定暴露关节面，制作塑料隔压板，将确定的骨关节面侧放卡位于隔压板下面，防止关节组织错位移动，同时也避免关节面挤压变形破裂，放入取材塑料盒中，将动物关节用乙醇进行梯度脱水处理。

优选地，梯度乙醇脱水过程是以体积浓度5-10％为梯度，设置等差浓度来脱水。更优选地，乙醇梯度脱水程序如下：按照60％、70％、80％、90％、100％乙醇体积浓度进行梯度脱水。更优选，按照65％、75％、85％、95％、100％乙醇体积浓度进行梯度脱水，更容易做到脱水完全以及充分。

进一步，步骤303中，优选地，将动物关节用二甲苯透明处理三次，每次20min。

进一步，步骤S4中进行三次浸蜡处理，蜡温62-65℃，浸蜡处理完成后，用65℃的石蜡包埋，包埋好以后，即可修整、切片，或者保存于4℃冰箱中。

进一步，步骤S5中，优选地，在LEICARM2245轮转式石蜡切片机上，调整切片刀平面与组织切面间呈5°左右的夹角，连续切3～5μm厚的切片，优选为4μm厚的切片。切片刀要锋利，最好用一次性刀片。优选地，切片刀与组织切面之间夹角3-7°，也可以进一步选择4-6°范围。

骨关节切片过程中，采用锋利的一次性刀片进行切片，能够更好地连同骨头和软骨、韧带及软组织实现一次性高效切片，获得高品质的综合切片产物。优选地，采用全新刀片进行切片。

进一步，所述方法还包括S6：切片后处理。

优选地，所述切片后处理包括：切片完成后，将切片投入到40℃的温水浴中。鸡蛋清与甘油比例为1：1配制蛋白甘油，均匀滴在载玻片，20ul每张，后均匀涂抹一层。切片自然展平后，用涂抹了蛋白甘油的载玻片倾斜着插入水面捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，将切片置62-65℃烤箱内烤2-3h，然后进行脱蜡、复水和HE染色。苏木精浸染5min→水洗去浮色→体积分数为0.5％盐酸酒精分色→温水(40℃)碱化10min→浸染伊红乙醇5min→体积分数为75％乙醇1min→体积分数为85％乙醇1min→体积分数为95％乙醇1min→体积分数为100％乙醇1min→体积分数为100％乙醇1min分色→二甲苯5min→二甲苯5min进行透明，然后用中性快干胶封片，最后用光镜观察。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明动物完整骨关节病理切片制作方法，切取动物关节的时候确保关节组织得到完整保存，取材保留了骨关节的皮肤、肌肉、结缔组织等。在制备切片的时候，得到关节全部组织结构，学生或研究人员观察切片可以更容易思考理解关节整体三维立体结构形貌。

2、本发明病理切片制作方法采用甲酸脱钙处理，结合大头针测试确保骨关节完全脱钙，获得容易进行连续切片的关节组织，具有脱钙效率高，脱钙速度快，对于关节组织整体组织结构形貌破坏小。

3、本发明病理切片制作方法，动物关节骨质脱钙充分，关节附带的软骨、结缔组织等充分变性，具有一定强度，最终切片得到病理切片具有良好的连续性和稳定性。

4、本发明病理切片制作方法，在脱水前采用特殊的捆扎方法结合特殊的塑料隔板固定，将关节组织充分地固定并充分暴露关节结构，最终得到的病理切片组织具有良好的完整性。

5、本发明骨关节整体病理切片方法对于骨关节整体进行染色，结合完整清晰的所有关节面的显微结构，同时与小动物microMT仪结合充分展示骨关节宏观及微观的三维立体结构，科研教学价值重大。

附图说明：

图1是处死小鼠并固定摆位，准备取材。

图2是正确摘取组织并测量大小。

图3是将动物关节完整置于中性甲醛溶液中固定0小时(左A)和48小时(右B)。

图4是使用脱钙液将关节组织脱钙处理72小时。

图5是剔除修剪骨关节之外的多余皮肤及肌肉组织后，将关节组织捆扎固定，制作塑料隔压板，防止关节组织错位移动，用梯度乙醇脱水透明。

图6是将关节组织浸蜡后包埋。

图7是指关节面的全关节面HE制片照片。

图8是踝关节面的全关节面HE制片照片。

图9是膝关节面的全关节面HE制片照片。

图10是对照组关节组织切片HE制片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下动物实验均经过医学伦理学会批准，试验中使用的乙醇浓度均为体积百分比浓度。

实施例1

动物完整骨关节病理切片

如图1至图3所示，处死小鼠，固定摆位，切取小鼠后腿关节组织，无需去除皮肤、神经、血管及肌肉组织，保留完整的小鼠后腿，将其用生理盐水充分冲洗干净。首先，用10％中性甲醛固定48h，流水冲洗10分钟。

如图4所示，仔细剔除修剪骨关节之外的多余皮肤及肌肉组织后，暴露完整关节组织。将小鼠后腿放入10v％甲酸中进行脱钙，脱钙3天，每天换液并用大头针测试，以大头针能轻易刺入骨组织为完成脱钙标准。

如图5所示，用手术缝合线顺应膝关节、踝关节和指关节的弯曲面捆扎固定暴露关节面，制作塑料隔压板，将确定的骨关节面侧放卡位于隔压板下面；然后，放入取材塑料盒中，将动物关节进行梯度乙醇脱水处理。

如图6所示，将关节组织进行三次浸蜡处理，蜡温62-65℃，然后进行石蜡包埋(蜡温65℃)。即可进行修整、切片，亦可保存于4℃冰箱内。

最后，进行切片与贴片。在LEICARM2245轮转式石蜡切片机上，用全新一次性刀片，调整切片刀平面与组织切面间呈5°左右的夹角，连续切4μm厚的切片。

切片过程顺畅，无卡顿，切片整体厚度均匀性好。所得小鼠后腿骨关节组织切片清晰完整，可观察性优良。

实施例2

动物完整骨关节病理切片的制作

将实施例1得到的小鼠骨关节病理切片进行切片后处理，具体方法如下：切片完成后，将切片投入到40℃温水浴中，切片自然展平后，用载玻片倾斜着插入水面捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，将切片置62-65℃烤箱内烤2h，然后进行脱蜡、复水和HE染色。具体如下：苏木精浸染5min→水洗去浮色→体积分数为0.5％盐酸酒精分色→温水(40℃)碱化10min→浸染伊红乙醇5min→体积分数为75％乙醇1min→体积分数为85％乙醇1min→体积分数为95％乙醇1min→体积分数为100％乙醇1min→体积分数为100％乙醇1min分色→二甲苯5min→二甲苯5min进行透明，然后用中性快干胶封片，最后用光镜观察。

经过染色处理，得到切片品质优良，组织结构清晰完整，能够充分展示小鼠后腿骨关节组织的整体结构形貌。其中，指关节面的全关节面HE制片、踝关节面的全关节面HE制片、膝关节面的全关节面HE制片分别如图7、图8和图9所示。

对比例2

小鼠后腿骨关节病理切片的制作

和实施例1相同的方法进行小鼠骨关节组织病理切片制作，区别仅在于：脱钙后不对关节进行捆扎。然后按照实施例1相同的方法进行后续梯度乙醇脱水处理，缺少骨关节的固定等，且关节没有很好的暴露。后续参考实施例1的方案进行脱水、透明处理，浸蜡与包埋处理，并最终切片与贴片。

切片制得4μm厚切片，整体切片效果欠佳。切片结果如图10所示，由于缺少对骨关节的固定，切片完整性较差，且由于未捆扎不能够很好的暴露关节，仅能显示关节的部分骨骼部分，不能够很好的展示关节的完整结构(关节面、关节腔、关节囊)以及附着的肌肉、韧带、皮肤等组织的相互关系。

实施例3

动物完整骨关节病理切片的制作

经过医学伦理学会批准，进行动物实验。处死小鼠，切取小鼠动物关节，无需去除皮肤、神经、血管及肌肉组织，保留完整的小鼠后腿，将其用生理盐水充分冲洗干净。然后，进行固定：用10％中性甲醛固定48h，流水冲洗10分钟，仔细剔除修剪骨关节之外的多余皮肤及肌肉组织，暴露完整关节结构。

然后进行脱钙、脱水、透明处理。具体操作方法如下：首先，将动物关节放入配制好的10％的甲酸脱钙液中，脱钙3天，以手持大头针能够刺入骨组织为脱钙完成，脱钙完成后，流水冲洗10分钟；然后，用手术缝合线顺应膝关节、踝关节和指关节的弯曲面捆扎固定暴露关节面，制作塑料隔压板，将确定的骨关节面侧放置于隔压板下面，防止关节组织错位移动，同时也避免关节面挤压变形破裂，放入取材塑料盒中，采用梯度乙醇法进行脱水，具体脱水程序如下：65％乙醇2h，75％乙醇2h，85％乙醇脱水2h，95％乙醇I脱水2h、95％乙醇Ⅱ脱水16h、无水乙醇I脱水1h、无水乙醇Ⅱ脱水2h、无水乙醇III脱水2h。最后用二甲苯进行透明处理。

然后，进行三次浸蜡处理，蜡温62-65℃，然后进行石蜡包埋(蜡温65℃)。包埋完成后即可进行修整、切片，亦可保存于4℃冰箱内。

最后，进行切片与贴片。在LEICARM2245轮转式石蜡切片机上，调整切片刀平面与组织切面间呈5°左右夹角，连续切4μm厚的切片。切片刀要锋利，最好用全新的一次性刀片。

参考实施例1并按照相同方法进行小鼠后腿骨关节病理切片制作，在切片完成后进行后处理。具体而言，后处理包括：将切片投入到40℃温水浴中，切片自然展平后，用载玻片倾斜着插入水面捞取切片，使切片贴附在载玻片合适位置，将切片置62-65℃烤箱内烤2h，然后进行脱蜡、复水和HE染色。

其中，HE染色方法如下：苏木精浸染5min→水洗去浮色→体积分数为0.5％盐酸酒精分色→温水(40℃)碱化10min→浸染伊红乙醇5min→体积分数为75％乙醇1min→体积分数为85％乙醇1min→体积分数为95％乙醇1min→体积分数为100％乙醇1min→体积分数为100％乙醇1min分色→二甲苯5min→二甲苯5min进行透明，然后用中性树胶封片，最后用光镜观察。

制备得到的小鼠后腿关节病理切片清晰完整，所得病理切片具有关节结构保留完整的特点，所有骨关节附件组织显示清楚，能够满足病理诊断及实验教学、科研需求，可以与小动物microMT仪结合充分展示骨关节宏观及微观的三维立体结构，科研教学价值重大。

实施例4-9

动物完整骨关节病理切片的制作

和实施例3相同的方法进行小鼠骨关节组织病理切片制作，区别仅在于使用的脱钙液为6％-17％甲酸溶液。完整切取多个小鼠后腿骨关节组织，保留关节的皮肤和肌肉组织，将小鼠后腿骨关节清洗干净及固定完成后，分别置于各个浓度甲酸溶液中进行脱钙。根据甲酸溶液脱钙情况进行甲酸溶液更换，记录不同浓度甲酸溶液脱钙作用强度，比较脱钙效率以及脱钙完成后骨关节进行切片制作的差异。

表1不同浓度甲酸溶液对于小鼠骨关节脱钙处理差异

实施例

甲酸浓度

更换间隔

更换次数

脱钙效率

针刺效果

组织完整性

4

6％

24h

3

低

欠佳

优

5

7％

24h

3

较低

欠佳

优

6

9％

24h

3

一般

优

7

12％

24h

3

较高

好

优

8

15％

24h

2

高

好

良好

9

17％

24h

2

高

好

腐蚀较为严重*

*注：实施例9的骨关节组织腐蚀较为严重，操作时需要谨慎操作，部分表皮出现轻微破坏

结合脱钙效果判断，采用针刺方法验证脱钙效果，脱钙程度，总共脱钙时间约3-4天为宜；且甲酸浓度应大于9％为宜。切片制作完成后，发现较甲酸浓度大于15％的试验组，所得小鼠骨关节组织皮肤、肌肉等存在一定腐蚀破坏，所以选择9％-12％甲酸浓度更有利于完整骨关节病理切片的制作。

不同的浓度的甲酸溶液进行脱钙处理，发现当甲酸溶液浓度较低的时候，对于小鼠后腿完整骨关节的脱钙存在脱钙效率较低问题，不利于缩短制作时间。如果甲酸溶液浓度过高，则会导致组织结构完整性欠佳。所以，综合权衡脱钙效率和小鼠后腿骨关节可后处理的组织状态，选择9％-12％浓度的甲酸溶液进行脱钙是较为有利的，且脱钙的时间与组织大小有关，较大的组织相应脱钙时间延长。

实施例10

动物完整骨关节病理切片的制作

采用和实施例3相同的方法进行小鼠骨关节组织病理切片制作，区别仅在于：处死小鼠，切取小鼠动物关节，无需去除皮肤、神经、血管及肌肉组织，保留完整的小鼠后腿，将其用生理盐水充分冲洗干净。然后，将小鼠后腿放入包埋盒中，未进行捆扎，连同包埋盒一起放入10v％甲酸中进行脱钙。后续脱钙时间、检查方法均与实施例3相同。脱钙完成后，按照实施例3相同的统一方法进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和贴片等工艺。

结果显示，由于小鼠后腿未经过捆扎固定，甲酸脱钙效率较低，脱钙时间增加1天。脱钙完成后，小数后腿骨关节组织腐蚀略微严重，后续处理操作余量更小。最终，切片时发现小数后腿骨关节骨头脱钙均匀性不佳，切片过程存在少量卡顿，切面的一致性不是很好。

实施例11

动物完整骨关节病理切片的制作

和实施例3相同的方法进行小鼠骨关节组织病理切片制作，区别仅在于：脱钙完成以后，清水冲洗1分钟，即进行后续处理。结果发现，甲酸溶液残留在小鼠后腿骨关节组织中，进而在脱水的时候，部分残留甲酸未充分去除，导致乙醇脱水欠佳影响最终的染色和结果。故甲酸脱钙处理完成以后，需要冲洗至少2小时，确保将甲酸溶液完全冲洗清除干净。

实施例12

动物完整骨关节病理切片的制作

经过医学伦理学会批准，进行动物实验。处死小鼠，切取小鼠动物关节，无需去除皮肤、神经、血管及肌肉组织，保留完整的小鼠后腿，将其用生理盐水充分冲洗干净后进行固定。然后，修剪多余的皮肤及组织后，将小鼠后腿放入11％甲酸中进行脱钙，每隔24小时更换甲酸溶液，连续脱钙3天，每次更换脱钙液以后用大头针测试脱钙状况。以大头针能轻易刺入骨组织为完成脱钙标准，脱钙完成后，流水冲洗2h。

然后，进行脱水、透明处理。具体操作方法如下：首先，采用梯度乙醇进行脱水，具体脱水程序如下：65％乙醇2h，75％乙醇2h，85％乙醇脱水2h，95％乙醇I脱水2h、95％乙醇Ⅱ脱水16h、无水乙醇I脱水1h、无水乙醇Ⅱ脱水2h、无水乙醇III脱水2h。然后，进行透明处理：采用二甲苯重复透明处理三次，每次20min。

然后，进行浸蜡与包埋处理；石蜡包埋完成后，置于4℃冰箱冷藏过夜。然后采用LEICARM2245轮转式石蜡切片机上，用全新一次性刀片，调整切片刀平面与组织切面间呈5°左右夹角，连续切3μm厚的切片。

得到的切片投入到40℃温水浴中，切片自然展平后，用载玻片倾斜着插入水面捞取切片，使切片贴附在载玻片合适位置，将切片置62-65℃烤箱内烤2h，然后进行脱蜡、复水和HE染色。

制备得到小鼠后腿骨关节完整病理切片，切片显示结构完整且清晰；切片的连续性较好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种小鼠完整骨关节病理切片的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1 取材：完整切取小鼠关节，取材时保留小鼠关节的皮肤及肌肉组织；

S2 固定及选材：将小鼠关节放入10%中性甲醛溶液中固定48小时，流水冲洗10分钟，剔除修剪包裹骨关节的大量皮肤及肌肉组织，暴露完整关节面；

S3 脱钙、脱水、透明：

301.脱钙：采用9-12v%甲酸作为脱钙液，将小鼠关节放入脱钙液中，脱钙3-4天，每20-26小时更换一次脱钙液；更换脱钙液以后，以手持大头针能够刺入骨组织为脱钙完成；脱钙完成后，取出小鼠关节，冲洗干净；

然后，放入取材塑料盒中，将小鼠关节进行梯度乙醇脱水处理；

303.透明：采用二甲苯进行透明处理；

S4 浸蜡与包埋：进行三次浸蜡处理，蜡温62-65℃，然后进行石蜡包埋，包埋过程中控制蜡温65℃；

S5 切片与贴片，采用轮转式石蜡切片机进行切片，得到连续的骨关节病理切片。

2.根据权利要求1所述小鼠完整骨关节病理切片的制作方法，其特征在于，步骤301中，脱钙3天，每24小时更换一次脱钙液。

3.根据权利要求1所述小鼠完整骨关节病理切片的制作方法，其特征在于，步骤302中，采用65-100v%乙醇进行梯度乙醇脱水处理。

4.根据权利要求3所述小鼠完整骨关节病理切片的制作方法，其特征在于，梯度乙醇脱水过程是以体积浓度5-10%为梯度，设置等差浓度来脱水。

5.根据权利要求3所述小鼠完整骨关节病理切片的制作方法，其特征在于，步骤302中，梯度乙醇脱水程序如下：65%乙醇2h，75%乙醇2h，85％乙醇脱水2h，95％乙醇I脱水2h、95％乙醇Ⅱ脱水16h、无水乙醇I脱水1h、无水乙醇Ⅱ脱水2h、无水乙醇III脱水2h。

6.根据权利要求1所述小鼠完整骨关节病理切片的制作方法，其特征在于，步骤S2中，将组织使用甲醛固定后，修剪去除除骨关节之外的多余皮肤及肌肉组织。

7.根据权利要求1所述小鼠完整骨关节病理切片的制作方法，其特征在于，步骤S3中，脱钙液为9-11%甲酸，需使用超纯水临用前配制；更换脱钙液的同时用大头针测试，以手持大头针能够刺入骨组织为脱钙完成。

8.根据权利要求1所述小鼠完整骨关节病理切片的制作方法，其特征在于，S3的302中，用手术缝合线顺应膝关节和踝关节，指关节弯曲面捆扎固定暴露关节面，制作塑料隔压板，将确定的骨关节面侧放卡位于隔压板下面，防止关节组织错位移动，同时也避免关节面挤压变形破裂；然后放入取材塑料盒中，将小鼠关节进行梯度乙醇脱水处理。

9.根据权利要求1所述小鼠完整骨关节病理切片的制作方法，其特征在于，步骤S5中，在LEICA RM2245轮转式石蜡切片机上，调整切片刀平面与组织切面间呈5°的夹角，连续切3~5μm厚的切片。

10.根据权利要求9所述小鼠完整骨关节病理切片的制作方法，其特征在于，采用锋利的一次性刀片进行切片。

11.根据权利要求1所述小鼠完整骨关节病理切片的制作方法，其特征在于，步骤S5中，在得到连续的骨关节完整而清晰的切片后，结合小动物microMT仪结合充分展示骨关节三维立体结构。